王媛 洪軍 王樹偉 王海波 趙迪 張浩良

(1唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000；2河北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科；3唐山市工人醫(yī)院腫瘤科)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是全球常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類生命健康，其發(fā)病率占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的30%～40%；由于其在顱內(nèi)呈浸潤性生長，導(dǎo)致其癌灶的組織邊界并不清晰，其總體預(yù)后仍不理想〔1〕。因此，深入研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找神經(jīng)膠質(zhì)瘤有效治療的新策略是全球亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。研究表明LncRNA參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，且在調(diào)控癌相關(guān)基因中發(fā)揮重要作用〔2〕。以 LncRNA為切入點(diǎn)探索其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色，這對于揭示神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、尋找腫瘤標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)、判斷疾病預(yù)后、構(gòu)建疾病風(fēng)險評估模型等具有重要意義。研究報道LINC00941定位于12號染色體短臂，LINC00941的表達(dá)與胃癌腫瘤的深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)；LINC00941沉默在體外可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤的生長〔3〕。LINC00941可能是治療或診斷胃癌的潛在新生物標(biāo)志物〔4〕。LINC00941還與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的生存時間有關(guān)，是具有診斷和預(yù)后價值的LncRNA〔5〕。然而LINC00941對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制尚不清楚。結(jié)腸癌組織和LoVo細(xì)胞中miR-597-5p表達(dá)均顯著下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲〔6〕。circ-101555可能充當(dāng)海綿體競爭結(jié)合miR-597-5p而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展〔7〕。Rho型鳥嘌呤核苷酸交換因子(RhoGEF)是調(diào)節(jié)Rho GTPase活性的關(guān)鍵因子，與腫瘤、發(fā)育及神經(jīng)類疾病等有密切關(guān)系〔8〕。研究報道Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(ARHGEF)4高表達(dá)與腺癌整體生存期較差的獨(dú)立預(yù)測因子相關(guān)，并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲〔9〕。本研究旨在分析LINC00941對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料 正常的人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HEB，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18、SW1088、Hs683購自美國模式菌種收集中心(ATCC)；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2細(xì)胞處理與分組 正常的人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HEB和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18、SW1088、Hs683用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；取對數(shù)生長期細(xì)胞LN18，將si-NC、si-LINC00941、pcDNA-NC、pcDNA-LINC00941、miR-NC、miR-597-5p、anti-miR-NC、anti-miR-597-5p、si-ARHGEF4轉(zhuǎn)染至細(xì)胞LN18中，分別記為si-NC組、si-LINC00941組、pcDNA-NC組、pcDNA-LINC00941組、miR-NC組、miR-597-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-597-5p組、si-ARHGEF4組；將si-LINC00941分別與anti-miR-NC、anti-miR-597-5p、pcDNA-NC、pcDNA-ARHGEF4共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞LN18中，記為si-LINC00941+anti-miR-NC組、si-LINC00941+anti-miR-597-5p組、si-LINC00941+pcDNA-NC組、si-LINC00 941+pcDNA-ARHGEF4組。

1.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LINC00941、miR-597-5p和ARHGEF4 mRNA的表達(dá) 提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR，PCR體系：2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl無菌水；反應(yīng)條件為95℃ 4 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)。相對表達(dá)量用2-△△Ct法計算。以GAPDH和U6為內(nèi)參，LINC00941上游：5′-AGGAGGGCAGGTCAGGTTAT-3′，下游：5′-TTGGGCAACCTAATGAGACC-3′；miR-597-5p上游：5′-TACTTACTCTACGTGTGTG-3′，下游：5′-GACCAGTACTCTACATTACGC-3′；ARHGEF4上游：5′-CCCA GTTGCTCTCACAGTCA-3′，下游：5′-TGTGTCTTCTCCAGCCACAG-3′；GAPDH上游：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；U6上游：5′-CGCTTCGGCAGCACATA TACTA-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4Western印跡法檢測ARHGEF4、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2和MMP9蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行定量。將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育90 min，用ECL發(fā)光液顯影，成像后用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶灰度值和內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

1.5MTT檢測細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處吸光度(OD)，以O(shè)D表示細(xì)胞活性。

