徐俊麗 陳昳菲 李雅睿 郭丹 王如畫

(1西安市第一醫(yī)院,陜西 西安 710000;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

手術(shù)治療對于早期發(fā)現(xiàn)的肝癌治療效果好〔1〕。研究證實肝癌術(shù)后有較高的復(fù)發(fā)和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率，肝癌根治性切除術(shù)后5年的復(fù)發(fā)率高達80%〔2，3〕。由此肝癌的靶向治療隨著分子生物學(xué)的發(fā)展受到了越來越多的關(guān)注，尋找有效的抗腫瘤藥物及其作用靶點至關(guān)重要。維生素D(VD)代謝的調(diào)節(jié)對于人體生理學(xué)是關(guān)鍵的，它通過VD受體(VDR)調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因表達。此外，VD是一種重要的內(nèi)源性抗癌劑，因為它可抑制細胞增殖，獲得更加分化的表型并誘導(dǎo)細胞凋亡〔4，5〕。Eag1是EAG K+通道家族的成員，在VD的抗腫瘤作用中，Eag1表達對細胞的生長抑制起重要作用〔6～8〕。VD吸收入血后在肝臟和腎臟進行代謝，腎臟中的一個關(guān)鍵酶是 24-羥化酶(CYP24A1)，主要起到降解骨化三醇的作用〔9〕，它的表達同時也受到骨化三醇與VDR的結(jié)合及與CYP24A1啟動子中存在的VD應(yīng)答元件(VDRE)的進一步相互作用而直接調(diào)節(jié)〔10〕。而阿司咪唑是一種通過特定通道對K+電流的功能性阻斷，來達到對Eag1的抑制作用〔11，12〕。研究表明，在乳腺癌、宮頸癌及神經(jīng)細胞瘤等研究中，阿司咪唑通過影響細胞K+通道可發(fā)揮其腫瘤細胞的增殖抑制作用〔13～15〕。但是阿司咪唑?qū)τ赩D是否有藥代動力學(xué)的作用，在肝癌中尚未得到證明，本研究旨在探討VD聯(lián)合抗組胺藥物對于肝癌細胞的作用，并對其分子機制進行闡述。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人肝癌細胞系HepG2、Huh7獲自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑和藥物 DMEM/High Glucose培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自HyClone公司；KCNH-1抗體購于Abcam公司；VDR抗體購自Wanleibio公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG購自北京天德悅生物科技有限公司；常規(guī)生物化學(xué)試劑購自西安赫特生物公司；VD3、阿司咪唑購自Solarbio公司。

1.2藥品配制 將10 mg VD3溶于10 ml無水乙醇中，分裝后避光4℃保存。將50 mg阿司咪唑溶于11 ml無水乙醇中，分裝后避光4℃保存。

1.3細胞培養(yǎng) 將肝癌細胞HepG2、Huh7在含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM中培養(yǎng)。將其保持在37℃，5%CO2濕潤的培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4Western印跡 分別收集陰性對照組、1 μmol/L的VD3、5 μmol/L的阿司咪唑、VD3和阿司咪唑雙重干預(yù)72 h的HepG2、Huh7細胞，提取蛋白，Bradford法測定蛋白含量，制備Western上樣樣品，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；將電泳分離的蛋白電轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)封閉PVDF膜1 h；加VDR一抗(1∶500，含5%脫脂奶粉的TBST稀釋)、Eag-1一抗(1∶1 000，含5%脫脂奶粉的TBST稀釋)4℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF膜3次，每次10 min；加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG(1∶5 000，3%牛血清白蛋白TBST稀釋)孵育1 h，TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min；內(nèi)參使用GAPDH(鼠抗人，稀釋度1∶1 000)。電化學(xué)發(fā)光(ECL)，X線膠片曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值代表蛋白的表達水平。

1.5qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 分別收集陰性對照組、1 μmol/L的VD3、5 μmol/L的阿司咪唑、VD3和阿司咪唑雙重干預(yù)72 h的HepG2、Huh7細胞，利用Trizol進行RNA提取，然后進行逆轉(zhuǎn)錄的操作，具體方法參照試劑盒說明書進行。進行qRT-PCR檢測時，以actin為內(nèi)參。VDR基因引物序列：正義鏈：5′-TCTCCAATCTGGATCTGAGTGAA-3′，反義鏈：5′-GGATGCTGTAACTGACCAGGT-3′；CYP24-A1基因引物序列：正義鏈：5′-GATTTTCCGCATGAAGTTGGGT-3′，反義鏈：5′-CCTTCCACGGTTTGATCTCCA-3′。反應(yīng)體系：2.0 μl cDNA，8.5 μl超純水，上下游引物各1.0 μl，SYBR Green 12.5 μl，共計25 μl。反應(yīng)條件：①預(yù)變性95℃，10 min；②變性：95℃，15 s；③退火/延伸：60℃，1 min，循環(huán)35～40次。

