高飛 張欣欣， 陳素枝 楊鳳文 檀金川,

(1河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；2河北省中醫(yī)院)

糖尿病腎病(DN)以蛋白尿和進(jìn)行性腎衰竭為主要臨床表現(xiàn)，是我國終末期腎臟病的主要病因之一〔1〕。足細(xì)胞的功能和形態(tài)學(xué)改變與DN尿蛋白的增加關(guān)系密切，DN足細(xì)胞損傷后發(fā)生肥大、間質(zhì)轉(zhuǎn)化、脫離和凋亡等，其中足細(xì)胞的過度凋亡是DN發(fā)生的重要原因〔2〕。由高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡是目前研究DN足細(xì)胞損傷發(fā)生機(jī)制的常用細(xì)胞模型〔3〕。研究表明微小RNA(miRNA)與足細(xì)胞損傷的發(fā)生關(guān)系密切，足細(xì)胞中miRNA的表達(dá)異?！?〕。miR-193a可促進(jìn)心肌缺血/再灌注損傷細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌和腎癌細(xì)胞等凋亡〔5～7〕。研究報(bào)道m(xù)iR-193a在DN患者腎組織中高表達(dá)，且miR-193a的表達(dá)水平與DN病變程度正相關(guān)〔8〕?，F(xiàn)階段對(duì)于miR-193a在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-193a在高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 小鼠腎足細(xì)胞MPC-5購自上海雅吉生物科技有限公司；高糖培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000購自Thermo Fisher公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由Servicebio公司合成；miR-NC inhibitor、miR-193a inhibitor、miR-NC mimic和miR-193a mimic由RiboBio公司合成。腎母細(xì)胞瘤(WT)1抗體購自ABclonal公司；酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自武漢賽維爾生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；通用型快速啟動(dòng)液購自Servicebio公司；熒光素酶報(bào)告載體由上海吉?jiǎng)P基因有限公司構(gòu)建。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠腎足細(xì)胞MPC-5培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)〔9〕。細(xì)胞增殖：在33℃，5%CO2培養(yǎng)箱用含有10%胎牛血清(FBS)、20 U/ml 干擾素(IFN)-γ、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)未分化足細(xì)胞。細(xì)胞分化：1∶10傳代，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱用含有10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)足細(xì)胞10～14 d。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染 將足細(xì)胞分為6組：正常糖組(5.5 mmol/L葡萄糖)；高糖組(30 mmol/L葡萄糖)；miR-193a inhibitor組、miR-NC inhibitor組、miR-193a mimic組和miR-NC mimic組。其中后4組足細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-193a inhibitor、miR-NC inhibitor、miR-193a mimic和miR-NC mimic質(zhì)粒后在30 mmol/L的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定足細(xì)胞凋亡 胰酶-EDTA消化足細(xì)胞后室溫離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。每組收集大約1×106個(gè)足細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合緩沖液，反復(fù)吹打均勻，分別添加5μl碘化丙啶(PI)和膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)混勻后在暗室靜置10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡。

1.5逆轉(zhuǎn)錄(RT)-qPCR 抽提各組足細(xì)胞總RNA，使用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度及純度。取10 μl RNA溶液，加入特異性引物，加去離子水，加反應(yīng)緩沖液、三磷酸脫氧核苷酸混合液、RNA酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄酶于PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。配制PCR體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用ΔΔCT法計(jì)算miRNA表達(dá)水平。miR-193a：上游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGT-CATCTTG，下游5′-ACACTCCAGCTGGGTGGGTCT-TTGCGGGCA-3′；內(nèi)參U6：上游引物5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATT-TGCGT-3′；WT1：上游引物5′-GTGGCTCCTGCGT-TTCCCCC-3′，下游5′-CCACAGGCATG GCGCGG-3′。反應(yīng)擴(kuò)增條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，循環(huán)40次。

