顧倩，周欣鴻，岑麗蘭，陸海善，黃永秩，安苗苗，楊茜

[1. 右江民族醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷與研究中心， 廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西 百色 533000；3. 廣西分子病理學(xué)(肝膽疾病)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；4. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000]

膠質(zhì)瘤(glioblastoma，GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，發(fā)病率約為45%，占腦癌相關(guān)死亡的大部分[1]，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高以及治愈率低的特點(diǎn)[2]。由于膠質(zhì)瘤和正常腦組織并無特別顯著的界限，手術(shù)很難完全切除。臨床上治療膠質(zhì)瘤以替莫唑胺作為基礎(chǔ)的化療藥物，由于相較于其他癌種，膠質(zhì)瘤對(duì)放療、化療不敏感，容易復(fù)發(fā)，現(xiàn)有的治療方法只能適度延長(zhǎng)患者的生存期[3]。因此，探究腦膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制、尋找新的生物治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高膠質(zhì)瘤患者的生存率和改善預(yù)后具有十分重要的意義[4]。 真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase，eEF2K)是α激酶家族的非典型成員，它能夠負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的延伸步驟[5]。在缺氧和代謝窘迫等壓力條件下，eEF2K能夠減緩蛋白質(zhì)合成，幫助細(xì)胞節(jié)省能量，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展[6]。近年來國(guó)內(nèi)外的許多學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)eEF2K與腫瘤的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，并且在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，包括胰腺癌、乳腺癌、食管癌、肺癌和腦腫瘤[7-10]，并且高水平的eEF2K表達(dá)與浸潤(rùn)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤相關(guān)，同時(shí)eEF2K在腫瘤細(xì)胞的生存和遷移的進(jìn)展中也發(fā)揮著重要的作用[11]，抑制eEF2K可誘導(dǎo)多種癌癥類型的細(xì)胞死亡。此外，在癲癇患者中eEF2K還可以通過調(diào)節(jié)突觸可觸性來影響患者的學(xué)習(xí)和記憶能力，這種改變主要體現(xiàn)在突觸可塑性的活性、形態(tài)及從頭蛋白的合成[12]。然而，當(dāng)前eEF2K在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)作用研究尚少，本研究旨在探討膠質(zhì)瘤細(xì)胞中eEF2K的表達(dá)，觀察分析下調(diào)eEF2K的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，為癌癥治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1試劑及抗體 胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司，MEM培養(yǎng)基購自武漢博士德生物工程有限公司，膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基購自上海盈灣生物科技有限公司。eEF2K、GAPDH抗體購自美國(guó)CST公司，10%PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，熒光定量PCR試劑盒購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司，CCK-8試劑盒購自美國(guó)MCE公司，上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司構(gòu)建eEF2K低表達(dá)慢病毒載體。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司，正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800購自上海盈灣生物科技有限公司，常規(guī)方法復(fù)蘇細(xì)胞后用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基和膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基分別重懸U87及HA1800細(xì)胞至培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁繁殖至80%～90%時(shí)用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.3蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)eEF2K蛋白的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87及HA1800細(xì)胞，用PBS清洗兩次后加入裂解液，并置于冰上進(jìn)行裂解半小時(shí)。上樣至10%的SDS-PAGE 凝膠，每個(gè)加樣孔加入30 μg/30 μL的蛋白樣品，上樣后上層膠電泳80 v，下層膠電泳120 v，使用恒壓100 v進(jìn)行轉(zhuǎn)膜并依據(jù)蛋白分子量大小設(shè)置不同的轉(zhuǎn)膜時(shí)間。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將硝酸纖維素膜置于5%的脫脂牛奶中室溫孵育1 h，一抗稀釋比例：eEF2K(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)，將封閉后的硝酸纖維素膜置于一抗中4 ℃過夜孵育。配置二抗，并在室溫孵育2 h。ECL顯影，A液和B液按1∶1的比例配置，滴加至膜上進(jìn)行曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR) Total RNA試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。并配置反應(yīng)體系，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt方法分析eEF2K的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列，見表1。

表1 引物序列

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將U87細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為兩組：將陰性對(duì)照空病毒載體和eEF2K-shRNA低表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞，作為陰性對(duì)照組和eEF2K低表達(dá)組。并將U87細(xì)胞懸液調(diào)整為5×104/mL的濃度以每孔2 mL接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至40%～50%時(shí)，更換培養(yǎng)基，每孔1 mL，并添加50 μL滴度為5×107TU/mL的病毒懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將兩組細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，16 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h鏡下可見綠色熒光，72 h熒光豐度最高。使用熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染的效率，然后用嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選，以開展后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.6CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，以10 000個(gè)/孔接種于96孔板每孔100 μL，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑，避免在孔中產(chǎn)生氣泡，避光孵育2 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，并繪制U87細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，使用無血清的MEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL的細(xì)胞懸液，每孔2 mL加入6孔板中，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后使用10 μL槍頭于6孔板底部垂直劃痕，每次使用倒置顯微鏡觀察及拍照前用無菌PBS清洗2次，以洗去不貼壁的細(xì)胞，然后更換新鮮的無血清培養(yǎng)基，將6孔板放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)0 h、48 h測(cè)量劃痕的寬度并拍照。

