陳孝良 黃秀峰 張文榮 吳奇志

(廈門大學(xué)附屬 1第一醫(yī)院思明分院綜合內(nèi)科 ，福建 廈門 361000；中山醫(yī)院 2內(nèi)分泌科；3嘉蓮社區(qū)服務(wù)中心)

急性心肌梗死(AMI)是因動(dòng)脈堵塞導(dǎo)致心肌長(zhǎng)時(shí)間缺血而引起壞死的一種心血管疾病，具有發(fā)病急和病死率高等特點(diǎn)〔1〕。目前，臨床常用的介入治療和藥物溶栓等手段雖然使患者死亡率有所降低，但對(duì)部分患者的治療效果并不理想〔2〕，故尋找精準(zhǔn)有效的治療方案一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。研究表明，在AMI患者中存在異常表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)，而這些lncRNAs可能通過(guò)影響心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等在AMI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用〔3～5〕。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，lncRNAs家族成員LINC00339(又稱HSPC157)在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用〔6〕；然而，LINC00339是否通過(guò)影響心肌細(xì)胞功能參與AMI發(fā)病機(jī)制并不清楚。本研究探討LINC00339在AMI大鼠中的表達(dá)情況其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 體重在(240±20)g內(nèi)的48只清潔級(jí)SD大鼠購(gòu)于北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0010；攜帶陰性對(duì)照(NC)及siRNA-LINC00339的慢病毒由上?？凭S創(chuàng)生物科技有限公司包裝完成；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液、總RNA提取試劑盒、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3活性測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：G3004、R1200、BC3830)購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(貨號(hào)：M107R1)購(gòu)于南京歐凱生物公司，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：E607172、D731012、D731010、D731007)購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；兔抗大鼠B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rock1)、含NLR家族Pyrin域蛋白(NLRP)3單克隆抗體(貨號(hào)：ab194583、ab37168、ab32503、ab134181、ab263899)購(gòu)于中國(guó)Abcam。

1.2AMI大鼠模型的構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠在溫度為(25±2)℃、相對(duì)濕度為(60±10)%、光照周期12 h/12 h環(huán)境下飼養(yǎng)，均進(jìn)行自由攝食飲水。在適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，在48只大鼠中隨機(jī)選取30只，并采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎方法構(gòu)建AMI模型〔7〕：大鼠麻醉后，在頸部做切口連接呼吸機(jī)，開(kāi)胸暴露心臟后，對(duì)冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行結(jié)扎。如果觀察到心電圖ST段抬高且心率減慢、左心室發(fā)白時(shí)表明AMI模型構(gòu)建成功。將建模成功的27只大鼠隨機(jī)分為模型組、NC組和siLINC00339組，每組9只；另外，將只進(jìn)行開(kāi)胸但不對(duì)冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行結(jié)扎的9只SD大鼠作為假手術(shù)組，將不進(jìn)行任何處理的9只SD大鼠作為對(duì)照組。其中，將攜帶陰性對(duì)照NC及siRNA-LINC00339的慢病毒于術(shù)后注射至NC組和siLINC00339組大鼠心肌內(nèi)，并將等量生理鹽水注射到模型組和假手術(shù)組大鼠心肌內(nèi)。術(shù)后72 h處死大鼠取心肌組織，保存在-80℃下備用。

1.3心臟彩超和TTC染色法分別檢測(cè)大鼠心功能指標(biāo)與心肌梗死面積 ①心功能指標(biāo)：在各組大鼠處死前，以10%水合氯醛腹腔進(jìn)行麻醉后，采用心臟彩超檢測(cè)大鼠心功能指標(biāo)；②心肌梗死面積：取凍存的位于心尖至結(jié)扎點(diǎn)之間的心肌組織，行5 μm厚切片；將切片置于TTC染色液中染色15 min后，采用Image-Pro Plus7.0版圖像分析軟件觀察分析。其中，被染成紅色的部分為正常心肌區(qū)，被染成白色的部分為心肌梗死區(qū)域，而心肌梗死面積以白色區(qū)域與切面總面積的百分比表示。

