肖 江，王 輝，帥海濤，章澤恒，黃致遠(yuǎn)

（1.湖南省藥用輔料工程技術(shù)研究中心有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410331；2.國(guó)家藥用輔料工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410331；3.湖南省藥品審評(píng)認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

對(duì)乙酰氨基酚又稱撲熱息痛，化學(xué)名為4'-羥基乙酰苯胺，為乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床廣泛用于治療各種輕、中度疼痛及兒童的發(fā)熱疾病[1-4］。對(duì)乙酰氨基酚于1878年在約翰·霍普金斯大學(xué)首次合成，1951年在美國(guó)獲批上市，1955年成為非處方藥，并成為世界上應(yīng)用最廣的解熱鎮(zhèn)痛藥。我國(guó)最早于1960年開(kāi)始生產(chǎn)[5］。目前，2020年版《中國(guó)藥典》[6］、《歐洲藥典》10.0版[7］和《美國(guó)藥典》40版[8］均收載了對(duì)乙酰氨基酚的有關(guān)物質(zhì)檢查方法，除對(duì)氨基酚與對(duì)氯苯乙酰胺采用外標(biāo)法測(cè)定外，其他雜質(zhì)均采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定。根據(jù)對(duì)乙酰氨基酚的合成工藝推測(cè)，原料藥中潛在的雜質(zhì)有雜質(zhì)A-I和雜質(zhì)L-N，均含有基因毒性雜質(zhì)的潛在結(jié)構(gòu)[9］。雜質(zhì)L-N為《歐洲藥典》10.0版中新增雜質(zhì)[8，10］，雜質(zhì)L由苯酚氯代產(chǎn)生的副產(chǎn)物雜質(zhì)C與對(duì)乙酰氨基酚聚合而成，雜質(zhì)M和雜質(zhì)N分別為對(duì)氨基酚和對(duì)乙酰氨基酚在酸性高溫條件下形成的聚合物。對(duì)氨基酚和對(duì)氯苯乙酰胺均為毒性雜質(zhì)，具有潛在的基因毒性[11-12］。目前，關(guān)于乙酰氨基酚原料藥及制劑有關(guān)物質(zhì)的研究多為對(duì)氨基酚、對(duì)氯苯乙酰胺、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F，對(duì)大部分潛在雜質(zhì)未開(kāi)展系統(tǒng)性研究，且對(duì)國(guó)內(nèi)制劑的質(zhì)量也未進(jìn)行考察[11-17］。本研究中在各國(guó)藥典方法的基礎(chǔ)上建立了一種帶校正因子的主成分自身對(duì)照法，對(duì)國(guó)內(nèi)多個(gè)廠家的對(duì)乙酰氨基酚片與參比制劑進(jìn)行了雜質(zhì)對(duì)比研究，并根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典（四部）》[18］和國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）指導(dǎo)原則Validation of Analytical Procedures：Text and Methodology Q2（R1）進(jìn)行了全面的方法學(xué)考察?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配有紫外檢測(cè)器；XS-205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為十萬(wàn)分之一）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200W，頻率為40kHz）；Milli-Q型超純水制水機(jī)（德國(guó)默克密理博公司）。

1.2 試藥

對(duì)乙酰氨基酚片（12批，規(guī)格均為每片0.5 g），樣品信息及生產(chǎn)廠家見(jiàn)表1；有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品信息見(jiàn)表2（雜質(zhì)A-I和雜質(zhì)L-N由TLC Pharmaceutical Standards公司提供；對(duì)氨基酚，對(duì)氯苯乙酰胺，對(duì)乙酰氨基酚由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）；冰醋酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）；水為超純水。

表1 對(duì)乙酰氨基酚片樣品信息及生產(chǎn)廠家Tab.1 Information and manufacturers of Paracetamol Tablets samples

表2 有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品信息Tab.2 Information of references of related substances

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Xbridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%冰醋酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（程序見(jiàn)表3）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。在此色譜條件下的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.3 Program of gradient elution of mobile phase（%）

表4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the system suitability test

2.2 溶液制備

取甲醇150 mL，加水850 mL，混勻，作為稀釋劑。

取對(duì)乙酰氨基酚片，研磨成粉，取細(xì)粉適量（相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚100 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋并定容，振搖使溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

取供試品溶液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋并定容；取1.0 mL，置20 mL容量瓶中，再次用稀釋劑稀釋并定容，搖勻，即得自身對(duì)照溶液。

取有關(guān)物質(zhì)對(duì)氨基酚、對(duì)氯苯乙酰胺、雜質(zhì)A-I和雜質(zhì)L-N對(duì)照品各適量，精密稱定，加稀釋劑制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。取混合對(duì)照品貯備液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加稀釋劑稀釋并定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

