程冰潔 郭霞 戴雅琴 陳佩 李長(zhǎng)雪

(1湖北省第三人民醫(yī)院中醫(yī)科，湖北 武漢 430033；2武漢科技大學(xué)中醫(yī)康復(fù)科；3湖北省第三人民醫(yī)院 藥學(xué)部)

胰腺炎是外科中常見的無菌性胰腺炎癥，致病因素多為酒精濫用和膽結(jié)石等，具有復(fù)雜多樣臨床表現(xiàn)〔1,2〕。輕中度胰腺炎不需特殊治療，重癥胰腺炎伴有多種并發(fā)癥和全身過度炎癥，病死高達(dá)30%～40%〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺泡細(xì)胞損傷是胰腺炎發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔4,5〕，因此，減輕胰腺泡細(xì)胞損傷對(duì)治療胰腺炎具有重要的意義。大黃免煎顆粒在治療重癥胰腺炎方面歷史悠久〔6～8〕，但其對(duì)胰腺泡細(xì)胞損傷作用機(jī)制尚待研究。大量研究表明，miRNAs在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，如miR-23b〔9〕、miR-25-3p〔10〕、miR-135a〔11〕和miR-140-5p〔12〕等miRNAs通過調(diào)控下游蛋白對(duì)多種疾病關(guān)鍵細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要的調(diào)控作用。本研究探討大黃免煎顆粒通過miRNAs調(diào)控下游蛋白對(duì)胰腺泡細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株及主要試劑 大鼠胰腺泡細(xì)胞AR42J購(gòu)于美國(guó)ATCC。DMEM培養(yǎng)基、牛膽酸鈉、青霉素-鏈霉素溶液和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；各引物序列、miR-135a mimics/inhibitor和pcDNA-FAM129A由中國(guó)Biomics Biotech公司設(shè)計(jì)和合成；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒及RIPA裂解液購(gòu)自中國(guó)beyotime公司；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒、脂肪酶及淀粉酶試劑盒購(gòu)于法國(guó)EP公司；CCK-8試劑盒和膜聯(lián)蛋白(Annexin) V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司。FAM129A一抗及二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將大鼠胰腺泡細(xì)胞AR42J培養(yǎng)于含1%青霉素-鏈霉素溶液和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并放于37℃、5%條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合率為85%時(shí)進(jìn)行傳代。將AR42J細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照(NC)組、模型(Model)組、大黃免煎顆粒(DHG)組、miR-135a抑制物(miR-135a inhibitor)組、過表達(dá)FAM129A(pcDNA-FAM129A)組及miR-135a模擬物+過表達(dá)FAM129A(miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A)組。NC組為空白對(duì)照；Model組用500 μmol/L牛膽酸鈉處理；DHG組用500 μmol/L牛膽酸鈉和1.25 μmol/L大黃免煎顆粒處理；miR-135a inhibitor用500 μmol/L牛膽酸鈉、1.25 μmol/L大黃免煎顆粒和轉(zhuǎn)染miR-135a inhibitor處理；pcDNA-FAM129A組用500 μmol/L牛膽酸鈉、1.25 μmol/L大黃免煎顆粒和轉(zhuǎn)染pcDNA-FAM129A處理；miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組用500 μmol/L牛膽酸鈉、1.25 μmol/L大黃免煎顆粒及轉(zhuǎn)染miR-135a mimic和pcDNA-FAM129A處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程參考脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒。

1.3RT-qPCR檢測(cè)AR42J細(xì)胞及損傷模型中miRNAs的表達(dá)水平 取NC組、Model組、DHG組、miR-135a inhibitor組中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AR42J細(xì)胞，Trizol溶液提取AR42J細(xì)胞總RNA，定量分析后，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以U6為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行miRNAs的定量分析，引物U6正義:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、反義:5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′；miR-23b正義:5′-GGGTTCCTGGCATGCTGATT-3′、反義:5′-TCGTGGTTGCGTGGTAATCC-3′；miR-25-3p正義:5′-TGTTGAGAGGCGGAGACTTG-3′，反義:5′-GCACTGTCAGACCGAGACAA-3′；miR-135a正義:5′-AGCTGTCGTGTCTTATGGCT-3′，反義:5′-TGACTGCGTGTTTAGTGGC-3′；miR-140-5p正義:5′-TCTGTGTCCTGCCAGTGGTT-3′、反義:5′-CCAGTATCCTGTCCGTGGTTC-3′。qPCR體系：10 μl TB Green Premix Ex Taq Ⅱ，各0.8 μl PCR正反引物，0.4 μl ROX Reference Dye，2 μl DNA模板及6 μl H2O2。qPCR條件：95℃ 5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.4Western印跡檢測(cè)各組AR42J細(xì)胞中FAM129A的表達(dá)水平 取Model組、pcDNA-FAM129A組及miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AR42J細(xì)胞，冰上通過RIPA裂解液裂解后，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析。進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳3 h后，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脫脂牛奶的TTBS封閉1 h后，加入FAM129A一抗(1∶10 00)，4℃孵育過夜，洗滌4次，加入FAM129A二抗(1∶2 000)，再次洗滌4次，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物，在GIS凝膠成像系統(tǒng)中顯影并拍照，用Image J進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.5雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-135a和FAM129A的靶向關(guān)系 采用Starbase生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)miR-135a和FAM129A潛在結(jié)合區(qū)域。將WT-FAM129A-3′-UTR和MUT-FAM129A-3′-UTR區(qū)域構(gòu)建至pGLO-basic載體螢火蟲熒光素酶基因下游，然后分別與miR-NC和miR-135a inhibitor共轉(zhuǎn)染入至293T細(xì)胞中。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，參考雙熒光素酶試劑盒說明書，以海腎熒光值作為內(nèi)參，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。

