劉 潛，于欣宇，車益軍，曹 芳，冉啟山

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)校腦科學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI) 是神經(jīng)外科常見的疾病之一。截止目前，TBI已經(jīng)成為全球第三大致死、致殘因素[1]。創(chuàng)傷性軸突損傷(Traumatic axonal injury,TAI)是TBI中最重要的亞型之一。研究表明，軸突斷裂不是立即發(fā)生，而是一個(gè)遲發(fā)過程，在傷后4～24 h發(fā)生，這個(gè)過程被稱為繼發(fā)性軸突斷裂,是軸突損傷的主要形式[2]。而在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，不管是經(jīng)典的瞬間旋轉(zhuǎn)損傷模型、自由落體損傷模型或控制性皮質(zhì)損傷模型(Controlled cortical impact,CCI)，都可引起不同程度的軸突損傷[1,3-4]。雖然隨著CT、MRI、PET等臨床影像診斷手段的進(jìn)步，對(duì)TAI的診斷有一定的提高，但是免疫組化法檢測(cè)腦損傷區(qū)β淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP) 聚集量，仍被認(rèn)為是診斷TAI的金標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。然而TAI的發(fā)生具體機(jī)制目前仍不清楚，目前仍缺乏特異而有效的藥物及治療手段。因此，研究TAI發(fā)生發(fā)展機(jī)制，抑制TBI后繼發(fā)性軸突損傷、降解無疑是治療TBI的重要策略，具有重要的臨床價(jià)值及社會(huì)意義。

目前發(fā)現(xiàn)軸突損傷過程中有多種機(jī)制參與，其中Sarm1 (Sterile alpha and Toll/interleukin-1 receptor motif-containing 1) 在軸突變性中起到非常關(guān)鍵的作用，是軸突變性的主要執(zhí)行者。最早由Osterloh等在果蠅(dSarm)及小鼠(Sarm1)軸突離斷模型中發(fā)現(xiàn)，dSarm/Sarm1敲除后，可明顯抑制軸突變性[5]。鑒于Sarm1在軸突變性中的關(guān)鍵作用，Sarm1在TAI中的作用逐漸受到關(guān)注[6]。TBI后敲除Sarm1可明顯減輕TAI，但并未在活體小鼠驗(yàn)證Sarm1在TBI后是否通過抑制軸突損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]。因此，通過建立控制性皮質(zhì)損傷模型(CCI)，結(jié)合7T MRI及其他分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)Sarm1在創(chuàng)傷性腦損傷尤其是創(chuàng)傷性軸突損傷中的作用，旨在為臨床治療顱腦創(chuàng)傷提供新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 C57BL/6 雄性小鼠(Wild-type，WT，30只，10至12周齡，體重 22～25g)，購(gòu)買自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為：SCXK(湘)2019-0014。Sarm1基因全敲除(Sarm1 knock out,Sarm1 KO)小鼠雄性、雌性各2只，共4只，來自于清華大學(xué)免疫學(xué)研究所，將上述4只Sarm1 KO小鼠作為種鼠，與C57小鼠雜交繁殖，繁殖后代經(jīng)鑒定為純合子用于本實(shí)驗(yàn)。Anti-Sarm抗體、Anti-PLK2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；顱腦創(chuàng)傷儀購(gòu)自美國(guó)PSI公司；開顱手術(shù)器械均購(gòu)自南京精工公司；7T MRI購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；轉(zhuǎn)棒式疲勞儀ZB-200購(gòu)自成都盟泰公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)用鼠共60只；C57BL/6 雄性小鼠30只，Sarm1基因敲除鼠(Sarm1 KO)30只。將兩組小鼠分別隨機(jī)分為野生型假手術(shù)對(duì)照組(WT-sham)，野生型顱腦創(chuàng)傷組(WT-CCI)，Sarm1基因敲除鼠假手術(shù)組(Sarm1 KO-sham)，Sarm1基因敲除鼠顱腦創(chuàng)傷組(Sarm1 KO-CCI)。行為學(xué)評(píng)分使用鼠12只(6只WT，6只 Sarm1 KO)，MRI掃描使用鼠12只(6只WT，6只 Sarm1 KO，與行為學(xué)評(píng)分使用鼠為同一批次小鼠)。行為學(xué)評(píng)分分別評(píng)價(jià)建模前與建模后1、3、5、7 d，MRI掃描于建模前與建模后1d分別進(jìn)行。嚴(yán)格對(duì)照前期制定納入標(biāo)準(zhǔn)，WB使用24只，免疫熒光和組化使用24只，行為學(xué)評(píng)分和MRI掃描使用12只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具體分組見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物數(shù)量(n=6)