取對(duì)氨基酚對(duì)照品5 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋并定容；取1.0 mL，置100 mL容量瓶中，再次用稀釋劑稀釋并定容，搖勻，即得對(duì)氨基酚對(duì)照品溶液。

取對(duì)氯苯乙酰胺對(duì)照品溶液5 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋并定容；取1.0 mL，置200 mL容量瓶中，再次用稀釋劑稀釋并定容，搖勻，即得對(duì)氯苯乙酰胺對(duì)照品溶液。

2.3 測(cè)定方法

精密量取2.2項(xiàng)下供試品溶液與各對(duì)照品溶液適量，分別注入高效液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算對(duì)氨基酚與對(duì)氯苯乙酰胺的含量，以加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算其他雜質(zhì)的含量。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液和混合對(duì)照品溶液各適量，置同一容量瓶中，混勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）?？梢?jiàn)，對(duì)乙酰氨基酚色譜峰與各有關(guān)物質(zhì)色譜峰均能達(dá)到基線分離，且分離度良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關(guān)系考察與相對(duì)校正因子：取對(duì)乙酰氨基酚和有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品各適量，精密稱定，配制系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、各成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并按主成分線性方程的斜率比各雜質(zhì)線性方程的斜率計(jì)算相對(duì)校正因子。結(jié)果見(jiàn)表5。

定量限與檢測(cè)限確定：取2.2項(xiàng)下稀釋劑，待儀器平衡后注入色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄基線噪音，根據(jù)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中各雜質(zhì)的峰高逐級(jí)稀釋，至信噪比（S/N）分別為10±1和3±1，得到各雜質(zhì)的定量限和檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 方法學(xué)考察結(jié)果與相對(duì)校正因子Tab.5 Results of the methodological investigation and RCFs

中間精密度試驗(yàn)：在同一實(shí)驗(yàn)室，由不同實(shí)驗(yàn)員在不同日期進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果的RSD均小于4.0%，表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液與混合對(duì)照品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果供試品溶液與混合對(duì)照品溶液中各有關(guān)物質(zhì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=5），表明供試品溶液與對(duì)照品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取對(duì)乙酰氨基酚片，研磨成粉，取細(xì)粉適量（相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚100 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液1.0 mL，用稀釋劑稀釋并定容，振搖，濾過(guò)，取續(xù)濾液，平行6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，按2.3項(xiàng)下方法計(jì)算。結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取對(duì)乙酰氨基酚片，研磨成粉，取細(xì)粉適量（相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚100 mg），精密稱定，共9份，置10 mL容量瓶中，分別加入80%，100%，120%限度的雜質(zhì)A-I、雜質(zhì)L-N、對(duì)氨基酚、對(duì)氯苯乙酰胺對(duì)照品，各3份，用稀釋劑稀釋并定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表5。

破壞試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液，在酸（1 mol/L鹽酸溶液2 mL破壞2 h）、堿（1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL破壞2 h）、高溫（90℃水浴破壞2 h）、氧化（30%過(guò)氧化氫溶液2 mL破壞2 h）及光照（4 500 lx破壞2 h）條件下進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)。結(jié)果對(duì)乙酰氨基酚在酸、堿、氧化及光照條件下，降解過(guò)程中均未產(chǎn)生新的雜質(zhì)；高溫條件下降解產(chǎn)生了新的雜質(zhì)，各雜質(zhì)峰均基線分離，表明方法專屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Paracetamol 2.Impurity B 3.Unknown impurity 4.Impurity G 5.Impurity H a.Destroyed by high temperature b.No destroying c.Destroyed by acid d.Destroyed by alkali e.Destroyed by oxidation f.Destroyed by lightFig.2 HPLC chromatograms of the destructive test

耐用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液與混合對(duì)照品溶液各適量，分別考察不同批次色譜柱，不同柱溫（25，30，35℃），不同流速（0.7，0.8，0.9 mL/min）和不同檢測(cè)波長(zhǎng)（250，254，258 nm）條件下各有關(guān)物質(zhì)的分離度。結(jié)果各有關(guān)物質(zhì)色譜峰的分離度均大于1.5，含量的RSD均小于4.0%，表明方法耐用性良好。

2.5 樣品有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

取12批（編號(hào)為Ⅰ-Ⅻ）樣品各適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按2.3項(xiàng)下方法計(jì)算各樣品中有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果12批不同廠家的樣品中14個(gè)有關(guān)物質(zhì)含量為0.008 0%～0.070 4%。對(duì)乙酰氨基酚片參比制劑（編號(hào)為Ⅰ）中檢出雜質(zhì)B與雜質(zhì)H；國(guó)內(nèi)11批（編號(hào)為Ⅱ-Ⅻ）對(duì)乙酰氨基酚片中檢出對(duì)氨基酚、雜質(zhì)A-D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)H、雜質(zhì)L、雜質(zhì)N，均未檢出對(duì)氯苯乙酰胺、雜質(zhì)E、雜質(zhì)G、雜質(zhì)I、雜質(zhì)M。詳見(jiàn)表6。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