1.6CCK-8檢測(cè)各組AR42J細(xì)胞活力 取NC組、Model組、DHG組、miR-135a inhibitor組、pcDNA-FAM129A組及miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AR42J細(xì)胞種于96孔板中(5×103個(gè)/孔)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育2 h，然后使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定OD值，并利用各時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定OD值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.7Annexin V-FITC/PI檢測(cè)各組AR42J細(xì)胞凋亡水平 用預(yù)冷的PBS重懸NC組、Model組、DHG組、miR-135a inhibitor組、pcDNA-FAM129A組及miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AR42J細(xì)胞，2 000 r/min離心10 min，并洗滌細(xì)胞，加入300 μl去離子水稀釋的1×結(jié)合緩沖液，再加入5 μl Annexin V-FITC和500 μl預(yù)冷緩沖液，室溫避光孵育15 min，然后加入2.5 μl PI，最后補(bǔ)加200 μl的1×結(jié)合緩沖液上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8脂肪酶和淀粉酶試劑盒檢測(cè)脂肪酶和淀粉酶活性 脂肪酶和淀粉酶試劑盒利用耦聯(lián)酶促反應(yīng)來檢測(cè)NC組、Model組、DHG組、miR-135a inhibitor組、pcDNA-FAM129A組及miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AR42J細(xì)胞中脂肪酶及淀粉酶活性。脂肪酶在波長(zhǎng)為570 nm處進(jìn)行比色，淀粉酶在波長(zhǎng)為405 nm處進(jìn)行比色，步驟參考脂肪酶和淀粉酶試劑盒說明書。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，單因素方差分析。相關(guān)圖片采用Graphpad 8.0軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié) 果

2.1牛膽酸鈉構(gòu)建胰腺泡細(xì)胞損傷模型 采用梯度濃度牛膽酸鈉處理大鼠胰腺泡細(xì)胞AR42J，CCK-8結(jié)果顯示，隨著牛膽酸鈉處理濃度(50，100，200，400，800，1 600，3 200，6 400 μmol/L)的上升，AR42J細(xì)胞活力抑制率〔(17.12±2.21)%；(20.87±3.04)%；(32.26±3.91)%；(42.96±4.53)%；(64.18±6.09)%；(80.13±7.05)%；(86.18±7.86)%；(90.75±6.02)%〕顯著上調(diào)，且牛膽酸鈉的半抑制濃度(IC50)為522.8 μmol/L。故后續(xù)試驗(yàn)采取500 μmol/L處理AR42J細(xì)胞作為大鼠胰腺泡細(xì)胞損傷模型，并設(shè)為Model組。

2.2miR-135a在胰腺泡細(xì)胞損傷模型中異常高表達(dá)，且大黃免煎顆粒能抑制其表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，Model組中miR-23b、miR-25-3p、miR-135a及miR-140-5p的表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.05)；且Model組中miR-135a的表達(dá)水平顯著高于miR-23b、miR-25-3p及miR-140-5p的表達(dá)水平(P<0.05)，見表1。此外，后續(xù)試驗(yàn)探討了大黃免煎顆粒對(duì)Model組中miR-135a表達(dá)水平的影響，NC組miR-135a表達(dá)為(0.99±0.07)，Model組(0 μmol/L大黃免煎顆粒)miR-135a表達(dá)為(1.86±0.05)，DHG組(0.25、0.50、1.25、2.50、5.00 μmol/L大黃免煎顆粒)miR-135a表達(dá)分別為(1.74±0.06，1.43±0.03，1.05±0.04，0.64±0.04，0.40±0.03)，結(jié)果表明，DHG組大黃免煎顆粒能顯著抑制Model組中miR-135a的表達(dá)水平(P<0.05)；且當(dāng)DHG組中大黃免煎顆粒處理濃度為1.25 μmol/L時(shí)，miR-135a的表達(dá)水平與NC組無顯著性差異。提示胰腺泡細(xì)胞損傷模型中，miR-135a異常高表達(dá)，且大黃免煎顆粒能夠抑制胰腺泡細(xì)胞損傷模型中miR-135a表達(dá)。