1.3 小鼠TBI和假手術(shù)組模型的建立 使用3%戊巴比妥鈉溶液作為麻醉劑，通過腹腔注射麻醉小鼠，頭部清潔備皮，局部皮膚予以醫(yī)用碘伏消毒；行頭部矢狀位右旁正中切口，剝離骨膜后暴露右側(cè)顱骨術(shù)區(qū)，以前囟后2.0 mm，中線旁2.0 mm為鉆孔位，用合適顱骨鉆鉆開3.0 mm的圓形骨窗，暴露頂葉。評(píng)估小鼠生命體征無異常后，將其頭部固定在TBI-0310顱腦創(chuàng)傷儀上，選擇2.0 mm直徑的鈍口打擊頭，予以打擊，具體參數(shù)如下：打擊速度為：5 m/s，接觸時(shí)間為：100 ms，打擊深度為：2.0 mm；造成實(shí)驗(yàn)小鼠右側(cè)頂葉中重度腦挫裂傷，創(chuàng)傷完成后，予以術(shù)區(qū)徹底止血，縫合頭皮，將小鼠放置在恒溫箱中待麻醉復(fù)蘇。假手術(shù)組除不接受顱腦損傷儀器打擊外，其余操作和TBI小鼠完全一致。將上述4組小鼠建模后按照組別分籠放置飼養(yǎng)。

1.4 小鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分(轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)) 運(yùn)用雙盲法對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估。用小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀(ZB-200，成都盟泰)檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。建立CCI模型前夜讓小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上練習(xí)1 min×3次，固定轉(zhuǎn)速為16 r/min，間隔15 min。建模前1 h進(jìn)行加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)，并詳細(xì)記錄小鼠轉(zhuǎn)棒的基值。加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)從0 r/min開始，每隔10 s增加3 r/min，直到轉(zhuǎn)速達(dá)到30 r/min。建模前及建模后第1、3、5、7天均進(jìn)行加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。并詳細(xì)記錄小鼠的落棒時(shí)間。若小鼠抱繞轉(zhuǎn)棒2周無行走動(dòng)作亦視為落棒。

1.5 Bruker 7T MRI掃描 借助7T小動(dòng)物磁共振(Bruker bio spec USR 70/20，德國(guó))，選取TBI前1 d及TBI后第1天進(jìn)行影像學(xué)檢查。包括動(dòng)物設(shè)置和序列優(yōu)化，每只小鼠總成像時(shí)間為1.0 h。小鼠經(jīng)氣體麻醉后固定于MRI平臺(tái)床上，體溫控制在37.0 ℃，同時(shí)監(jiān)測(cè)呼吸。分別在CCI損傷前行T2WI及彌散張量成像(Diffusion tensor imaging,DTI)掃描作為自身對(duì)照。損傷后24 h再次掃描。T2WI相比校損傷灶大小，各向異性分?jǐn)?shù)(Fractional anisotropy,FA)評(píng)價(jià)軸突損傷程度。

