賈艷會(huì) 華春珍,* 周明明 俞惠 付盼 王傳清 許紅梅 景春梅 鄧?yán)^巋 陳運(yùn)生 張婷 張泓 林愛(ài)偉 王世富 曹清 周云芳 鄧慧玲 曹三成 赫建華 高巍

(1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒童醫(yī)院，國(guó)家兒童健康臨床研究中心，杭州 310003；2 復(fù)旦大學(xué)兒童醫(yī)院，上海 201102；3 重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院，重慶 400014；4 深圳市兒童醫(yī)院，深圳 518026；5 上海交通大學(xué)兒童醫(yī)院，上海 200040；6 山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院，濟(jì)南 250022；7 上海兒童醫(yī)學(xué)中心，上海 200127；8 西安市兒童醫(yī)院，西安 710002；9 開封市兒童醫(yī)院，開封 475099)

流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae，Hi)是一種革蘭陰性小球桿菌，主要分為有莢膜和無(wú)莢膜菌株兩類。大部分的流感嗜血桿菌為機(jī)會(huì)性致病菌，也是臨床中兒童最常分離到的條件致病菌之一[1-2]，該菌主要引起兒童呼吸道疾病，如社區(qū)獲得性肺炎[2-4]、急性中耳炎、鼻竇炎[2,5]等。該菌在青春前期女童細(xì)菌性陰道炎中也是主要的致病菌之 一[6]。嚴(yán)重感染可侵入血流引起膿毒血癥、腦膜炎等侵襲性感染[2,4,7]。多年來(lái)，治療Hi感染的首選藥物是氨芐西林，但是不同國(guó)家和地區(qū)，Hi對(duì)氨芐西林的耐藥率差別較大[8-9]，且耐藥率逐年上升趨勢(shì)明顯[8-10]。2016年以來(lái)，我國(guó)兒科細(xì)菌感染性疾病監(jiān)測(cè)協(xié)作組(Infectious Disease Surveillance of Pediatrics，ISPED)對(duì)不同地域9家兒童醫(yī)院的Hi進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)[11-12]，發(fā)現(xiàn)Hi菌株對(duì)氨芐西林的耐藥率從2016年的58.1%升至2019年的72.1%%，對(duì)氨芐西林舒巴坦的耐藥率也從17.6%上升至43.0%，臨床Hi疾病的治療面臨挑戰(zhàn)。新冠疫情之后，在嚴(yán)格的防控策略下，兒童各種感染性疾病的發(fā)生率有明顯下降，疫情后ISPED關(guān)于兒童來(lái)源的Hi尚未報(bào)道，現(xiàn)將2020年我國(guó)9家兒童醫(yī)院的Hi耐藥模式進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源和鑒定

我國(guó)不同地域的9家兒童醫(yī)院組成ISPED協(xié)作組，成員單位包括浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心、深圳兒童醫(yī)院、西安兒童醫(yī)院、山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院、河南省開封市兒童醫(yī)院。Hi臨床株為2020年1月至12月鑒定者，且在嗜血桿菌選擇性培養(yǎng)基上經(jīng)分區(qū)劃種半定量達(dá)“++”以上。細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定方法按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)當(dāng)年指南執(zhí)行。

1.2 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)

按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)2020版指南，采用頭孢硝噻酚紙片(BioMériex,France)法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶，采用MIC法(重慶兒童醫(yī)院和復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院)或Kirby-Bauer法(其他家兒童醫(yī)院)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。MIC法使用奈瑟菌/嗜血桿菌檢測(cè)試劑盒(重慶圣和源科技有限公司)；Kirby-Bauer法檢測(cè)的抗生素包括氨芐西林(10 μg)、氨芐西林/舒巴坦(10 μg/10 μg)、頭孢呋辛(30 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、美羅培南(10 μg)、氯霉素(30 μg)、復(fù)方磺胺甲惡唑(1.25/23.75 μg)、左氧氟沙星(5 μg)和阿奇霉素(15 μg)，均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。流感嗜血桿菌 ATCC49247為質(zhì)控菌株貫穿始終，結(jié)果完全合格。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)數(shù)資料用n(%)表示，組間耐藥率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本來(lái)源及分布

共分離到Hi 2244株，其中來(lái)自呼吸道標(biāo)本2104株(93.4%)，非呼吸道標(biāo)本140株(6.23%)。1312株(58.5%)來(lái)自男性，患兒的年齡范圍為10 d～16歲，中位數(shù)年齡0.92歲。菌株季節(jié)性分布顯示1～6月份共1146株，占51%，其中以1月份構(gòu)成比最高，共791株，占35.2%。具體標(biāo)本分布見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)本類型菌株分布及構(gòu)成比[n(%)]Tab.1 Specimen type distribution and composition ratio[n(%)]