2.3大黃免煎顆粒通過miR-135a對(duì)胰腺泡細(xì)胞模型損傷的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示，Model組中miR-135a的表達(dá)水平顯著高于NC組、DHG組及miR-135a inhibitor組(P<0.05)；DHG組miR-135a的表達(dá)水平顯著高于miR-135a inhibitor組(P<0.05)，且與NC組無顯著性差異(P>0.05)；miR-135a inhibitor組miR-135a的表達(dá)水平顯著低于NC組(P<0.05)。CCK-8結(jié)果顯示，Model組中AR42J細(xì)胞活力顯著低于NC組、DHG組及miR-135a inhibitor組(P<0.05)；DHG組AR42J細(xì)胞活力顯著低于miR-135a inhibitor組(P<0.05)，且與NC組無顯著性差異(P>0.05)；miR-135a inhibitor組AR42J細(xì)胞活力顯著高于NC組(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI及脂肪酶和淀粉酶試劑盒結(jié)果顯示，Model組中AR42J細(xì)胞凋亡及脂肪酶和淀粉酶水平顯著高于NC組、DHG組及miR-135a inhibitor組(P<0.05)；DHG組AR42J細(xì)胞凋亡及脂肪酶和淀粉酶水平顯著高于miR-135a inhibitor組(P<0.05)，且與NC組無顯著性差異(P>0.05)；miR-135a inhibitor組AR42J細(xì)胞凋亡及脂肪酶和淀粉酶水平顯著低于NC組(P<0.05)，見表2和圖1。由以上結(jié)果可知，大黃免煎顆粒通過抑制胰腺泡細(xì)胞損傷模型中miR-135a的表達(dá)水平，從而促進(jìn)AR42J細(xì)胞損傷模型增殖，并抑制其凋亡及脂肪酶和淀粉酶水平，進(jìn)而緩解AR42J細(xì)胞的損傷。

表1 miR-140-5p胰腺泡細(xì)胞損傷模型細(xì)胞中miRNA的相對(duì)表達(dá)

表2 miR-135a對(duì)胰腺泡細(xì)胞模型損傷細(xì)胞的功能影響

2.4miR-135a和FAM129A的靶向關(guān)系驗(yàn)證 通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Strabase預(yù)測(cè)miR-135a的潛在靶基因，結(jié)果顯示，F(xiàn)AM129A是miR-135a的潛在靶基因，兩者潛在靶向序列見圖2A。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，miR-135a mimic能夠顯著抑制野生型FAM129A載體的熒光素酶活性(P<0.05)，見表3，且對(duì)突變型FAM129A載體的熒光素酶活性無顯著抑制作用。進(jìn)一步，Western印跡結(jié)果顯示，miR-135a mimic組中FAM129A蛋白的表達(dá)水平顯著低于NC組(P<0.01)，見圖2B。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)AM129A是miR-135a的靶基因，且miR-135a靶向負(fù)調(diào)控FAM129A蛋白的表達(dá)水平。

圖1 miR-135a對(duì)胰腺泡細(xì)胞模型損傷細(xì)胞的凋亡影響

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-135a和FAM129A的靶向關(guān)系

2.5大黃免煎顆粒通過miR-135a/FAM129A分子軸對(duì)胰腺泡細(xì)胞模型損傷的影響 Western印跡結(jié)果顯示，pcDNA-FAM129A組中FAM129A蛋白的表達(dá)水平顯著高于DHG組和miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組(P<0.05)，見圖3；且DHG組與miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組無顯著性差異。CCK-8結(jié)果顯示，pcDNA-FAM129A組中AR42J細(xì)胞活力顯著高于DHG組和miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組(P<0.05)；且DHG組與miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組無顯著性差異。Annexin V-FITC/PI及脂肪酶和淀粉酶試劑盒結(jié)果顯示，pcDNA-FAM129A組中AR42J細(xì)胞凋亡及脂肪酶和淀粉酶水平顯著低于DHG組和miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組(P<0.05)；且DHG組與miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組無顯著性差異，見表4和圖4。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大黃免煎顆粒通過抑制miR-135a上調(diào)FAM129A蛋白的表達(dá)水平，從而促進(jìn)AR42J細(xì)胞損傷模型增殖，并抑制其凋亡及脂肪酶和淀粉酶水平，進(jìn)而緩解AR42J細(xì)胞的損傷。

