王杠杠，王似錦，馬仕洪

（中國食品藥品檢定研究院·化學藥品質(zhì)量研究與評價重點實驗室，北京 100050）

水分活度（Aw）對于評價藥品中微生物污染和增殖的風險具有重要意義[1-4］。Aw是指在相同溫度下，產(chǎn)品的蒸氣壓與純水的蒸氣壓的比值乘以100，即為等效相對濕度[5］。1957年，澳大利亞科學家SCOTT提出影響微生物生長的是Aw而非水分含量，每種微生物都存在最低生長Aw，低于該限值微生物將不能生長[6］。20世紀80年代，美國食品藥物管理局（FDA）在食品生產(chǎn)中采用Aw檢測對微生物進行控制，《美國藥典》（USP）第29版也于2006年8月正式頒布＜1112＞Aw測定在非無菌藥品上的應用，指出測量非無菌藥品的Aw有助于優(yōu)化處方，提高防腐體系的抑菌效果，降低處方（尤其是液體、膏、乳液和霜）受微生物污染的風險，并收錄了代表微生物的最低生長Aw[7］。近年來，國內(nèi)報道了部分制藥行業(yè)代表性微生物生長所需的最低Aw[8-12］。黑根霉（Rhizopus stolonifer，曾用名Rhyzopus nigricans）又名匍枝根霉，是導致物質(zhì)腐爛變質(zhì)的常見污染菌。20世紀40年代，有學者研究了環(huán)境濕度對黑根霉孢子萌發(fā)的影響[13］。USP＜1112＞中收錄的黑根霉最低生長Aw為0.93，但黑根霉在低于該Aw的條件下仍可生長[14-15］。為驗證USP＜1112＞中收錄的黑根霉最低Aw的準確性，本研究中選取1株黑根霉標準菌株作為研究對象，分別于氯化鈉、甘油、蔗糖調(diào)節(jié)的不同Aw條件下培養(yǎng)，并觀察菌落變化，分析不同調(diào)節(jié)劑作用下Aw對黑根霉生長的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：黑根霉（Rhizopus stolonifer）CGMCC 3.10。

試劑與培養(yǎng)基：氯化鈉（美國Sigma公司，批號為SZBE0490V）；甘油（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20180401）；蔗糖（北京糖業(yè)煙酒集團有限公司，批號為20181011）；沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基（美國BD公司，批號為7135844）；S-Pak濾膜（美國Millipore公司，批號為F7EA83802）。

儀器：Aqualab 4TE Duo型水分活度測定儀（Decagon Devices公司，準確度為±0.003）；BJ-2202S型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 g）；NU-534-400S型生物安全柜（Nuaire公司）；INC821C復合型低溫恒溫培養(yǎng)箱（Yamato公司）。

1.2 方法

培養(yǎng)基制備：以氯化鈉、甘油、蔗糖為調(diào)節(jié)劑，配制一系列不同Aw梯度的SDA培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻凝固，測量溫度為25℃時的Aw。參考USP＜1112＞表1[7］中黑根霉最低生長Aw，調(diào)節(jié)SDA培養(yǎng)基最高Aw為0.94，向下每個Aw梯度相差0.01。同時配制不加調(diào)節(jié)劑的SDA培養(yǎng)基作為對照組（control）。

孢子懸液制備與預培養(yǎng)：按2020年版《中國藥典（四部）》[16］要求，制備104cfu/mL的黑根霉孢子懸液。無菌操作，將濾膜正面朝上，貼于未調(diào)節(jié)Aw的SDA培養(yǎng)基上，取2.5μL孢子懸液點植于濾膜中心位置，22.5℃溫度下預培養(yǎng)24 h。

轉(zhuǎn)移及觀察：測量并記錄預培養(yǎng)后的菌落直徑，作為初始大小。將菌落連同濾膜轉(zhuǎn)移至制備好的不同梯度Aw的SDA培養(yǎng)基上，置用甘油調(diào)節(jié)的相同Aw環(huán)境的密閉容器中，22.5℃溫度下培養(yǎng)21 d，每天測量菌落直徑（垂直測量2次，取平均值），觀察并記錄菌落變化。以菌落直徑增長（mm）對培養(yǎng)時間（d）作線性圖，繪制黑根霉菌落生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 黑根霉最低生長Aw

黑根霉在氯化鈉、甘油、蔗糖調(diào)節(jié)的不同Aw條件下的生長曲線見圖1。氯化鈉組，Aw＜0.93時黑根霉無生長跡象；Aw=0.94，0.93時，培養(yǎng)1 d菌落直徑有小幅度增加，可能原因是濾膜轉(zhuǎn)移時帶有少量原培養(yǎng)基，為黑根霉生長提供養(yǎng)分，故時間不能作為該Aw條件下的開始生長時間。菌落直徑自第2天停止增長，持續(xù)一段時間后再繼續(xù)增長，此時黑根霉生長養(yǎng)分來源為轉(zhuǎn)移后的培養(yǎng)基，為該Aw條件下的開始生長時間。甘油組與蔗糖組，在Aw較低時，黑根霉由原菌落中心部位開始生長，并非由原菌落菌絲直接向外擴張，故生長早期菌落直徑無變化。甘油組，Aw＜0.87時黑根霉無生長跡象。蔗糖組，Aw＜0.86時黑根霉無生長跡象；Aw=0.87，0.86時，肉眼可見有生長活動，但生長菌落未超過原有菌落范圍，故直徑增長計為0（圖2）。由此得到不同調(diào)節(jié)劑作用下黑根霉最低生長Aw，氯化鈉組為0.93，甘油組為0.87，蔗糖組為0.86。與氯化鈉相比，以甘油和蔗糖作為調(diào)節(jié)劑時，黑根霉可在更低Aw條件下生長。