2.2 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2020年9 家醫(yī)院2244株Hi對(duì)9種抗生素的耐藥情況見(jiàn)表2。β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株和陰性株對(duì)9種抗生素的耐藥率比較見(jiàn)表3。呼吸道來(lái)源Hi菌株對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦鈉、頭孢呋辛、復(fù)方磺胺甲惡唑和阿奇霉素的耐藥率高于非呼吸道來(lái)源菌株(P＜0.01)，見(jiàn)表4。2244株Hi中，β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性1451例，占64.6%。β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性且氨芐西林舒巴坦耐藥536株，占23.9%。其中175株(7.7%)為β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥Hi(β-lactamase negative and ampicillin-resistant，BLNAR)，BLNAR菌株和β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株對(duì)9種抗生素的耐藥率比較見(jiàn)表5。

表2 2020年9家兒童醫(yī)院分離的2244株流感嗜血桿菌對(duì)9種抗生素耐藥情況Tab.2 Resistance of antibiotics against 2244 strains of H.influenzaeisolated from patients in 9 children's hospitals in 2020

表3 β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株和陰性株對(duì)9種抗生素的耐藥率比較Tab.3 Comparison of resistance rate of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae between β-lactamase positive isolates and negative isolates

表4 呼吸道來(lái)源與非呼吸道來(lái)源的Hi菌株對(duì)9種抗生素耐藥率比較Tab.4 Comparison of resistance rates of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae isolated from respiratory specimens and from non-respiratory specimens

表5 BLNAR菌株和β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株對(duì)9種抗生素的耐藥率比較Tab.5 Comparison of resistance rates of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae isolated between BLNAR and β-lactamase positive isolates

2.3 多重耐藥情況

所有菌株中耐3種及3種以上不同種類抗生素的多重耐藥菌株1293株，占57.6%。其中β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株和陰性株的多重耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，見(jiàn)表6。呼吸道來(lái)源和非呼吸道來(lái)源的Hi株多重耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，見(jiàn)表7。最常見(jiàn)的耐藥模式為耐氨芐西林、復(fù)方磺胺甲惡唑和阿奇霉素，共735株(56.8%)。同時(shí)耐氨芐西林、氯霉素、復(fù)方磺胺甲惡唑和阿奇霉素共11株，占多重耐藥株0.9%(11/1293)，同時(shí)耐氨芐西林、復(fù)方磺胺甲惡唑、阿奇霉素和左氧氟沙星共1株，占0.07%。

表6 β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株和陰性株的多重耐藥率比較Tab.6 Comparison of multidrug resistance rates between β-lactamase positive isolates and negative isolates

表7 呼吸道來(lái)源和非呼吸道來(lái)源的Hi株多重耐藥率比較Tab.7 Comparison of multidrug resistance rates against Haemophilus influenzae isolated from respiratory specimens and from non- respiratory specimens

3 討論

本組Hi的主要標(biāo)本來(lái)源為下呼吸道感染患兒的痰液標(biāo)本，與該菌是兒童社區(qū)獲得性肺炎最常見(jiàn)的細(xì)菌學(xué)病原吻合[3]。此外，3.47%的菌株來(lái)自有癥狀的陰道炎患兒的陰道拭子，提示該菌亦應(yīng)是青春前期女童外陰陰道感染的常見(jiàn)病原菌[6]，與Wang等[11]2016年的研究數(shù)據(jù)一致。本組侵襲性菌株少見(jiàn)，僅血流來(lái)源12株和腦脊液來(lái)源6株，提示該菌引起化膿性腦膜炎侵襲性感染的少見(jiàn)[5,13]，可能與Hi臨床株以無(wú)莢膜型為主，菌株侵襲力相對(duì)較弱有關(guān)。兒童Hi感染往往有明顯的季節(jié)性，不同地區(qū)或同一地區(qū)的不同年份，因氣候條件存在差異，該菌感染的高峰季節(jié)可能存在一定變遷，本組分離到Hi以1～6月份最多，與既往我國(guó)該菌的季節(jié)分布基本一致[11-12]。