1.4RT-qPCR檢測(cè)心肌組織中LINC00339、Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3 mRNA表達(dá) 參照總RNA提取試劑盒提取結(jié)扎線以下部分心肌組織總RNA，檢測(cè)RNA濃度后，將其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，參照RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書以GAPDH為內(nèi)參運(yùn)用2-△△Ct法檢測(cè)并計(jì)算各組大鼠心肌組織中LINC00339、Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3 mRNA表達(dá)水平。其中，①反應(yīng)條件：94℃ 6 min，94℃ 10 s、55～60℃ 30 s、72℃ 30 s，該過(guò)程共循環(huán)38次；②由上海生工生物工程有限公司合成的PCR引物序列：LINC00339上游：5′-GGTTGACGAAGTCTGGAACG-3′，下游：5′-GCCCATCATTTCATTGGGTA-3′；Bcl-2 上游：5′-CCTGTGGATGACTGAGTACCTG-3′，下游：5′-AGCCAGGAGAAATCAAACAGAGG-3′；Bax上游：5′-AGGATGCGTCCACCAAGAAGCT-3′，下游：5′-TCCGTGTCCACGTCAGCAATCA-3′；Rock1上游：5′-CACGCCTAACTGACAAGCACCA-3′，下游：5′-CAGGTCAACATCTAGCATGGAAC-3′；NLRP3上游：5′-TCACAACTCGCCCAAGGAGGAA-3′，下游：5′-AAGAGACCACGGCAGAAGCTAG-3′；GAPDH上游：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游：5′-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3′。

1.5TUNEL法檢測(cè)心肌凋亡指數(shù) 取結(jié)扎線以下部分心肌組織，經(jīng)石蠟包埋行5 μm切片，每組切3片；使用磷酸緩沖液洗滌7 min×3次，Triton X細(xì)胞通透液通透10 min并漂洗后，加入TUNEL工作液室溫避光反應(yīng)1 h；再次洗滌后，以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色15 min；洗去染液后，200倍熒光顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞凋亡情況；其中，被染成綠色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，以凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的百分比表示各組心肌凋亡指數(shù)。

1.6比色法和ELISA分別檢測(cè)心肌組織中Caspase-3活性與TNF-α、IL-6、IL-1β含量 取結(jié)扎線以下部分心肌組織，參照Caspase-3活性測(cè)定試劑盒和TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Caspase-3活性和TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.7Western印跡檢測(cè)心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3蛋白表達(dá) 取結(jié)扎線以下部分心肌組織，加入RIPA細(xì)胞裂解液提取組織總蛋白；將定量后的蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用半干法將蛋白樣品轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上；經(jīng)含5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h后，加入Bcl-2(1∶2 000)、Bax(1∶2 000)、Rock1(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)特異性抗體4℃下孵育過(guò)夜；次日，以二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h后，加入發(fā)光劑暗室內(nèi)顯影；將GAPDH作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件分析各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LINC00339在AMI大鼠心肌組織中的表達(dá)及siRNA-LINC00339干預(yù)效果 與對(duì)照組LINC00339表達(dá)量(1.00±0.00)比較，假手術(shù)組心肌組織中LINC00339表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.96±0.07，P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織中LINC00339表達(dá)水平明顯升高(3.86±0.33，P<0.05)。與模型組比較，NC組心肌組織中LINC00339表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.78±0.26，P>0.05)；與NC組比較，siLINC00339組心肌組織中LINC00339表達(dá)水平明顯降低(1.15±0.07，P<0.05)。

2.2下調(diào)LINC00339表達(dá)對(duì)大鼠心功能的影響 與假手術(shù)組比較，模型組心功能指標(biāo)左室長(zhǎng)軸縮短分?jǐn)?shù)、左室射血分?jǐn)?shù)明顯降低，而左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，NC組上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC組比較，siLINC00339組左室長(zhǎng)軸縮短分?jǐn)?shù)、左室射血分?jǐn)?shù)明顯升高，而左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3下調(diào)LINC00339表達(dá)對(duì)心肌梗死面積、凋亡指數(shù)和Caspase-3活性的影響 與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死面積、凋亡指數(shù)和Caspase-3活性均明顯升高(P<0.05)；NC組和模型組之間上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但siLINC00339組心肌梗死面積、凋亡指數(shù)和Caspase-3活性較NC組均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表2。

表1 各組心功能指標(biāo)的比較

圖1 下調(diào)LINC00339表達(dá)對(duì)心肌梗死面積和凋亡的影響

2.4下調(diào)LINC00339表達(dá)對(duì)心肌組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織TNF-α、IL-6和IL-1β含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，NC組心肌組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；然而，siLINC00339組心肌組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組心肌梗死面積、凋亡指數(shù)和Caspase-3活性比較