1.6Western印跡 使用添加苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液提取總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)測(cè)定蛋白濃度，取50 μg總蛋白與上樣緩沖液混合后100℃變性5 min，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠90 V恒壓電泳2～3 h，之后進(jìn)行250 mA恒流聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜30～60 min。將PVDF膜放在5%牛血清白蛋白(BSA)37℃孵育1.5 h，加入一抗WT1(1∶5 000)、酶切caspase-3(1∶2 000)、Bax (1∶3 000)、Bcl-2(1∶2 000)和β-actin (1∶5 000)，4℃孵育過夜。洗膜后加入相應(yīng)二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h。洗膜后使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色，用Quantity One軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白條帶/β-actin條帶灰度比值作為最終結(jié)果。

1.7靶基因預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定 TargetScan數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)WT1是miR-193a的靶基因，miR-193a與WT1的3′UTR端存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。分別構(gòu)建突變型(MUT)和野生型(WT) WT1-3′UTR，并連接到psi-Check2載體，構(gòu)建WT1-3′UTR WT和WT1-3′UTR Mut。足細(xì)胞接種在24孔板24 h后，用Lipofectamine 3000分別將WT1-3′UTR WT、WT1-3′UTR Mut與miR-193a mimics、miR-NC mimics共轉(zhuǎn)染至足細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h以后，使用Dual-Luciferase?雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性，以海參的熒光素酶熒光強(qiáng)度/螢火蟲的值來判定miR-193a與WT1的結(jié)合力。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-193a inhibitor下調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中miR-193a的表達(dá)水平 高糖組miR-193a水平(3.42±0.38)較正常糖組(0.09±0.07)顯著升高(P<0.05)，miR-193a inhibitor轉(zhuǎn)染高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞后，細(xì)胞中的miR-193a表達(dá)水平(1.83±0.20)較高糖組顯著降低(P<0.05)。

2.2miR-193a 對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響 與正常糖組相比，高糖刺激小鼠足細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率、酶切caspase-3和Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著下降(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-193a inhibitor后，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡率、酶切caspase-3和Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-193a mimic后，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡率、酶切caspase-3和Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表1。表明miR-193a inhibitor抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，而miR-193a mimic促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。

1～6：正常糖組，高糖組，miR-NC inhibitor組,miR-193a inhibitor組,miR-NC mimic組,miR-193a mimic組，下圖同圖1 Western印跡檢測(cè)各組凋亡蛋白

圖2 各組凋亡流式細(xì)胞圖

表1 miR-193a 對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響

2.3miR-193a靶向調(diào)控WT1在足細(xì)胞中的表達(dá) 通過TargetScan 預(yù)測(cè)miR-193a和 WT1的結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。分別構(gòu)建WT1突變型(MUT)和野生型(WT)載體，與miR-193a mimics、miR-NC mimics共轉(zhuǎn)染足細(xì)胞。結(jié)果顯示：與miR-NC組 mimic相比，miR-193a mimic組可顯著降低轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1-3′UTR WT的足細(xì)胞的相對(duì)熒光活性(P<0.05)，而對(duì)WT1-3′UTR Mut的相對(duì)熒光活性無明顯影響(P>0.05)，見表2。

圖3 miR-193a和WT1結(jié)合位點(diǎn)

表2 熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)

2.4miR-193a inhibitor上調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中WT1的表達(dá) 與正常糖組相比，高糖組WT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。miR-193a inhibitor轉(zhuǎn)染后WT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而miR-193a mimic轉(zhuǎn)染后WT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖4、表3。表明miR-193a負(fù)向調(diào)控WT1蛋白的表達(dá)。

1～6：正常糖組，高糖組，miR-NC inhibitor組,miR-193a inhibitor組,miR-NC mimic組,miR-193a mimic組圖4 miR-193a inhibitor上調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中WT1蛋白的表達(dá)

表3 miR-193a inhibitor上調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中WT1的表達(dá)

2.5miR-193a 靶向調(diào)控WT1抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡 miR-193a+WT1組凋亡率、酶切caspase-3、Bax顯著低于miR-193a+Vector組，WT1、Bcl-2水平顯著高于miR-193a+vector組(均P<0.05)。見表4、圖5，表明上調(diào)WT1可降低miR-193a對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響。