10年前，日本和韓國(guó)的Hi對(duì)氨芐西林的耐藥程度遠(yuǎn)較中國(guó)嚴(yán)重，但之后他們的菌株對(duì)氨芐西林的耐藥率上升幅度并不大，多在70%以內(nèi)[9-10,14-15]，而本組耐藥性分析顯示，2020年的Hi菌株對(duì)氨芐西林的耐藥率已達(dá)72.1%，較2016年報(bào)道的58.1%有較大幅度上升[11]，值得高度關(guān)注，至于是否與耐藥克隆在地區(qū)克隆播散密切有關(guān)，有待對(duì)菌株進(jìn)行遺傳背景研究再明確。Hi對(duì)氨芐西林耐藥的機(jī)制有2種，分別是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶破壞抗生素和青霉素結(jié)合蛋白3(PBP3)突變導(dǎo)致與氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力下降(即BLNAR機(jī)制)，其中產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是我國(guó)Hi耐氨芐西林的主要機(jī)制[6,11-12]，而在本次研究中，β-內(nèi)酰胺酶陰性耐氨芐西林的菌株占7.7%，較呂志勇等[16]在2015—2019年對(duì)Hi耐藥性分析中β-內(nèi)酰胺酶陰性耐氨芐西林的菌株3%有大幅提升，提示BLNAR耐藥機(jī)制已不容忽視。此外，本研究發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率、多重耐藥率也顯著高于β-內(nèi)酰胺酶陰性菌株，其原因可能與流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的主要機(jī)制和對(duì)復(fù)方磺胺甲惡唑、氯霉素耐藥的機(jī)制均由質(zhì)粒介導(dǎo)，這些耐藥基因可整合在同一質(zhì)粒接合子上,從而導(dǎo)致聯(lián)合耐藥[17-18]。BLNAR因PBP突變，菌株對(duì)氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸耐藥。但本組中β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性的菌株中也有23.9%的對(duì)含酶抑制劑的復(fù)合制劑不敏感，這些產(chǎn)酶菌株耐氨芐西林/舒巴坦的機(jī)制，是否同時(shí)存在fts基因突變導(dǎo)致其編碼的PBP3的氨基酸序列改變所致，值得進(jìn)一步研究。

本研究Hi菌株對(duì)氨芐西林的耐藥率較國(guó)內(nèi)外以往研究結(jié)果均明顯升高，氨芐西林不再適用于首選臨床經(jīng)驗(yàn)治療用藥，但本研究Hi對(duì)氨芐西林/舒巴坦敏感率為65%，較氨芐西林、頭孢呋辛、復(fù)方磺胺甲惡唑、阿奇霉素敏感率高，且β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性且氨芐西林舒巴坦耐藥占23.9%，氨芐西林舒巴坦仍是可以選擇的藥物之一。Hi對(duì)第三代頭孢菌素頭孢噻肟和頭孢曲松敏感率高，對(duì)美羅培南的耐藥率僅為0.6%，與我國(guó)新型冠狀病毒肺炎流行前的研究數(shù)據(jù)大致一致[6,11-12]，提示對(duì)于兒童Hi感染，頭孢噻肟或頭孢曲松可作為首選用藥。而對(duì)于嚴(yán)重感染或者威脅生命的侵襲性Hi感染，可考慮使用美羅培南等碳?xì)涿瓜╊惪股豙19]。

Hi也可引起泌尿、生殖道感染，同一地區(qū)的同一人群中，Hi耐藥模式可因感染部位不同而存在較大差異。日本Deguchi等[20]比較呼吸道來(lái)源和泌尿道來(lái)源的Hi發(fā)現(xiàn)，呼吸道來(lái)源的Hi中BLNAR株構(gòu)成比明顯高于泌尿道菌株，而BLNAR正是日本Hi耐氨芐西林的主要機(jī)制。本研究組既往也曾對(duì)兒童呼吸道來(lái)源和陰道來(lái)源的Hi作過(guò)耐藥性比較，發(fā)現(xiàn)呼吸道菌株對(duì)氨芐西林、頭孢呋辛、克拉霉素、甲氧芐啶-磺胺甲基惡唑的耐藥率顯著高于陰道菌株[6]，與本多中心研究結(jié)果高度一致，提示對(duì)于Hi的抗感染治療，抗生素的選擇因感染部位不同而異。

Hi是一種條件致病菌，常寄居于人的上呼吸道，當(dāng)前社區(qū)及醫(yī)院對(duì)于兒童呼吸道感染在無(wú)細(xì)菌培養(yǎng)、無(wú)藥敏指導(dǎo)下抗生素應(yīng)用普遍廣泛，可能導(dǎo)致高度耐藥的定植Hi，本研究大多數(shù)菌株非無(wú)菌標(biāo)本，所以不能排除定植菌來(lái)源，且本次研究侵襲性菌株少見(jiàn)，僅18株，其中氨芐西林耐藥率為55%(10/18)，王高良等[21]研究?jī)和忠u性Hi感染提示其氨芐西林耐藥率為48%，可見(jiàn)侵襲株耐藥率反而低。

本研究的局限是，大多數(shù)菌株為非無(wú)菌標(biāo)本來(lái)源，不能排除定植菌來(lái)源，Hi是否為引起患兒感染的病原需結(jié)合臨床分析；另外未能對(duì)分離到的Hi菌株進(jìn)行血清分型。隨著Hib疫苗的廣泛接種，nontypableHaemophilus influenzae(NTHi)成為全球Hi疾病常見(jiàn)的菌型[22]。NTHi產(chǎn)生β-內(nèi)酰酶的幾率高于有莢膜的菌型，同時(shí)開展耐藥性監(jiān)測(cè)、耐藥機(jī)制和血清分型研究是研究者今后努力的方向。