王雨豪，葉成坤，劉衛(wèi)勇

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽 合肥 230001；3. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，安徽 合肥 230001)

前列腺癌目前位于全球男性惡性腫瘤發(fā)病率第二位[1]。在中國腫瘤登記地區(qū)中，前列腺癌是中國男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見惡性腫瘤之一[2]。據(jù)2020年全球癌癥估計(jì)，男性前列腺癌發(fā)病率將高于肺癌，上升為第一位[3]。當(dāng)前，前列腺癌已經(jīng)成為嚴(yán)重影響男性生命健康的腫瘤之一。前列腺癌動物模型是研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展不可或缺的重要工具，目前常用的有皮下移植模型和原位移植模型兩種類型[4]。由于原位移植模型能更準(zhǔn)確地模擬人類前列腺癌的自然發(fā)展過程，因而更常用于實(shí)驗(yàn)研究[5]。然而原位移植模型中，裸鼠前列腺體積小、解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對操作者要求較高。PC-3、DU-145及LNCaP細(xì)胞是研究前列腺癌最常用的3種人類前列腺癌細(xì)胞，LNCaP細(xì)胞作為高表達(dá)雄激素受體(androgen receptor，AR)的細(xì)胞，常用于前列腺癌動物模型的構(gòu)建，但成瘤率相對較低。因此，建立Balb/c裸鼠LNCaP細(xì)胞前列腺癌原位移植模型相對較困難。此外，原位腫瘤內(nèi)血管生成與腫瘤侵襲性密切相關(guān)[6]。超聲作為一種無創(chuàng)檢查工具而被廣泛用于觀察腫瘤發(fā)生及相關(guān)血管分布情況，超聲造影(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)可對腫瘤微循環(huán)灌注進(jìn)一步評估。本研究通過注射LNCaP細(xì)胞懸液構(gòu)建前列腺癌原位移植模型，并采用超聲對腫瘤模型中的血管分布進(jìn)行監(jiān)測，同時對腫瘤進(jìn)行血管相關(guān)標(biāo)志物分析、病理學(xué)檢查，分析超聲造影相關(guān)參數(shù)到達(dá)時間(arrival time，Atm)、到達(dá)峰值時間(time to peak，TtoPk)、造影曲線下面積(area under the curve，AuC)與腫瘤內(nèi)血管生成之間的相關(guān)性，旨在為前列腺癌動物模型建立中血管分布及腫瘤侵襲提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 LNCaP細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，用體積配比為RPMI 1640培養(yǎng)基(90%+10%胎牛血清+雙抗)進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)使用的動物為5周齡Balb/c雄性裸鼠，體重(16±0.5) g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號為：20170005051694，動物級別為無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級實(shí)驗(yàn)動物，飼養(yǎng)于中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，SPF條件下超凈層流架內(nèi)飼料及飲水自由攝入，在術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，基質(zhì)膠購自美國Corning BD biocoat公司，血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)抗體、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)抗體及AR抗體均購自美國Abcam公司，本研究已通過中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批文書批號為：2021-N(A)-76。

1.2方法

1.2.1Balb/c裸鼠LNCaP細(xì)胞前列腺癌原位移植模型的建立 ①雄性Balb/c裸鼠用1%的戊巴比妥鈉(10 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉；②將麻醉好的裸鼠固定，用75%的酒精消毒下腹部皮膚，在下腹腹正中線處用外科手術(shù)剪切開腹膜后，打開裸鼠腹腔；緩慢推開大網(wǎng)膜及腸管后，可見淡黃色、球形膀胱，先使膀胱顯露出來；向膀胱頸部兩側(cè)繼續(xù)探查，可見一側(cè)白色牛角形精囊腺，將精囊腺擠壓出腹壁之外，繼而探查對側(cè)精囊腺，并將對側(cè)精囊腺擠壓出腹壁之外；將雙側(cè)精囊腺及膀胱向尾側(cè)推壓，在精囊腺根部的背側(cè)、直腸前方可以發(fā)現(xiàn)粉紅色的前列腺背側(cè)葉，每側(cè)左右徑約1.4 mm；③取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞離心后，棄上清，加入500 μL無血清培養(yǎng)液，然后在冰上再加入500 μL基質(zhì)膠，混勻制成約1 mL(3×108/mL)的LNCaP細(xì)胞懸液，采用50 μL可更換針頭、30G的Hamilton微量進(jìn)液器，吸取20 μL的細(xì)胞懸液(細(xì)胞計(jì)數(shù)5×106個)進(jìn)行接種，輕輕將針頭插入前列腺背側(cè)葉包膜內(nèi)，將細(xì)胞懸液推入，可見前列腺包膜隆起、透明，液體無明顯外滲，退出針頭；將精囊腺返回腹膜，用5-0編織可吸收縫線分別縫合腹壁和皮膚層。傷口用70%乙醇消毒。術(shù)后觀察1 h，直至裸鼠完全蘇醒。