1.6 冰凍切片和免疫熒光

1.6.1 冰凍切片 取材：于TBI造模后第1天，分別取WT sham組、Sarm1 KO-sham組、WT-CCI組和Sarm1 KO-CCI組小鼠各6只，深度麻醉，左心室內(nèi)灌注4 ℃ PBS液置換體內(nèi)血液直至肝臟和腸系膜血管完全變白后，繼續(xù)予以4%多聚甲醛約50 mL進(jìn)行灌注固定，確定小鼠完全死亡后，斷頭完整取出腦組織，分別置于4%多聚甲醛標(biāo)本盒中，繼續(xù)固定24 h。梯度脫水：固定完成的小鼠大腦依次分別置于10%、20%、30%濃度的蔗糖溶液中，4 ℃環(huán)境下分別脫水24 h。切片制備：脫水完成的完整腦組織沿冠狀位切片，直至創(chuàng)傷灶區(qū)域胼胝體，修正整齊，放入包埋盒，加入OCT包埋劑，排除氣泡，超低溫迅速冷凍，然后將其固定于冰凍切片機(jī)，調(diào)整好方向，15 μm厚度，冠狀位連續(xù)切片，將切片展開，依次貼附在防脫載玻片上，做好標(biāo)記，常溫晾干，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 免疫熒光 復(fù)溫：取凍存的冰凍切片放置于濕盒內(nèi)，在常溫下復(fù)溫30 min。清洗：將制備復(fù)溫后的切片浸入裝滿PBS的洗片盒中，再放置于水平搖床上(參數(shù)為：45 r/min，10 min)，重復(fù)3次。破膜：將濃度為0.03%曲拉通，滴注于切片上，使其完全覆蓋整張腦組織切片，置于濕盒中20 min，然后重復(fù)上述清洗步驟?？乖忾]：將抗原封閉液輕柔的滴注在切片上，常溫放置于濕盒1 h，封閉完成。孵育一抗：用濾紙小心吸除切片上附著的封閉液，滴入稀釋好的一抗，置于濕盒中，4 ℃冰箱中靜置保存過夜，重復(fù)上述清洗步驟。孵育二抗：取出已完成孵育一抗切片，置于室溫中復(fù)溫20 min，然后進(jìn)行梯度脫水，接著滴加二抗，常溫下置于濕盒避光孵育2 h，完成后再次予以清洗。染核：腦組織切片滴加DAPI，浸染10 min，然后清洗。封片：滴加抗熒光淬滅劑，蓋玻片輕推載玻片，避免氣泡產(chǎn)生。觀察：將制備好的切片置于熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.7 免疫印跡法(Western blot) 配膠： 使用SDS-PAGE凝膠快速配制試驗(yàn)試劑，其中下層分離膠濃度12%，上層膠濃度為5%。上樣：將制備好的蛋白樣品加入上樣緩沖液100 ℃沸水煮浴5 min，待冷卻后移液器上樣。電泳：將電壓調(diào)整至80 V，電泳至蛋白分離后，調(diào)整電壓為120 V，總時(shí)長(zhǎng)約1 h。轉(zhuǎn)膜：切取對(duì)應(yīng)分子量大小的凝膠，放置于浸有預(yù)冷電轉(zhuǎn)液的濾紙上，覆蓋上相應(yīng)大小的PVDF膜置于冰水浴中，恒定電流200 mA電轉(zhuǎn)1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至FVDP膜上。封閉：取出轉(zhuǎn)膜完成的PVDF膜，放入5%的脫脂牛奶中進(jìn)行封閉，常溫下置于水平搖床(參數(shù)：45 r/min，1 h)。孵育一抗：取封閉好的PVDF膜快速放入盛有按比例稀釋好的一抗抗體孵育盒中，置于4 ℃恒溫冰箱水平搖床過夜。孵育二抗：取出PVDF膜，用TBST緩沖液，常溫下水平搖床90 r/min清洗4次，常溫下孵育2 h。顯影：將孵育完成后的PVDF膜放置于凝膠化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，加入適量配制好的ECL顯影液，曝光得到免疫印跡帶，用于后續(xù)分析統(tǒng)計(jì)。

