范 芹，謝 巍，劉建國(guó)，曾鳳嬌，白國(guó)輝，黃偉琨，管曉燕

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 種植科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；4.邯鄲市口腔醫(yī)院 牙周科，河北 邯鄲 056000)

茶多酚(Tea polyphenols，TP)大量存在于茶葉中，是茶葉中酚類化合物的總稱。TP的生物學(xué)功能多種多樣，包括抗腫瘤、抗氧化、降血糖、增強(qiáng)免疫力等，且具有不產(chǎn)生耐藥性、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來(lái)醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1]?？谇环N植技術(shù)是近年來(lái)逐漸發(fā)展起來(lái)新興技術(shù)，通過(guò)手術(shù)的方式將人工植體植入頜骨內(nèi)替代人工牙根，成為了臨床用于缺失牙的主要治療方案[2]。種植體理想的愈合方式是植體與骨組織形成骨結(jié)合，骨組織保持良好的成骨與破骨狀態(tài)的平衡是口腔種植術(shù)成功的關(guān)鍵[3]。

人牙槽骨成骨細(xì)胞(Human alveolar osteoblasts，HAOB)，是由間充質(zhì)始祖細(xì)胞分化而來(lái)的與骨組織功能相關(guān)的主要細(xì)胞[4]。在骨的形成及改建過(guò)程中，成骨細(xì)胞特異性分泌多種生物活性物質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子等，調(diào)節(jié)并影響骨的形成和重建。成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix，OSX)只在骨組織中特異性表達(dá)，在干細(xì)胞分化形成成骨細(xì)胞過(guò)程中起決定性作用，沒(méi)有OSX就沒(méi)有骨形成和骨再生[5-6]。組織非特異性堿性磷酸酶(Tissue non-specific alkaline phosphatase，TNAP)是一種非特異性磷酸單酯酶，主要在肝臟、骨組織和腎臟中高度表達(dá),骨組織中的TNAP在骨礦化過(guò)程提供磷酸鹽，是成骨細(xì)胞(Osteoblasts ，OB)分化早期的標(biāo)志[7-8]。骨鈣素(Osteocalcin，OCN)是一種特異性非膠原基質(zhì)蛋白，由成骨細(xì)胞生成并特異性分泌，能夠調(diào)節(jié)骨中鈣的分泌從而影響骨的形成和鈣化[9-10]。

本研究通過(guò)觀察不同濃度TP對(duì)HAOB相關(guān)基因OSX，TNAP和OCN基因表達(dá)的影響，初步探討TP調(diào)節(jié)人牙槽骨恢復(fù)和再生的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 茶多酚(Solarbio，中國(guó))，Purity≥98.0%。

1.1.2 樣本來(lái)源及納入標(biāo)準(zhǔn) 樣本采集對(duì)象為遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科就診患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①阻生牙、正畸拔除牙；②無(wú)牙周及根尖病變；③未服用影響骨代謝藥物；④排除骨代謝相關(guān)疾病。術(shù)前告知患者情況，與患者簽訂知情同意書。樣本采集：收集牙拔除后牙槽窩內(nèi)壁少量的牙槽骨，置于預(yù)冷的含青鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配置及分組 TP母液配置(1 mg/mL)：稱取10 mg TP溶于10 mL DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基)中，充分混勻制成1 mg/mL的母液，0.22 μm針頭式濾器過(guò)濾，用DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行濃度稀釋，分為0.1、1.0、10 μg/mL TP組、對(duì)照組(無(wú)TP的DMEM完全培養(yǎng)基)，用以上培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.2 樣本收集及HAOB鑒定 分離原代HAOB細(xì)胞(37 ℃、5%CO2)，顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞鑒定：經(jīng)偶氮偶聯(lián)法及茜素紅S染色法進(jìn)行對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行染色，鑒定完成后，傳代培養(yǎng)至第3代備用。制備單細(xì)胞懸液，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。細(xì)胞懸液(2×105/mL)3 mL接種至6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24 h后各實(shí)驗(yàn)組加入相應(yīng)濃度的TP，共培養(yǎng)24、48、72 h。