1.2.2超聲數(shù)據(jù)采集和分析 從構(gòu)建模型后的第15天開始，用超聲監(jiān)測腫瘤的生長情況，每5天測量1次，直至第50天。采用GE BOOK便攜式彩色超聲診斷儀，使用8L-RS型超聲探頭，頻率為5～20 MHz。首先超聲探頭涂抹適量預(yù)熱的耦合劑，將探頭置于裸鼠下腹壁，在裸鼠正中矢狀面進(jìn)行觀察，找到無回聲的膀胱后，輕微移動超聲探頭，在膀胱背側(cè)找到低回聲腫瘤結(jié)構(gòu)，待圖像穩(wěn)定后，保存腫瘤的圖像并測量腫瘤上下徑及前后徑然后輕微旋轉(zhuǎn)探頭至腫瘤橫斷面，測量腫瘤的左右徑。腫瘤體積計(jì)算公式為：腫瘤體積(mm3)=瘤體上下徑(mm)×前后徑(mm)×左右徑(mm)×0.52。

1.2.3CEUS檢查 構(gòu)建腫瘤模型后第50天，行CEUS檢查評價腫瘤內(nèi)血管灌注情況。首先采用灰階超聲對腫瘤進(jìn)行觀察并測量，然后用1 mL注射器給予裸鼠尾靜脈注射(100 μL)造影劑SonoVue(意大利Bracco公司，25 mg凍干粉5 mL 0.9%生理鹽水稀釋)。保存120 s生成的原始數(shù)據(jù)，并使用量化軟件(VueBox)對成像數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。人工勾畫一個感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，以在縱向平面上覆蓋整個腫瘤。根據(jù)單個ROI中的信號強(qiáng)度儀器自動生成時間強(qiáng)度曲線(time intensity curve，TIC)，測量并記錄造影劑Atm、TtoPk、AuC等超聲造影參數(shù)。

1.2.4病理學(xué)檢查 裸鼠行二氧化碳窒息死亡，打開腹腔，切除原位腫瘤，用10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μM連續(xù)切片。組織病理學(xué)檢查采用標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。免疫組化染色：切片在磷酸緩沖鹽溶液中冷卻并沖洗，在室溫下在封閉液中孵育至少30 min，并與CD31、VEGF-A、AR抗體在4 ℃下過夜孵育。切片與適當(dāng)?shù)亩壙股窖颉⒖剐∈竺庖咔虻鞍自谑覝叵路跤負(fù)u床30 min，顯色劑顯色3～15 min；蘇木精復(fù)染，脫水后中性樹膠封片。利用Image J軟件對免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行結(jié)果分析并計(jì)算出相應(yīng)的平均光密度值(average optical density，AOD)。

2 結(jié)果

2.1Balb/c裸鼠前列腺癌原位移植模型的建立及超聲監(jiān)測 術(shù)后24 h內(nèi)，21只裸鼠全部蘇醒，術(shù)后72 h觀察裸鼠健康狀態(tài)良好，2周后傷口愈合。如圖1所示，原位前列腺腫瘤在接種后的第15天開始檢測到，超聲顯示腫瘤位于膀胱后方，呈圓形均質(zhì)低回聲，邊界清晰，與周圍高回聲的盆壁組織容易區(qū)別。隨著腫瘤生長，腫瘤的回聲結(jié)構(gòu)、形狀和位置發(fā)生變化。接種第28天，可觀察到腫瘤突向膀胱。在隨后的時間內(nèi)，腫瘤由低回聲逐步發(fā)展為橢圓形等回聲結(jié)構(gòu)，并有將膀胱推進(jìn)腹腔前部的趨勢。接種第50天時，原位腫瘤成瘤率為71.43%(15/21)，平均體積為(288.81±76.49) mm3。見圖1。

A和B：接種第15天和第50天，腫瘤從膀胱后方的一個低回聲圓形結(jié)構(gòu)發(fā)展為

2.2CEUS檢查 如圖2所示，CEUS顯示腫瘤呈早增強(qiáng)及高增強(qiáng)，1 s腫瘤周邊開始增強(qiáng)，3 s腫瘤大部分區(qū)域增強(qiáng)，僅腫瘤中央少許未增強(qiáng)，10 s腫瘤完全增強(qiáng)，60 s腫瘤內(nèi)部造影劑開始消退，90 s腫瘤大部分區(qū)域造影劑已消退。TIC造影曲線分析顯示，平均Atm為(1.59±0.65) s，平均TtoPk為(11.59±3.68) s，平均AuC為(1933.91±454.38) dB。