1.6四甲基偶氮唑藍(MTT) 將HepG2和Huh7細胞以(3～5)×104個細胞/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)基中加入各組藥物。培養(yǎng)24、48、72、96 h后，隨后將細胞在含有0.5 mg/ml MTT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在黑暗中保持4 h。 除去上清液后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)。 通過EnSpire Multimode Plate Reader測量490 nm處的光密度(OD)來測定細胞活力。按照公式：細胞存活率=實驗組吸光值/陽性對照吸光值×100%。為提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組設(shè)置5個復(fù)孔。與實驗平行，加細胞、培養(yǎng)基不加抑制劑的組為陽性對照組。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗和Fisher精確檢驗、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1VD聯(lián)合阿司咪唑?qū)Ω伟┘毎鲋车挠绊?與陰性對照組相比，24 h后VD和阿司咪唑可抑制肝癌細胞增殖，VD聯(lián)合阿司咪唑組對肝癌細胞增殖的抑制最明顯(均P<0.05)。見表1。

2.2VD聯(lián)合阿司咪唑?qū)Ω伟┘毎蠽DR、Eag-1及CYP24A1 mRNA的表達影響 VD組、阿司咪唑組和VD聯(lián)合阿司咪唑組VDR mRNA均顯著高于陰性對照組，VD聯(lián)合阿司咪唑組顯著高于VD組及阿司咪唑組(均P<0.05)；VD組、阿司咪唑組、VD+阿司咪唑組CYP24A1、Eag-1 mRNA均顯著低于陰性對照組，VD聯(lián)合阿司咪唑組顯著低于VD組及阿司咪唑組(P<0.05)。見表2。

2.3VD聯(lián)合阿司咪唑?qū)Ω伟┘毎蠩ag-1及VDR蛋白表達的影響 不同干預(yù)處理肝癌HepG2、Huh7細胞72 h后，各組Eag-1/GAPDH比較：陰性對照組最高，其次為VD組和阿司咪唑組，VD組+阿司咪唑組最低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組VDR/GAPDH比較：陰性對照組最低，其次為VD組和阿司咪唑組，VD+阿司咪唑組最高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表1 不同干預(yù)對肝癌HepG2、Huh7細胞增殖的影響

表2 各組肝癌HepG2細胞VDR、CYP24A1、Eag-1 mRNA的表達及Eag-1/GAPDH、VDR/GAPDH的灰度比值

1～4：陰性對照組；VD組；阿司咪唑組；VD聯(lián)合阿司咪唑組圖1 不同干預(yù)處理肝癌HepG2、Huh7細胞72 h后對Eag-1、VDR蛋白表達的影響

3 討 論

VD已在體內(nèi)和體外顯示出顯著的抗腫瘤作用〔3，16〕。致癌因子Eag1作為VD的靶點，同時又被阿司咪唑阻斷活性〔17〕，研究報道高VDR和Eag1表達是肝癌腫瘤的特征〔7〕。本研究結(jié)果表明，阿司咪唑能夠通過涉及CYP24A1下調(diào)和VDR表達上調(diào)的機制增強VD的抗腫瘤增殖作用，提示阿司咪唑能夠改善VD的生物學(xué)效應(yīng)。此外，阿司咪唑和VD均下調(diào)Eag1基因的表達，再加上阿司咪唑?qū)ag1通道活性的功能性阻斷〔8〕，可進一步解釋聯(lián)合治療的高效抗增殖作用。本研究結(jié)果表明，阿司咪唑可以改變VD的藥代動力學(xué)，并暗示可以將VD與阿司咪唑組合用于未來的研究。本研究結(jié)果證實，當(dāng)在阿司咪唑存在共培養(yǎng)時，VD增加其在表達VDR和Eag1基因細胞中的抗增殖活性。這種效應(yīng)很可能是由于阿司咪唑依賴性VDR上調(diào)和CYP24A1識失活；Eag1表達和活性的抑制也同理。