2.5下調(diào)LINC00339表達(dá)對(duì)心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3 mRNA表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低，而Bax、Rock1和NLRP3 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，NC組心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3 mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC組比較，siLINC00339組心肌組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，而Bax、Rock1和NLRP3 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 各組心肌組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的比較

表4 各組心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較

2.6下調(diào)LINC00339表達(dá)對(duì)心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1、NLRP3蛋白表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，而Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，NC組心肌組織中Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC組比較，siLINC00339組心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表4和圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax、Rock1和NLRP3蛋白表達(dá)

3 討 論

LncRNAs是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)氨基酸的RNA，雖然不具有編碼蛋白的功能，但可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育和物質(zhì)代謝等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前，關(guān)于LncRNAs的研究多集中在腫瘤方面，但LncRNAs在AMI等心血管疾病中的作用也逐漸引起關(guān)注〔8〕。LINC00339是lncRNAs家族成員，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。如：乳腺癌中異常高表達(dá)的LINC00339可通過(guò)調(diào)控miR-377-3p/HOXC6軸影響細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡〔9〕；在骨質(zhì)疏松中，LINC00339表達(dá)下調(diào)可通過(guò)增加成骨細(xì)胞中CDC42的表達(dá)影響骨代謝〔10〕；在水草酸鈣誘導(dǎo)的腎小管損傷模型中LINC00339表達(dá)上調(diào)，并且LINC00339可通過(guò)調(diào)控miR-22-3p/NLRP3軸促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-18表達(dá)加重炎癥損傷促進(jìn)腎小管上皮性上瞼下垂的發(fā)生發(fā)展〔11〕；然而，LINC00339在AMI發(fā)生發(fā)展中的作用并不清楚。

本研究在構(gòu)建的AMI大鼠心肌組織中發(fā)現(xiàn)LINC00339表達(dá)顯著升高，提示LINC00339可能在AMI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。將攜帶陰性對(duì)照NC及siRNA-LINC00339的慢病毒注射至AMI大鼠心肌內(nèi)成功下調(diào)LINC00339表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LINC00339表達(dá)可改善AMI大鼠心臟功能。大量研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制〔12，13〕。本研究結(jié)果表明，下調(diào)LINC00339表達(dá)可抑制AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡，與Jing等〔6〕研究所得到的LINC00339低表達(dá)可通過(guò)miR-484抑制阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的結(jié)果相吻合。此外，在AMI發(fā)生后，心肌不僅會(huì)因缺氧、缺血而發(fā)生壞死，還可釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，可見(jiàn)炎癥反應(yīng)也是AMI發(fā)病的重要機(jī)制之一〔14～16〕。本研究結(jié)果提示，LINC00339可能通過(guò)影響心肌凋亡和炎癥反應(yīng)等參與AMI發(fā)生發(fā)展。

Rock1是一種Rho效應(yīng)蛋白，也是Rho/Rock信號(hào)通路的關(guān)鍵分子之一，被Rho激活后可通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因表達(dá)在細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在AMI發(fā)生后心肌組織中Rock1異常高表達(dá)〔17〕，且Rock1在心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用〔18〕。NLRP3是一種重要的炎癥小體，在機(jī)體固有免疫中發(fā)揮著重要作用。在AMI發(fā)生后心肌組織NLRP3表達(dá)上調(diào)，而抑制其表達(dá)可減弱心肌炎癥反應(yīng)〔19〕。有研究指出，LINC00339可通過(guò)正向調(diào)控Rock1表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與遷移〔20〕，還可通過(guò)正向調(diào)控NLRP3表達(dá)促進(jìn)腎小管炎癥損傷〔11〕。本研究進(jìn)一步結(jié)果提示，LINC00339可能通過(guò)調(diào)控Rock1、NLRP3影響心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與AMI發(fā)生發(fā)展。

綜上，本研究揭示LINC00339在AMI大鼠心肌組織中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控Rock1、NLRP3表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)；然而，LINC00339是通過(guò)何種通路或基因來(lái)調(diào)控Rock1、NLRP3表達(dá)的還有待后續(xù)進(jìn)一步探討。