圖2 miR-135a和FAM129A的靶向關(guān)系

1～3：DHC組，pcDNA-FAM129A組，miR-135a mimic+pcDNA-FAM129A組圖3 3組FAM129A表達(dá)

表4 miR-135a/FAM129A分子軸對(duì)胰腺泡細(xì)胞模型損傷細(xì)胞的功能影響

圖4 miR-135a/FAM129A分子軸對(duì)胰腺泡細(xì)胞模型損傷細(xì)胞FAM129A蛋白和凋亡率的影響

3 討 論

胰腺炎前中期是自限性的，中度的疾病，多數(shù)患者經(jīng)過胃腸減壓、手術(shù)清除壞死胰腺組織等治療方法均可痊愈，但是在臨床上胰腺炎易發(fā)為重癥胰腺炎，并進(jìn)一步發(fā)展為胰腺癌，因此在外科中一直是危重癥〔13〕。胰腺炎病理特征表現(xiàn)為胰蛋白酶異常激活，其會(huì)引起急性炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致胰腺損傷，且進(jìn)一步會(huì)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)及多器官功能障礙綜合征〔14〕。研究表明，在胰腺炎中，胰腺泡細(xì)胞增殖活力降低和凋亡水平的升高等損傷生物學(xué)行為會(huì)加重胰腺炎病情〔15〕，因此，探討緩解胰腺泡細(xì)胞的損傷是胰腺炎治療的理想途徑之一。大黃免煎顆粒性味寒苦，具有瀉火清熱、祛瘀活血、瀉下攻積和解毒清熱等功效，在治療急性重癥胰腺炎具有預(yù)后良好的療效。研究表明〔16〕，采用大黃免煎顆粒中的主要成分大黃治療重癥胰腺炎患者，能有效降低患者體內(nèi)促炎細(xì)胞因子水平，從而減輕炎性反應(yīng)程度，進(jìn)而緩解或消除重癥胰腺炎患者繼發(fā)感染。但是大黃免煎顆粒對(duì)胰腺泡細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚待研究，本研究發(fā)現(xiàn)，大黃免煎顆粒能有效促進(jìn)胰腺泡細(xì)胞增殖并抑制其凋亡及脂肪酶和淀粉酶水平，從而緩解胰腺泡細(xì)胞損傷。此外，還發(fā)現(xiàn)其能抑制胰腺泡細(xì)胞損傷模型中異常高表達(dá)miR-135a水平。

miRNAs由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，它們通過轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控〔17〕。研究表明，多種miRNAs對(duì)胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用。例如，Wen等〔18〕發(fā)現(xiàn)，miR-374a-5p在胰腺炎胰腺泡細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，其通過調(diào)節(jié)肌酸激酶(NCK)1和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)14表達(dá)介導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和p38信號(hào)通路參與早期胰腺炎的發(fā)展進(jìn)程;Wan等〔19〕發(fā)現(xiàn)，miR-155通過抑制3-MA表達(dá)介導(dǎo)自噬功能受損，從而促進(jìn)胰蛋白酶激活，腺泡細(xì)胞異常分泌和壞死，進(jìn)而推進(jìn)胰腺炎進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，胰腺泡細(xì)胞損傷模型較正常胰腺泡細(xì)胞中miR-135a異常高表達(dá)，且敲降miR-135a能夠緩解牛膽酸鈉誘導(dǎo)的胰腺泡細(xì)胞損傷。此外，通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，F(xiàn)AM129A是miR-135a的靶基因，且miR-135a靶向負(fù)調(diào)控FAM129A蛋白的表達(dá)水平。

細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子(NIBAN1/FAM129A)調(diào)控包括EIF2A、EIF4EBP1和RPS6KB1在內(nèi)的一系列參與翻譯調(diào)控的蛋白的磷酸化，進(jìn)而參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和p53通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM129A通過促進(jìn)FAK的磷酸化，從而上調(diào)MMP2和細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和的侵襲〔20〕；此外，Zhang等〔21〕發(fā)現(xiàn)，上調(diào)FAM129A蛋白表達(dá)水平能抑制雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎模型促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)FAM129A促進(jìn)胰腺泡細(xì)胞損傷模型增殖并抑制其凋亡及脂肪酶和淀粉酶水平，從而緩解胰腺泡細(xì)胞損傷。

綜上，大黃免煎顆粒通過抑制miR-135a表達(dá)上調(diào)FAM129A蛋白的表達(dá)水平，從而促進(jìn)AR42J細(xì)胞損傷模型增殖，并抑制其凋亡及脂肪酶和淀粉酶水平，進(jìn)而緩解AR42J細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步緩解胰腺炎的發(fā)展進(jìn)程。