1.8 免疫組化染色 復(fù)溫切片：將制備完成的腦組織切片，厚度為 5～6 μm，室溫放置30 min后，放入4 ℃丙酮固定10 min，然后用PBS反復(fù)清洗，每次5 min，共3次，后用3%過氧化氫避光孵育20 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再次用PBS清洗2次，每次5 min。正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分，保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài)，滴加正常兔血清處理，置于37 ℃環(huán)境下15 min。滴加一抗：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加一抗，置于4 ℃冰箱過夜。取出切片用PBS清洗2次，每次5 min (置于搖床)。滴加二抗：滴加生物素化的二抗，置于37 ℃環(huán)境下40 min，后再用PBS清洗2次，每次5 min (置于搖床) 。DAB顯色：鏡下觀察，適時(shí)終止，用自來水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，室溫，30 s，自來水充分沖洗。梯度酒精脫水：80% 2 min，95% 2 min，100% 2次，5 min。二甲苯透明：I，II (二甲苯)各5 min封片，最后用加拿大樹膠(或中性樹膠)封片。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)采用Two-way ANOVA分析，余檢測(cè)采用One-wayANOVA分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用GraphPad prism 7.0軟件制作圖表。

2 結(jié)果

2.1 小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 為了解WT組和Sarm1 KO組小鼠造模前后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能情況，選擇轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示(見圖1)，在造模前，與WT組比較，兩組行為學(xué)無明顯差異(P>0.05,n=6)，表明Sarm1基因敲除后不影響小鼠運(yùn)動(dòng)功能。CCI損傷后小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間較造模前明顯降低，同時(shí)，與WT組比較，Sarm1 KO組小鼠在傷后第1天(P<0.01,n=6)，第3天(P<0.01，n=6)，第5天(P<0.05,n=6)小鼠運(yùn)動(dòng)功能顯著改善。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷后第1天，小鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能損傷最重，故選擇傷后第1天(24 h)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

*：WT-CCI組與Sarm1 KO-CCI組比較，P<0.05。圖1 創(chuàng)傷前、后1、3、5、7 d小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間

2.2 Bruker 7T MRI 掃描

2.2.1 CCI后Sarm1敲除對(duì)損傷灶大小的影響 7T MRI評(píng)價(jià)野生型小鼠與Sarm1基因敲除小鼠在腦損傷前后創(chuàng)傷灶范圍大小差異情況。選擇創(chuàng)傷前1d和創(chuàng)傷后第1天進(jìn)行對(duì)比(見圖2)。相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)傷后第1天(WT-CCI、Sarm1 KO-CCI)術(shù)區(qū)皮層腦組織均出現(xiàn)不同程度組織創(chuàng)傷；比較兩組損傷灶大小，Sarm1 KO-CCI組小鼠損傷灶較WT-CCI組明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，n=6)。

A:a：WT-sham組T2圖像；b：Sarm1 KO組T2圖像；c：創(chuàng)傷后1天(WT Post-CCI組)T2圖像；d：創(chuàng)傷后1天(Sarm1 KO-Post-CCI)組T2圖像； B:*:WT-CCI組和Sarm1KO-CCI組比較，P<0.01。圖2 兩組腦創(chuàng)傷前、創(chuàng)傷后第1天MRI T2圖像

2.2.2 CCI后Sarm1敲除對(duì)軸突損傷的影響 為了研究WT型小鼠與Sarm1 KO小鼠在腦損傷前后軸突損傷的表達(dá)變化差異，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠建模前1d和建模后第1天進(jìn)行7T MRI DTI掃描，選擇傷側(cè)部位胼胝體區(qū)為感興趣區(qū)檢測(cè)FA值(見圖3)。正常狀態(tài)下，相較與WT組，Sarm1基因敲除后不影響FA值，說明敲除Sarm1不造成軸突損傷。CCI后，兩組小鼠FA值明顯降低，但Sarm1 KO組小鼠FA值降低明顯受到抑制(P<0.05，n=6)，表明Sarm1敲除后明顯抑制抽突損傷。