A：原位前列腺腫瘤的CEUS圖，早期腫瘤邊緣比腫瘤組織內(nèi)部增強(qiáng)更快，邊緣呈環(huán)狀征，隨后逐漸減低；B：根據(jù)CEUS TIC曲線，繪制各個CEUS參數(shù)圖(n=15)。

2.3腫瘤的病理及免疫組化特征分析 如圖3所示，大體標(biāo)本觀察腫瘤呈橢圓形；腫瘤與周圍組織邊界清楚，局限于裸鼠單側(cè)的前列腺背側(cè)葉，圓形，棕黑色，有光澤而對側(cè)背葉保持完整。HE染色顯示腫瘤細(xì)胞體積較大，核大濃染，呈多形性，并有大量中性粒細(xì)胞浸潤；腫瘤的邊緣被較厚的纖維組織包裹。AR抗體染色結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞強(qiáng)陽性，AR定位于細(xì)胞核內(nèi)。如圖4A所示，使用CD31抗體與VEGF-A抗體對原位前列腺腫瘤進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示腫瘤內(nèi)部有豐富的毛細(xì)血管。如圖4B所示，利用Image J軟件對免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析得出CD31和VEGF-A抗體染色的AOD值為0.39 0.06、0.45 0.05，并分別計(jì)算其與TIC中Atm、Ttopk及AuC相關(guān)性，結(jié)果如表1所示，CD31和VEGF-A與Atm、Ttopk及AuC具有正相關(guān)(P<0.05)，提示CEUS可對腫瘤內(nèi)血管分布進(jìn)行無創(chuàng)檢查。

3 討論

為了建立接近于人前列腺癌體內(nèi)自然生長過程的動物模型，利用裸鼠進(jìn)行原位移植腫瘤模型的建立成為研究的熱點(diǎn)[7]，然而如何有效地建立前列腺癌裸鼠原位移植模型是模型建立的難點(diǎn)。一方面，由于不同品系的裸鼠前列腺形態(tài)上有所不同[8]，因此需要將不同裸鼠的前列腺加以區(qū)分。另一方面，由于裸鼠前列腺較小[9]，直徑為3 mm左右，對手術(shù)者的操作要求較高。既往研究多采用組織插塊法進(jìn)行前列腺癌原位移植模型的建立[10]，操作步驟是先將前列腺癌細(xì)胞接種至裸鼠皮下，6～8周形成皮下腫瘤后，再將瘤組織取出，切成1 mm3大小等體積組織塊后，將裸鼠前列腺包膜切開，然后將組織塊插入到裸鼠的前列腺內(nèi)。這些研究操作上相對簡單易行、成瘤率高，但存在一定的不足。一方面，由于腫瘤種植在皮下與原位的微環(huán)境不同，其腫瘤的基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)存在明顯差異[11]，從皮下生長到裸鼠的前列腺內(nèi)生長，腫瘤生長的微環(huán)境發(fā)生了較大的改變，腫瘤的基因會發(fā)生如甲基化等修飾，不能真實(shí)模擬人類前列腺癌的發(fā)生過程[12]。另一方面，組織插塊法需要對裸鼠前列腺包膜切開，部分腫瘤可能會生長于裸鼠前列腺包膜之外。相比而言，腫瘤細(xì)胞注射法可能較好地避免這些問題。

A：左側(cè)白色箭頭所示原位腫瘤位置，腫瘤呈棕黑色，右側(cè)白色三角箭頭示牛角形精囊腺；B：(×20)上方紅色三角箭頭示腫瘤內(nèi)見壞死區(qū)，下方紅色箭頭腫瘤邊緣被均勻的纖維細(xì)胞覆蓋；C：(×40)腫瘤細(xì)胞呈明顯的異型性，細(xì)胞核大小不一，伴中性粒細(xì)胞浸潤；D：(×40)人AR抗體免疫組化染色圖。

A：(×20)CD31和VEGF-A染色示意圖；B：CD31和VEGF-A染色的AOD與Atm、Ttopk及AuC的相關(guān)性分析。

表1 CD31和VEGF-A與Atm、Ttopk及AuC的相關(guān)性分析

LNCaP細(xì)胞裸鼠移植模型的成瘤率較低，LNCaP細(xì)胞皮下移植模型在加入促進(jìn)腫瘤生長的基質(zhì)膠后，成瘤率也僅為44%～67%[13]，而Balb/c裸鼠LNCaP細(xì)胞前列腺癌原位移植模型的成瘤率僅為60%[14-15]。本研究采用LNCaP細(xì)胞與基質(zhì)膠混勻制成細(xì)胞懸液注入Balb/c裸鼠前列腺內(nèi)，成瘤率達(dá)到71.43%，與以往研究結(jié)果相比腫瘤成瘤率有所提高。此外，裸鼠前列腺背葉與人類前列腺癌好發(fā)部位的周緣區(qū)相似[16]，因此，本研究將腫瘤細(xì)胞懸液精準(zhǔn)注入前列腺背葉內(nèi)，能更好地模擬人類前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程。