2 結(jié)果

2.1eEF2K在各細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)情況 通過Western blot法在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800及膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中檢測(cè)eEF2K的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與HA1800相比，eEF2K的表達(dá)量在U87中呈高表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，如圖1所示。

注：與HA1800相比，***P<0.001。

2.2eEF2K的mRNA表達(dá)結(jié)果 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)eEF2K的表達(dá)情況，與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比膠質(zhì)瘤細(xì)胞中eEF2K的mRNA表達(dá)水平有所升高(P<0.01)，如圖2所示。

注：與HA1800相比，*P<0.01。

2.3構(gòu)建敲低eEF2K的膠質(zhì)瘤U87穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 待U87細(xì)胞融合至40%～50%時(shí)，使用慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，感染條件為MOI=50，轉(zhuǎn)染24 h后可見綠色熒光，培養(yǎng)至72 h時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最高。通過Western blot法檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后各組eEF2K的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比，eEF2K低表達(dá)組中的eEF2K蛋白表達(dá)量下降，灰度分析顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，表明eEF2K-shRNA低表達(dá)載體成功抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中eEF2K的蛋白表達(dá)水平，如圖3所示。

A：膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞(×100)；B：Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后eEF2K的蛋白表達(dá)水平；C：轉(zhuǎn)染后eEF2K蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)分析，與陰性對(duì)照組相比，***P<0.001。

2.4下調(diào)eEF2K的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比轉(zhuǎn)染eEF2K-shRNA低表達(dá)載體的eEF2K低表達(dá)組從48 h之后膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖能力均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示敲低eEF2K可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力，如圖4所示。

注：與陰性對(duì)照組相比，***P<0.001。

2.5下調(diào)eEF2K的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響 通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陰性對(duì)照組和eEF2K低表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h后eEF2K低表達(dá)組的細(xì)胞遷移至空白處距離小于陰性對(duì)照組，差異顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，如圖5A、5B所示。

A：膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞48 h劃痕實(shí)驗(yàn)(×100)；B：膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞48 h劃痕結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與陰性對(duì)照組相比，**P<0.01。

3 討論

膠質(zhì)瘤是最惡性和最具侵襲性的腦腫瘤，目前對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制了解尚十分的有限，因此，尋找新的治療靶點(diǎn)極其重要。eEF2K是不同于傳統(tǒng)蛋白激酶的非典型α激酶家族的新成員，可以磷酸化和滅活eEF2，人類eEF2K含有725個(gè)氨基酸殘基，其催化結(jié)構(gòu)域位于N端[5]。eEF2K在多種惡性腫瘤呈高表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期、增殖、自噬、凋亡、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程[13]，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程。

在前期的研究中發(fā)現(xiàn)eEF2K在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)明顯高于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此，本研究通過利用shRNA沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞中eEF2K的表達(dá)，以探究eEF2K與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的關(guān)系。CCK-8細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示從48 h開始抑制eEF2K后U87細(xì)胞的增殖能力明顯下降；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示下調(diào)eEF2K的表達(dá)后和陰性對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移率明顯降低，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明了沉默eEF2K能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。以往的研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中的eEF2K的表達(dá)水平較低，過表達(dá)eEF2K能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞的活力，并增強(qiáng)化療藥物奧沙利鉑的抗腫瘤功效[14]。一些學(xué)者的研究也發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AND)通過JAK2/STAT3信號(hào)通路可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，也能起到一定的抗腫瘤效果[15]。在肝癌中eEF2K通過SP1/ klf5介導(dǎo)VEGF的表達(dá)，能促進(jìn)細(xì)胞中血管生長(zhǎng)因子的合成和分泌，并刺激PI3K/Akt和STAT3信號(hào)，進(jìn)而加速血管生成和腫瘤進(jìn)展[16]，下調(diào)eEF2K的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果均和本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，說明了干擾eEF2K的表達(dá)，能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的惡性程度起到一定的抑制作用。此外，eEF2K的活性也會(huì)隨著腫瘤微環(huán)境的條件而改變，eEF2K的高表達(dá)使腫瘤細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)匱乏的情況下得以存活，而eEF2K低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞則被證明會(huì)死亡[13]。eEF2K的過表達(dá)也已被證明其能夠促進(jìn)多種類型腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[9]，而siRNA介導(dǎo)的eEF2K敲低則能夠減緩腫瘤的生長(zhǎng)。近年來有研究表明，eEF2K不但可以指導(dǎo)臨床治療而且還可作為癌癥患者的預(yù)后指標(biāo)[17]。膠質(zhì)瘤是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，難以治療，現(xiàn)有的靶向和單一治療方法未能對(duì)疾病進(jìn)展和患者生存產(chǎn)生強(qiáng)有力的影響。盡管關(guān)于eEF2K在腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移等方面取得了很大的進(jìn)展，但eEF2K通過何種機(jī)制參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的過程并不清楚，這也是未來應(yīng)當(dāng)解決的重要問題，此外，將eEF2K作為靶點(diǎn)的臨床研究也是未來重要的發(fā)展方向。

綜上所述，本研究結(jié)果提示eEF2K在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制eEF2K的表達(dá)可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力和遷移能力，為膠質(zhì)瘤的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。在未來，明確eEF2K對(duì)膠質(zhì)瘤影響的機(jī)制還需要進(jìn)行更深入的探索。