楊惠毛，田治文，范利華

（浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 紹興 312500）

目前，市場(chǎng)上非終端滅菌產(chǎn)品越來(lái)越多，各國(guó)對(duì)無(wú)菌工藝驗(yàn)證的要求也越來(lái)越高。2016年至2018年，山東省共完成無(wú)菌制劑《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）認(rèn)證94家/次，其中非最終滅菌產(chǎn)品企業(yè)54家/次，占57.45%[1］。即使所有與產(chǎn)品無(wú)菌性有關(guān)的設(shè)備部件、容器及原料都經(jīng)過(guò)有效的滅菌處理，仍有可能因各種原因?qū)е庐a(chǎn)品被污染，產(chǎn)品無(wú)菌性得不到保證。故無(wú)菌生產(chǎn)工藝的無(wú)菌性評(píng)估驗(yàn)證必須從整體考慮，其中培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)是有效的方法。2010年修訂版GMP無(wú)菌藥品第四十七條要求：“無(wú)菌生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證應(yīng)當(dāng)包括培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)?！盵2］《藥品GMP指南（無(wú)菌藥品）》要求，“為確保無(wú)菌產(chǎn)品的無(wú)菌性，滅菌和無(wú)菌灌封工藝須經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證”“應(yīng)采用培養(yǎng)基代替藥品進(jìn)行灌裝對(duì)無(wú)菌工藝進(jìn)行驗(yàn)證”[3］?；诟黜?xiàng)法規(guī)和車(chē)間實(shí)際情況，為確認(rèn)一個(gè)新的設(shè)施、生產(chǎn)線或工藝的凍干粉針車(chē)間，會(huì)進(jìn)行至少3次連續(xù)成功的無(wú)菌工藝模擬（APS），并每6個(gè)月進(jìn)行1次持續(xù)工藝評(píng)估[3］，每次至少1批，作為對(duì)無(wú)菌操作人員衛(wèi)生水平及無(wú)菌操作水平的檢定。故本研究中從培養(yǎng)基選擇、影響因素考察、試驗(yàn)過(guò)程及試驗(yàn)結(jié)果等方面對(duì)培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)展開(kāi)研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 驗(yàn)證前準(zhǔn)備

1.1 相關(guān)設(shè)備及其工藝均應(yīng)事先通過(guò)確認(rèn)或驗(yàn)證[4］

潔凈生產(chǎn)區(qū)環(huán)境須通過(guò)靜態(tài)驗(yàn)證，空氣的懸浮粒子、浮游菌、沉降菌及表面微生物均應(yīng)符合相應(yīng)規(guī)定；所用物料（西林瓶、膠塞、鋁蓋）通過(guò)相關(guān)滅菌驗(yàn)證；主要生產(chǎn)設(shè)備（灌裝壓塞機(jī)、無(wú)菌隔離器等），以及與生產(chǎn)相關(guān)的其他輔助工藝（濕熱滅菌、干熱滅菌等）均通過(guò)確認(rèn)或驗(yàn)證；操作人員的操作行為需經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn)，并通過(guò)考核。

1.2 培養(yǎng)基選擇與微生物生長(zhǎng)性能

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）液體培養(yǎng)基均適用于培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)[4］，故初步選定3%TSB液體培養(yǎng)基作為模擬灌裝用培養(yǎng)基。為使其能充分適用于本生產(chǎn)車(chē)間，參考文獻(xiàn)[5］制訂《潔凈區(qū)厭氧菌測(cè)試方案》，以檢測(cè)車(chē)間生產(chǎn)環(huán)境中的微生物。依據(jù)潔凈區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)規(guī)程，由專(zhuān)業(yè)人員對(duì)潔凈區(qū)的沉降菌、浮游菌和表面微生物進(jìn)行取樣和監(jiān)測(cè)。微生物按基因測(cè)序方法鑒定，細(xì)菌按16S rDNA方法鑒定，真菌按rDNA-ITS擴(kuò)增法鑒定，結(jié)果所有采集到的微生物均可在TSB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，故確定本次APS試驗(yàn)的培養(yǎng)基為T(mén)SB液體培養(yǎng)基。其中，腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、土壤羅斯氏菌、沃氏葡萄球菌、科氏葡萄球菌均為需氧菌或兼性厭氧菌，耐冷假單胞菌為需氧菌。