與皮下腫瘤可觸及、易測量相比，原位腫瘤的監(jiān)測是研究腫瘤生長的難題。以往研究多采用熒光生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像監(jiān)測腫瘤生長。然而，該檢查方法較昂貴、費(fèi)時，且原位腫瘤相對于皮下腫瘤位置較深，熒光成像的空間分辨率會隨著組織厚度的增加而顯著降低，不利于腫瘤顯示。超聲因具有便捷、無輻射、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崟r監(jiān)測原位前列腺腫瘤生長情況。本研究采用超聲監(jiān)測腫瘤生長，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞接種后第50天時，原位前列腺腫瘤體積為(288.81±76.49) mm3。既往研究表明，LNCaP細(xì)胞皮下移植腫瘤模型在腫瘤細(xì)胞接種后第56天時，腫瘤體積為(234.94±101.99) mm3[17]。本研究中原位腫瘤的體積大于皮下移植腫瘤體積，表明LNCaP細(xì)胞更適合于含有雄激素的裸鼠前列腺微環(huán)境內(nèi)生長。

由于腫瘤血管生成與前列腺癌進(jìn)展呈密切相關(guān)[18]，CEUS恰恰可以觀察到達(dá)微米級腫瘤微循環(huán)灌注情況。本研究發(fā)現(xiàn)，注射SonoVue造影劑后，原位前列腺腫瘤呈明顯的早增強(qiáng)及高增強(qiáng)，造影劑自腫瘤周圍向中央?yún)^(qū)域迅速灌注。TIC造影曲線分析顯示，原位前列腺腫瘤的Atm為(1.59±0.65) s，TtoPk為(11.59±3.68) s，AuC為(1933.91±454.38) dB。有研究表明，Atm與腫瘤血管內(nèi)徑相關(guān)，反映腫瘤組織中微血管血流速度[19]；TtoPk與內(nèi)皮細(xì)胞通透性有關(guān)，反映腫瘤組織的微血管密度[19]；AuC與區(qū)域血容量成正比，而血容量的增加是由于新血管形成[20]。本研究結(jié)果提示，LNCaP細(xì)胞在適宜的裸鼠前列腺內(nèi)生長，腫瘤的血管化程度較高，這是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志之一。

腫瘤的血管新生伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖和遷移。VEGF作為一種有效的腫瘤血管生成因子[21]，主要作用于與血管侵襲相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞[22]，而VEGF-A與血管新生密切相關(guān)，能夠刺激腫瘤血管的生長，為腫瘤提供所需的氧氣和營養(yǎng)[6]。本研究中，通過原位前列腺腫瘤免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)VEGF-A的AOD與Atm、Ttopk、AuC之間相關(guān)性為r=-0.931、r=-0.878、r=0.868，提示VEGF與CEUS之間具有顯著相關(guān)性。血管生成常常導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞蛋白表達(dá)的改變，CD31作為一種內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)蛋白，通過激活腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，促進(jìn)腫瘤血管生成[23]。通過實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)CD31的AOD與Atm、Ttopk、AuC之間相關(guān)性為r=-0.678、r=-0.360、r=0.310，提示CD31蛋白表達(dá)與CEUS之間具有相關(guān)性；有研究發(fā)現(xiàn)[24]，通過內(nèi)皮細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色來計(jì)算腫瘤內(nèi)血管化程度有預(yù)后價值。因此，本研究結(jié)果提示，通過CEUS可評估前列腺腫瘤的血管新生程度，為監(jiān)測腫瘤抗血管治療的預(yù)后提供了新的思路。

綜上所述，本研究采用細(xì)胞懸液注射法成功建立了LNCaP細(xì)胞原位移植模型，并提高了成瘤率。超聲可以用于前列腺原位移植模型的腫瘤生長監(jiān)測。在適宜的裸鼠前列腺微環(huán)境內(nèi)，雄激素依賴的LNCaP腫瘤細(xì)胞形成豐富的微循環(huán)結(jié)構(gòu)，較為真實(shí)地模擬了人類前列腺癌生長過程。以前列腺腫瘤的血管生成這一靶點(diǎn)，本研究可以為研究雄激素依賴的前列腺癌中涉及血管生成的生物學(xué)過程以及新型抗血管生成療法的臨床前評估提供動物模型依據(jù)。