1.2.3 cDNA的獲取 根據(jù)RNAiso Plus(TaKaRa)說(shuō)明書提取RNA，調(diào)整為100 ng/μL的RNA樣本后，根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)中10 μL反應(yīng)體系，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃，5 sec。

1.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得OSX、TNAP和OCN基因序列，設(shè)計(jì)引物序列(見(jiàn)表1)后，由上海生工生物工程公司完成合成。

表1 引物序列

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)HAOB相關(guān)基因表達(dá) 以O(shè)SX、TNAP和OCN基因的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系按照SYBR? Premix Ex TaqTM(TaKaRa)20 μL配制。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃、30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃處理30 s(40 Cycle)；延伸72 ℃、30 s。

2 結(jié)果

2.1 HAOB鑒定結(jié)果 HAOB能偶合成并分泌ALP，大部分HAOB細(xì)胞胞漿中可觀察到呈現(xiàn)被染成淡藍(lán)色的片狀及團(tuán)塊狀陽(yáng)性顆粒(見(jiàn)圖1)。OB具有體外礦化的特征，經(jīng)肉眼觀察可看到到白色礦化結(jié)節(jié)的形成。通過(guò)茜素紅鈣染色后，礦化結(jié)節(jié)染色呈橘紅色，形狀不規(guī)則，大小不一(見(jiàn)圖2)。因此，通過(guò)鑒定可以確定分離培養(yǎng)的細(xì)胞為純化的HAOB細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 人牙槽骨成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色(×200)

圖2 人牙槽骨成骨細(xì)胞茜素紅鈣染色(×100)

2.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)凝膠電泳圖顯示，總RNA的OD260/OD280比值為1.8～2.0，說(shuō)明RNA無(wú)降解無(wú)污染，可作為qRT-PCR的模板，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 HAOB相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果

2.3.1OSX、TNAP、OCN熔解曲線OSX、TNAP、OCN基因的熔解曲線均為單峰(見(jiàn)圖3～6)，說(shuō)明4個(gè)基因的引物特異性好，無(wú)非特異性擴(kuò)增。

圖3 GAPDH的熔解曲線

圖4 OSX基因的熔解曲線

圖5 TNAP基因的熔解曲線

圖6 OCN基因的熔解曲線

2.3.2OSX的相對(duì)表達(dá)量 在24 h和48 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量均低于對(duì)照組(P<0.05)；在72 h時(shí)，1.0 μg/mL TP組的表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)，而10 μg/mL TP組的表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05)。其他組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖7)。

*：與同時(shí)段相應(yīng)對(duì)照組比較，P<0.05。圖7 TP對(duì)OSX相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.3TNAP的相對(duì)表達(dá)量 在24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，0.1、1.0、10 μg/mL TP組TNAP的表達(dá)量均低于對(duì)照組(P<0.05)；在48 h時(shí)，0.1、10 μg/mL TP組的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05)，但1.0 μg/mL TP組略高于對(duì)照組(P> 0.05)；在72 h時(shí)可觀察到與對(duì)照組相比，1.0 μg/mL TP組略低于對(duì)照組(P> 0.05)，0.1、10 μg/mL TP組低于對(duì)照組(P<0.05)。其他組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖8)。

*：與同時(shí)段相應(yīng)對(duì)照組比較，P<0.05。圖8 TP對(duì)TNAP相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.4OCN的相對(duì)表達(dá)量 在24 h時(shí)，0.1、10 μg/mL TP組的OCN相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05)，1.0 μg/mL TP組的相對(duì)表達(dá)量略高于對(duì)照組(P> 0.05)；在48 h時(shí)，與對(duì)照度相比，其余各組表達(dá)量均低(P<0.05)；在72 h時(shí)，與對(duì)照組相比，1.0 μg/mL TP組的相對(duì)表達(dá)量高(P<0.05)，0.1、10 μg/mL TP組的表達(dá)量低(P<0.05，見(jiàn)圖9)。