2 APS試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.1 最差條件選擇

《無(wú)菌工藝模擬試驗(yàn)指南》中規(guī)定：“最差條件并不是指人為創(chuàng)造的超出允許范圍的生產(chǎn)狀況和環(huán)境。為了確認(rèn)無(wú)菌工藝風(fēng)險(xiǎn)控制的有效性，應(yīng)通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并結(jié)合無(wú)菌生產(chǎn)工藝、設(shè)備裝備水平、人員數(shù)量和干預(yù)等因素來(lái)設(shè)計(jì)模擬試驗(yàn)最差條件?！盵6］美國(guó)注射劑協(xié)會(huì)（PDA）發(fā)布的Process Simulation for Aseptically Filled Products規(guī)定：“應(yīng)對(duì)預(yù)期的干預(yù)進(jìn)行評(píng)估，以確定微生物風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)量和對(duì)產(chǎn)品或工藝的影響。由于干預(yù)的復(fù)雜性和執(zhí)行頻率，對(duì)產(chǎn)品及工藝會(huì)產(chǎn)生較高的風(fēng)險(xiǎn)，APS試驗(yàn)中的干預(yù)應(yīng)高于正常頻率?！惫蔬M(jìn)行APS試驗(yàn)最差參數(shù)選擇和干預(yù)操作選擇，并進(jìn)行最差條件挑戰(zhàn)。詳見(jiàn)表1和表2。

表1 無(wú)菌工藝模擬試驗(yàn)最差參數(shù)選擇Tab.1 Selection of the worst parameters of the APS test

表2 無(wú)菌工藝模擬試驗(yàn)干預(yù)操作選擇[7］Tab.2 Selection of the intervention operations of the APS test[7］

2.2 APS試驗(yàn)

APS試驗(yàn)操作流程見(jiàn)圖1。具體操作如下。

圖1 無(wú)菌工藝模擬試驗(yàn)操作流程Fig.1 Operation flow of the APS test

無(wú)菌培養(yǎng)基配制：配制3%TSB液體培養(yǎng)基，按30 g TSB凍干粉配制成1 000 g TSB液體培養(yǎng)基比例配制。按比例取一定量的注射用水置配制罐中，并冷卻至30～35℃。按比例稱(chēng)取TSB凍干粉，溶于配制罐中，攪拌溶解，pH控制為7.3±0.2，經(jīng)0.45μm和0.20μm濾芯過(guò)濾后進(jìn)入無(wú)菌儲(chǔ)罐。最差條件的存放時(shí)限后經(jīng)終端0.20μm除菌濾芯過(guò)濾至高位罐，進(jìn)行無(wú)菌灌裝加塞操作。

無(wú)菌培養(yǎng)基灌裝：培養(yǎng)基灌裝過(guò)程按產(chǎn)品生產(chǎn)工藝操作要求進(jìn)行模擬，按表1模擬最差的灌裝條件和表2模擬固有干預(yù)操作和糾正性干預(yù)操作，并確保所有模擬干預(yù)操作在培養(yǎng)基藥液灌裝時(shí)進(jìn)行?；陲L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估設(shè)計(jì)，將所有灌裝半壓塞好的培養(yǎng)基藥液運(yùn)送至凍干箱，并平均分布于凍干箱上、中、下板層上[6］。整個(gè)灌裝過(guò)程中的剔廢品應(yīng)全部編號(hào)并拍照。由質(zhì)量管理人員對(duì)無(wú)菌隔離器中的整個(gè)灌裝過(guò)程進(jìn)行全程觀察，并詳細(xì)記錄灌裝過(guò)程中灌裝崗位人員非計(jì)劃性操作情況。且對(duì)整個(gè)模擬灌裝過(guò)程進(jìn)行全程攝像，便于后續(xù)分析和解決問(wèn)題。

凍干壓塞：樣品全部進(jìn)入凍干箱后，關(guān)好凍干機(jī)小門(mén)，對(duì)凍干箱抽真空至0.05 MPa[8］，存放于凍干機(jī)內(nèi)模擬凍干時(shí)間，關(guān)閉蘑菇閥和抽真空系統(tǒng)，用經(jīng)除菌過(guò)濾的壓縮空氣破空后再次抽真空至0.05 MPa，關(guān)閉抽真空系統(tǒng)，壓塞后破空。

軋蓋：對(duì)從凍干箱出來(lái)的培養(yǎng)基灌裝產(chǎn)品進(jìn)行軋蓋。軋蓋前剔廢的未加塞西林瓶及完整性有缺陷的西林瓶（如西林瓶破裂、漏液）均不送最終培養(yǎng)，但必須每瓶編號(hào)并拍照，根據(jù)剔廢原因標(biāo)記。