2.2 Aw對黑根霉生長的影響

高于最低生長Aw的條件下，黑根霉經(jīng)過一段時間的停滯期后，菌落直徑基本呈直線增長，直至長滿培養(yǎng)皿或試驗結(jié)束。以開始生長時間（d）、產(chǎn)孢時間（d）、生長速率（mm/d）為指標，評價Aw對黑根霉生長的影響。黑根霉不同Aw條件下的開始生長時間及產(chǎn)孢時間見表1?？梢?，隨著Aw的下降，黑根霉開始生長時間、產(chǎn)孢時間均推遲；Aw較高時，黑根霉通常于開始生長后第2～3天產(chǎn)孢；Aw越低，產(chǎn)孢時間較開始生長時間推遲越多，Aw低于一定程度時黑根霉不能產(chǎn)孢。甘油作為調(diào)節(jié)劑時，Aw＜0.89時黑根霉不能產(chǎn)孢；蔗糖作為調(diào)節(jié)劑時，Aw＜0.88黑根霉不能產(chǎn)孢。

表1 不同Aw條件下黑根霉開始生長時間和產(chǎn)孢時間Tab.1 Beginning growth time and sporulation time of Rhizopus nigricans under different Aw

取生長曲線開始生長后的部分進行線性擬合，所得斜率即為該生長條件下黑根霉的生長速率（mm/d）。由圖3可見，氯化鈉組生長速率在7～63 mm/d之間，甘油組與蔗糖組生長速率在1～63 mm/d之間。不同調(diào)節(jié)劑作用下、Aw對生長速率的影響基本一致，隨Aw的降低而下降。氯化鈉組和甘油組Aw與生長速率大致呈線性關(guān)系。蔗糖組在Aw=0.91時曲線出現(xiàn)明顯拐點，Aw＜0.91時Aw對黑根霉生長速率的影響減弱。

圖3 Aw對黑根霉生長速率的影響Fig.3 Effect of Aw on the growth rate of Rhizopus nigricans

3 討論

圖1及圖3顯示，隨著Aw的降低，黑根霉開始生長時間、產(chǎn)孢時間均推遲，生長速率下降；黑根霉在不同調(diào)節(jié)劑作用下最低生長Aw分別為0.93（氯化鈉）、0.87（甘油）、0.86（蔗糖），差異明顯。其中，氯化鈉組結(jié)果與USP＜1112＞結(jié)果一致，甘油組及蔗糖組結(jié)果更低。

USP＜1112＞結(jié)果源自1949年SNOW[13］的研究，其研究對象為環(huán)境分離菌株，培養(yǎng)基為浸泡過啤酒麥芽汁的明膠，干燥后接種黑根霉孢子，置用硫酸溶液調(diào)節(jié)的不同濕度的25℃密閉環(huán)境中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況。與本研究中所使用的判斷是否生長的標準及調(diào)節(jié)Aw的方式有區(qū)別。

2011年，AMIRI等[15］報道了在使用氯化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基Aw的條件下，黑根霉孢子萌發(fā)所需Aw（最低為0.908）低于菌絲生長Aw（最低為0.936），與本研究中氯化鈉組的結(jié)果一致。HOCKING等[14］使用葡萄糖和果糖調(diào)節(jié)培養(yǎng)基Aw，得到的黑根霉孢子萌發(fā)最低Aw為0.84?？紤]菌絲萌發(fā)需要Aw環(huán)境更高，認為與本研究中蔗糖組的結(jié)果基本一致。

SNOW[13］通過調(diào)節(jié)環(huán)境濕度來調(diào)節(jié)Aw的方式，在實際產(chǎn)品生產(chǎn)及儲存過程中需要較長的平衡過程。在食品及制藥工業(yè)中，通常通過控制處方及工藝調(diào)節(jié)產(chǎn)品Aw，本研究中采用直接添加調(diào)節(jié)劑至培養(yǎng)基中，更貼近產(chǎn)品生產(chǎn)及儲存的實際情況，對于控制黑根霉污染、防止產(chǎn)品腐爛變質(zhì)更有參考意義。且Aw調(diào)節(jié)劑種類對黑根霉生長有較大影響，提醒生產(chǎn)企業(yè)在選擇添加不同種類的Aw調(diào)節(jié)劑時應設(shè)定不同Aw標準，以更有效地降低藥品微生物污染風險。