表4 miR-193a 調(diào)控WT1抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡

圖5 miR-193a 靶向調(diào)控WT1抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡

3 討 論

足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)和功能的主要細(xì)胞，足細(xì)胞損傷后蛋白從濾過膜漏出形成蛋白尿〔10〕。足細(xì)胞凋亡是足細(xì)胞數(shù)量減少和密度減低的重要原因之一。研究表明高水平葡萄糖刺激細(xì)胞線粒體釋放大量活性氧基團(tuán)，直接或間接導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，也可以通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 等多種信號(hào)通路介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡〔11〕。

miR-193a是一種具有多種生物學(xué)作用的miRNA分子，在各種疾病的作用受到關(guān)注。如肝癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌和腎癌等多種類型癌癥〔5～7〕。例如miR-193a通過靶向細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖(SPOCK)1抑制肝細(xì)胞癌的生長〔12〕，通過下調(diào)PLAU表達(dá)抑制大腸癌細(xì)胞的增殖和進(jìn)展〔13〕。此外，miR-193a可減輕肝纖維化并抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和活化〔14〕，通過靶向負(fù)調(diào)控高遷移率族蛋白(HMGB)1減輕糖尿病模型小鼠神經(jīng)性疼痛〔15〕。除了影響癌癥，miR-193a與膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)和DN等多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔16～18〕。如Zhang等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性膜性腎病患者的miR-193a高表達(dá)，同時(shí)高表達(dá)miR-193a與高蛋白尿(>3.79 g/24 h)、高血清肌酐>174.63 μmol/L)和腎小球?yàn)V過率下降〔≤68.13 ml/(min·1.73 m2)〕均為膜性腎病的腎存活不良的生物標(biāo)志物，也是預(yù)測(cè)膜性腎病預(yù)后的生物標(biāo)志物。Huang等〔17〕觀察到FSGS患者的尿液外泌體miR-193a水平明顯高于微小病變患者，提示miR-193a可能是診斷原發(fā)性FSGS非侵入性生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)腎病綜合征患者血清中miR-193a也是增加的〔19〕。足細(xì)胞分子表型的喪失是DN的重要特征。高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞去分化表現(xiàn)為WT1下調(diào)和配對(duì)框(PAX)2表達(dá)上調(diào)。Abheepsa等〔20〕研究顯示，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞去分化與miR-193a的高表達(dá)有關(guān)，而抑制miR-193a則阻止了高糖環(huán)境中足細(xì)胞的去分化。足細(xì)胞分化的喪失也可引起腎病范圍蛋白尿及FSGS，這與miR193a的高表達(dá)也存在相關(guān)性〔21〕。

研究表明，包括miR-193a在內(nèi)的miRNA可與多個(gè)靶基因結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)作用，HMGB1〔22〕、生長因子受體結(jié)合蛋白(GRB)7〔23〕、早老素(PSEN)1〔24〕和鼠肉瘤原癌基因(KRAS)〔25〕等均是miR-193a的靶基因，參與人體不同組織細(xì)胞的病理和生理過程。WT1是成熟足細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，常作為足細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)記物，對(duì)足細(xì)胞的發(fā)育，分化和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要〔26〕。WT1通過調(diào)節(jié)裂隙膜nephrin和podocalyxin及足細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子來維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)態(tài)〔19〕。當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時(shí)，WT1表達(dá)降低。此外，WT1也是一個(gè)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的抗凋亡因子，其可通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。如WT1通過靶向cMyc增強(qiáng)KRAS突變型非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的增殖并阻止其凋亡〔27〕；通過調(diào)控上游激活劑Bax及調(diào)控下游效應(yīng)子酶切caspase-3和caspase-7抗細(xì)胞凋亡〔28〕；通過抑制EZH2/β-catenin途徑改善DN的足細(xì)胞損傷等〔26〕。Li等〔29〕研究顯示，高果糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡模型中miR-193a高表達(dá)，WT1低表達(dá)，高果糖可通過增加miR-193a的表達(dá)從而下調(diào)WT1的表達(dá)，促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，而異甘草酸鎂可以逆轉(zhuǎn)這一過程。本研究結(jié)果提示miR-193a可通過靶向負(fù)調(diào)控WT1的表達(dá)影響酶切caspase-3和Bax等凋亡信號(hào)通絡(luò)，從而減少高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。