*：與同時(shí)段相應(yīng)對(duì)照組比較，P<0.05。圖9 TP對(duì)OCN相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

口腔種植技術(shù)的快速發(fā)展使得種植牙成為人們治療缺失牙的首選方案，種植體的穩(wěn)定性及良好的愈后是當(dāng)前口腔醫(yī)生的難題。人牙槽骨具有高度可塑性，通過(guò)手術(shù)方法將種植體植入缺牙區(qū)牙槽骨，保證骨組織與種植體形成良好的骨結(jié)合成為了植體成功的關(guān)鍵[11]。TP是茶葉中的多酚類化合物的總稱，來(lái)源廣泛，取材方便，研究表明TP在抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗衰老、抗炎抗菌方面都具有較好的作用[12]。近些年來(lái)TP在口腔方面的應(yīng)用主要集中于抗菌、抗炎方面[13]，關(guān)于TP對(duì)成骨作用的研究還鮮有報(bào)道。本研究的出發(fā)點(diǎn)在于將TP作用于人牙槽骨成骨細(xì)胞，通過(guò)共培養(yǎng)后觀察TP對(duì)于與成骨增殖分化相關(guān)因子的作用。

OSX不僅可以促進(jìn)OB分化，而且還可以使OB發(fā)生異位礦化[14]。研究證實(shí)OSX對(duì)OB的分化具有雙向調(diào)控作用，一方面，發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，適量的OSX可以促進(jìn)OB的成熟、分化，從而促進(jìn)骨形成。另一方面，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，OSX可以對(duì)Wnt通路產(chǎn)生抑制作用，從而抑制OB的增殖。因此，只有適量表達(dá)的OSX才能對(duì)OB的分化、成熟具有積極的作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞增殖旺盛時(shí)期，OSX的表達(dá)量較低，TP可能抑制OSX的表達(dá)。在第3天，適宜濃度的TP促進(jìn)了OSX的表達(dá)。TNAP表達(dá)的ALP，是OB分泌的一種酶類蛋白，能夠作為一種生物標(biāo)記物反應(yīng)OB的分化、成熟狀態(tài)[15]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第3天在適宜濃度TP作用下TNAP的表達(dá)增強(qiáng)。分化成熟的成骨細(xì)胞能夠合成并分泌骨鈣素，開始表達(dá)于礦化早期，在礦化結(jié)節(jié)成熟后達(dá)到高峰，可以調(diào)節(jié)骨礦化過(guò)程。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以觀察到從第3天開始，適宜濃度TP的影響下，OCN的表達(dá)增強(qiáng)。

HAOB是骨形成的功能細(xì)胞，大量研究表明其可作為體外研究物質(zhì)對(duì)骨組織生物學(xué)的影響[16]。本研究選用人健康牙槽骨進(jìn)行體外分離原代培養(yǎng)HAOB，而不是細(xì)胞株或動(dòng)物原代細(xì)胞，對(duì)TP的臨床應(yīng)用更具指導(dǎo)意義[17]。本實(shí)驗(yàn)采用qRT- PCR初步探討TP調(diào)節(jié)HAOB可能的分子機(jī)制，觀察不同濃度TP對(duì)體外培養(yǎng)HAOB的OSX、TNAP和OCN基因表達(dá)的影響，初步探討TP調(diào)節(jié)人牙槽骨恢復(fù)和再生的可行性，但OB的增殖和分化受多種因素影響，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索TP對(duì)于成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)是否有促進(jìn)作用，且TP對(duì)骨形成基因表達(dá)的長(zhǎng)期效果還需進(jìn)一步探討。