A：a：創(chuàng)傷前1天WT組DTI圖像；b：創(chuàng)傷前1天Sarm1 KO組DTI圖像；c：創(chuàng)傷后1天WT組DTI圖像；d：創(chuàng)傷后1天Sarm1 KO組DTI圖像；B： *： WT -CCI組與Sarm1KO-CCI組比較，P<0.05。圖3 兩組小鼠腦創(chuàng)傷前后1天的DTI圖像

2.3 不同方法驗(yàn)證APP的表達(dá)

2.3.1 免疫熒光法驗(yàn)證APP的表達(dá) 病理學(xué)檢查APP表達(dá)水平是檢測(cè)是軸突損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，故而我們對(duì)CCI后的創(chuàng)傷部位的APP的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。在腦創(chuàng)傷前，WT-Sham組和Sarm1 KO-Sham組中，軸突損傷特異性標(biāo)記因子APP未見明顯表達(dá)，表明敲除Sarm1不造成軸突損傷；CCI后，兩組小鼠APP表達(dá)均明顯增高， Sarm1 KO-CCI組較WT-CCI組APP表達(dá)明顯減少，表明敲除Sarm1后，明顯抑制APP過表達(dá)(P<0.05，n=6，見圖4)。

綠色熒光標(biāo)記APP、藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核(DAPI染色，標(biāo)尺=500 μm)。圖4 兩組在創(chuàng)傷前、后1 d APP在胼胝體區(qū)的表達(dá)水平

2.3.2 Western blot驗(yàn)證APP的表達(dá) APP在正常WT組及Sarm1 KO組小鼠腦組織的表達(dá)量均較低，兩組間無明顯差異，表明Sarm1敲除后不造成明顯的軸突損傷。CCI后第1天，兩組APP表達(dá)相較于對(duì)照組均有明顯升高(P<0.01，n=6)，且Sarm1 KO-CCI組較WT-CCI組表達(dá)明顯降低(P<0.05，n=6，見圖5)，表明Sarm1敲除后明顯抑制APP過表達(dá)，抑制軸突損傷。

A：蛋白條帶；B：統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；*： WT-CCI組與WT-sham組比較，P<0.01；#： Sarm1 KO-CCI組與WT-CCI組比較，P<0.05。圖5 Sarm1敲除CCI后APP的表達(dá)

2.4 NeuN染色檢測(cè)Sarm1對(duì)CCI后神經(jīng)元活性的影響 取CCI損傷灶靠中線周邊皮質(zhì)區(qū)為感興趣區(qū)，對(duì)照組取對(duì)應(yīng)皮質(zhì)區(qū)，每只小鼠選取 3 張切片，每張切片選取互不重復(fù)的 3 個(gè)視野(×200) ，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)數(shù)NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)(見圖6A)。結(jié)果顯示，正常組中，Sarm1敲除后不影響NeuN表達(dá)。CCI后第1天，兩組小鼠NeuN表達(dá)均明顯降低(P<0.05，n=6)，且Sarm1 KO組較WT組損傷灶周邊NeuN表達(dá)明顯增高(P<0.05，n=6，見圖6B)，表明敲除Sarm1后明顯抑制神經(jīng)元死亡。

A：MRI T2，紅色標(biāo)記內(nèi)為NeuN染色取材部位；B：統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；* ：WT-CCI組與WT-sham組比較，P<0.05；#：Sarm1 KO-C CI組與WT-CCI組比較，P<0.05。圖6 Sarm1對(duì)CCI后神經(jīng)元活性的影響

3 討論

APP是一種跨膜糖蛋白，是神經(jīng)細(xì)胞的正常組成部分。它由高爾基體處理，并沿軸突快速向前運(yùn)輸，其功能包括細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)、神經(jīng)保護(hù)和對(duì)損傷的反應(yīng)，能促進(jìn)軸突萌發(fā)、突觸發(fā)生、神經(jīng)突生長(zhǎng)[8]。大量文獻(xiàn)證實(shí)，APP是目前檢測(cè)軸突損傷的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，其在傷性腦損傷后不到2 h就可識(shí)別出陽性反應(yīng)，可作為TAI后早期檢測(cè)指標(biāo)[10]。本研究通過免疫熒光及WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)，Sarm1可抑制CCI后APP過表達(dá)，表明Sarm1明顯抑制TBI后軸突損傷。