培養(yǎng)與檢查：充分搖晃待培養(yǎng)品（確保接觸西林瓶?jī)?nèi)表面）后，倒立放置，于20～25℃培養(yǎng)室內(nèi)至少培養(yǎng)7d；觀察后，正放置于30～35℃的培養(yǎng)室內(nèi)至少培養(yǎng)7 d[9］。檢查須由具有資質(zhì)的人員執(zhí)行，如中途檢查在培養(yǎng)室外進(jìn)行，應(yīng)對(duì)檢查時(shí)間進(jìn)行補(bǔ)償，保證培養(yǎng)的總時(shí)間。在檢查和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，若出現(xiàn)意外碎瓶，應(yīng)拍照并記錄[10］。培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)的目標(biāo)遵循EU GMPAnnex 1：Manufacture of Sterile Products DRAFT 20200220提出的“目標(biāo)應(yīng)為無(wú)微生物生長(zhǎng)。任何被污染的單元應(yīng)致使工藝模擬失敗”。

培養(yǎng)基培養(yǎng)后促生長(zhǎng)試驗(yàn)：對(duì)培養(yǎng)至少14 d結(jié)束后的樣品取樣并進(jìn)行促生長(zhǎng)試驗(yàn)，采用2020年版《中國(guó)藥典（三部）》要求的5種標(biāo)準(zhǔn)菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌）進(jìn)行促生長(zhǎng)測(cè)試。此外，采用環(huán)境分離菌進(jìn)行促生長(zhǎng)測(cè)試，環(huán)境分離菌篩選原則有，選取日常環(huán)境監(jiān)測(cè)中典型的微生物及出現(xiàn)頻率較高的微生物；盡可能從關(guān)鍵區(qū)域回收的微生物中選用，如灌裝間等；特定環(huán)境菌從近期收集到的微生物中選取，盡量在近6個(gè)月內(nèi)，最長(zhǎng)不超過(guò)12個(gè)月。依據(jù)《美國(guó)藥典43版》1113、2020年版《中國(guó)藥典（四部）》9204微生物鑒定指導(dǎo)意見(jiàn)和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，本車(chē)間每6個(gè)月對(duì)回收的微生物樣本進(jìn)行鑒定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 潔凈區(qū)微生物鑒定結(jié)果Tab.3 Results of microbial identification in the clean area

環(huán)境監(jiān)測(cè)與模擬灌裝后清洗：對(duì)整個(gè)模擬灌裝過(guò)程進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)，確保潔凈區(qū)的環(huán)境在動(dòng)態(tài)中符合GMP要求。模擬灌裝結(jié)束后，按車(chē)間相關(guān)清潔規(guī)程對(duì)設(shè)備進(jìn)行清潔，分別用淋洗法和擦拭法對(duì)設(shè)備淋洗水和設(shè)備表面進(jìn)行取樣，進(jìn)行殘留、微生物限度、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)[11］，以確定不會(huì)對(duì)下次生產(chǎn)產(chǎn)生影響。

2.3 APS試驗(yàn)結(jié)果

本次APS試驗(yàn)中，灌裝完成的產(chǎn)品均無(wú)微生物生長(zhǎng)；且對(duì)培養(yǎng)14 d后的樣品進(jìn)行微生物促生長(zhǎng)試驗(yàn)，科氏葡萄球菌、藤黃微球菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、膠紅酵母菌、奧斯陸莫拉氏菌和耐鹽枝孢菌6種環(huán)境分離菌均生長(zhǎng)良好。表明本次APS試驗(yàn)成功，該批操作人員按此生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品無(wú)菌性可靠。

3 討論

該凍干車(chē)間基于2010年版GMP無(wú)菌藥品附錄、PDA發(fā)布的Process Simulation for Aseptically Filled Products等法規(guī)和指導(dǎo)性技術(shù)報(bào)告，對(duì)整個(gè)生產(chǎn)工藝、設(shè)備、人員、物料、環(huán)境等多個(gè)系統(tǒng)，以及無(wú)菌過(guò)程中產(chǎn)品可能易于被微生物污染的潛在薄弱環(huán)節(jié)進(jìn)行APS試驗(yàn)，結(jié)果所有灌裝完成的產(chǎn)品都達(dá)到了零污染的目標(biāo)，符合高標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌保證?？梢?jiàn)，該凍干車(chē)間在工程設(shè)計(jì)、生產(chǎn)控制、活動(dòng)干預(yù)、質(zhì)量體系、人員培訓(xùn)、書(shū)面規(guī)程、環(huán)境控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面均嚴(yán)格遵守了無(wú)菌技術(shù)，可保障無(wú)菌制劑產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程的無(wú)菌性，確保無(wú)菌制劑的安全性。本研究結(jié)果對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義，是日常生產(chǎn)操作的依據(jù)，有助于實(shí)現(xiàn)與國(guó)際醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的接軌。