《歐洲藥典》10.0版中關(guān)于對(duì)乙酰氨基酚有關(guān)物質(zhì)的分析較全面，但以HALO-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7μm）為色譜柱時(shí)雜質(zhì)A與雜質(zhì)B未能完全分離。由于色譜柱內(nèi)徑及粒徑較小，液相色譜儀的柱壓較高，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)儀器造成不良影響，且色譜柱的使用壽命不佳。調(diào)整色譜柱為Xbridge-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為純化水-甲醇，但僅能分離13個(gè)雜質(zhì)，且對(duì)氨基酚與對(duì)乙酰氨基酚的色譜峰峰形稍有拖尾，影響樣品測(cè)定的準(zhǔn)確性。最終將流動(dòng)相調(diào)整為0.1%冰醋酸水溶液-甲醇，分離效果良好。

3.2 測(cè)定和計(jì)算方法選擇

除對(duì)氨基酚與對(duì)氯苯乙酰胺外，國(guó)內(nèi)外藥典均采用自身對(duì)照法測(cè)定其他雜質(zhì)的含量。但雜質(zhì)A-F、雜質(zhì)H-I、雜質(zhì)L-M的相對(duì)校正因子分別為1.15，1.27，1.26，1.48，2.79，1.24，1.33，1.27，1.84，2.13，均不在0.9～1.1范圍內(nèi)，應(yīng)采用更合理的帶相對(duì)校正因子的自身對(duì)照法進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算，以保障雜質(zhì)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.3 雜質(zhì)限度確認(rèn)

2020年版《中國(guó)藥典》、《歐洲藥典》10.0版和《美國(guó)藥典》40版中均有收載對(duì)乙酰氨基酚有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，其中《歐洲藥典》10.0版中有關(guān)物質(zhì)限度最嚴(yán)格。由表6可知，12家企業(yè)的對(duì)乙酰氨基酚片中的有關(guān)物質(zhì)的含量均未超標(biāo)。參照《歐洲藥典》10.0版制訂對(duì)乙酰氨基酚片有關(guān)物質(zhì)限度，即對(duì)氨基酚不得過(guò)0.005%，對(duì)氯苯乙酰胺不得過(guò)0.001%，雜質(zhì)A-I與雜質(zhì)L-N均不得過(guò)0.05%，總雜質(zhì)不得過(guò)0.2%。

3.4 樣品中雜質(zhì)來(lái)源分析

由于對(duì)乙酰氨基酚一般以對(duì)硝基苯酚為原料，還原為對(duì)氨基苯酚后經(jīng)乙?；频茫渲袑?duì)硝基苯酚由氯苯經(jīng)硝化反應(yīng)制得。由表6可知，對(duì)乙酰氨基酚片中有關(guān)物質(zhì)檢出量大于0.01%的雜質(zhì)主要為雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)H。其中，雜質(zhì)A為對(duì)硝基苯酚原料中鄰硝基苯酚導(dǎo)致的雜質(zhì)，雜質(zhì)B為丙?；s質(zhì)，雜質(zhì)C由對(duì)硝基氯苯原料氯苯中的鄰二氯苯引入，雜質(zhì)H為對(duì)氨基苯酚過(guò)度乙酰化產(chǎn)生。樣品（編號(hào)Ⅰ）為仿制藥一致性評(píng)價(jià)的參比制劑，其雜質(zhì)含量明顯低于國(guó)內(nèi)大部分制劑。可見(jiàn)，對(duì)乙酰氨基酚片中有關(guān)物質(zhì)主要來(lái)源于原料藥合成過(guò)程中引入的雜質(zhì)，并非由存儲(chǔ)環(huán)境或輔料導(dǎo)致，故應(yīng)從源頭對(duì)原料藥的質(zhì)量進(jìn)行控制，以提升制劑的質(zhì)量。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了有效檢測(cè)對(duì)乙酰氨基酚片中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法，方法專屬性強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確度均高，可有效分離14種有關(guān)物質(zhì)及主成分；并考察了市售對(duì)乙酰氨基酚片及仿制藥一致性評(píng)價(jià)參比制劑的有關(guān)物質(zhì)，可為相關(guān)生產(chǎn)廠家及檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)提供參考，有助于提升國(guó)內(nèi)對(duì)乙酰氨基酚片的質(zhì)量。