鑒于DTI對(duì)大腦微結(jié)構(gòu)改變高度敏感，是活體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物和人類TBI后常用的影像生物標(biāo)志物[11]。我們檢測(cè)了胼胝體 DTI 指標(biāo)FA值的變化，對(duì)損傷前后24 h的創(chuàng)傷小鼠觀察，發(fā)現(xiàn)損傷前兩組間FA值無明顯差異，表明Sarm1敲除后明顯抑制軸突損傷；而在建模成功后第1天，兩組FA值均明顯降低，Sarm1敲除后明顯抑制FA值降低，表明敲除Sarm1明顯抑制軸突損傷。

NeuN是一種在多數(shù)中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的有絲分裂后神經(jīng)元中表達(dá)的胞核蛋白[12]，在腦椎體神經(jīng)元和顆粒性神經(jīng)元表達(dá)，能特異性與神經(jīng)元細(xì)胞核的抗原結(jié)合，是一種良好的成熟神經(jīng)元標(biāo)記物[13]。這種神經(jīng)元蛋白最初是使用一種稱為NeuN的單克隆抗體通過免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)被鑒定。通過分析，NeuN被鑒定為Fox-3基因產(chǎn)物[14]。Fox-3包含一個(gè)RNA識(shí)別基序，并作為一種剪切調(diào)節(jié)分子發(fā)揮作用[14-15]。Fox-3調(diào)節(jié)NumB的選擇性剪切，進(jìn)而促進(jìn)發(fā)育過程中的神經(jīng)元分化。研究發(fā)現(xiàn)，TBI后損傷灶周邊NeuN表達(dá)量增加與神經(jīng)功能改善成正相關(guān)[16-17]。本研究證實(shí)，正常狀態(tài)下，Sarm1敲除后并不影響NeuN表達(dá)，而CCI后，NeuN表達(dá)明顯降低，Sarm1敲后明顯抑制NeuN表達(dá)降低，表明Sarm1敲除后明顯抑制CCI后神經(jīng)元死亡。

正常情況下，Sarm1在神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)上發(fā)揮截然不同的作用。雖然發(fā)育時(shí)，Sarm1參與神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生，但是Sarm1敲除鼠可以正常發(fā)育，表現(xiàn)出正常的運(yùn)動(dòng)功能[18]，這與我們的研究結(jié)果一致。而在離體神經(jīng)元損傷模型中，無論是線粒體毒性損傷還是氧糖剝奪，都可以高表達(dá)及激活內(nèi)源性Sarm1從而促進(jìn)神經(jīng)元死亡及軸突變性[19]。而外源性Sarm1，可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞死亡[20]。缺氧后Sarm1可以促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性死亡[21]，而這種死亡不同于凋亡、壞死，被稱為Sarm1依賴性死亡[19]。近期研究證實(shí)，Sarm1是一種內(nèi)源性NAD+分解酶，活化的Sarm1可直接將NAD+分解為ADP-ribose (ADPR)，cyclic ADPR和煙酰胺(Nicotinamide)[22]。Sarm1通過分解NAD+在能能量代謝中起到了關(guān)鍵作用，在多種神經(jīng)系統(tǒng)急慢性模型中(比如在阿爾茨海默病、缺血性腦卒中以及創(chuàng)傷性腦損傷)促進(jìn)軸突損傷及神經(jīng)元死亡[22-25]。本研究通過活體小鼠MRI掃描及其他分子生物學(xué)方法證實(shí)，CCI后，Sarm1敲除后通過抑制軸突損傷與神經(jīng)元死亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，在創(chuàng)傷性腦損傷后，敲除Sarm1可減輕腦組織損傷，抑制軸突損傷及神經(jīng)元死亡從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。