1.6Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞侵襲實驗：Transwell上室加入100 μl稀釋好的基質(zhì)膠，使其鋪滿小室，然后在37℃培養(yǎng)箱使其凝固。然后加入100 μl細(xì)胞懸液，下室加入500 μl含血清培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h后用0.1%結(jié)晶紫染色，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2遍，棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡(×200)下隨機(jī)選擇視野拍照計數(shù)。細(xì)胞遷移實驗：除不用基質(zhì)膠包被Transwell上室，其余與細(xì)胞侵襲實驗操作相同。

1.7雙熒光素酶報告實驗檢測LINC00941和miR-597-5p及miR-597-5p和ARHGEF4的靶向關(guān)系 構(gòu)建含有miR-597-5p結(jié)合位點(diǎn)的LINC00941和ARHGEF4野生型和突變型熒光素酶報告載體，將其分別與miR-NC和miR-597-5p共轉(zhuǎn)染至LN18細(xì)胞中。按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中LncRNA LINC00941、miR-597-5p、ARHGEF4表達(dá)情況 與正常的人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HEB相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18、SW1088、Hs683中LncRNA LINC00941表達(dá)水平升高，miR-597-5p表達(dá)水平降低，ARHGEF4 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中LncRNA LINC00941、ARHGEF4和miR-597-5p 表達(dá)量

2.2低表達(dá)LncRNA LINC00941 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-LINC00941組LINC00941、CyclinD1、MMP2和MMP9表達(dá)水平細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量均顯著降低(P<0.05)，見表2,圖2，圖3。

圖1 Western印跡檢測ARHGEF4蛋白表達(dá)

表2 低表達(dá)LncRNA LINC00941 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 Transwell檢測細(xì)胞的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×400)

2.3高表達(dá)miR-597-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-597-5p組miR-597-5p表達(dá)水平升高，CyclinD1、MMP2和MMP9表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4，表3。

2.4低表達(dá)ARHGEF4對膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-ARHGEF4組ARHGEF4、CyclinD1、MMP2和MMP9表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量降低(P<0.05)，見表4，圖5。

圖3 Western印跡檢測兩組CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)

圖4 Western印跡檢測兩組CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)

2.5LncRNA LINC00941靶向miR-597-5p，miR-597-5p靶向ARHGEF4 LncBase Predicted v.2在線軟件預(yù)測顯示，miR-597-5p 和LncRNA LINC00941存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖6A)；TargetScan在線軟件預(yù)測顯示，ARHGEF4和miR-597-5p 存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖6B)。

表3 高表達(dá)miR-597-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響

表4 低表達(dá)ARHGEF4對膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響

圖5 Western印跡檢測兩組ARHGEF4、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)

雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-NC或miR-597-5p與LINC00941、ARHGEF4野生型及突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LN18細(xì)胞后，與miR-NC組(1.00±0.10、1.00±0.08)相比，miR-597-5p組轉(zhuǎn)染LINC00941、ARHGEF4野生型的細(xì)胞熒光素酶活性(0.42±0.04、0.46±0.04)顯著降低(均t=16.155、18.112，均P=0.000)；而轉(zhuǎn)染突變型的細(xì)胞熒光素酶活性(1.01±0.11 vs 0.98±0.09;1.02±0.10 vs 0.98±0.08)無顯著變化(t=0.633、0.937，P=0.536、0.363)。與pcDNA-NC組(1.00±0.10)相比，pcDNA-LINC00941組miR-597-5p表達(dá)水平(0.43±0.04)顯著降低，與si-NC組(1.01±0.09)相比，si-LINC00941組miR-597-5p表達(dá)水平(1.32±0.11)顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組(0.84±0.08)相比，miR-597-5p組ARHGEF4蛋白表達(dá)水平(0.43±0.04)顯著降低，與anti-miR-NC組(0.85±0.07)相比，anti-miR-597-5p組ARHGEF4蛋白表達(dá)水平(1.12±0.11)顯著升高(P<0.05)。

2.6下調(diào)miR-597-5p能夠逆轉(zhuǎn)LINC00941低表達(dá)對LN18細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-LINC00941+anti-miR-NC組比較，si-LINC00941+anti-miR-597-5p組miR-597-5p表達(dá)水平降低，CyclinD1、MMP2和MMP9表達(dá)水平升高，細(xì)胞活性升高，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7，表5。

A：LncBase Predicted v.2對miR-597-5p 和LncRNA LINC00941結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖，B：TargetScan對ARHGEF4和miR-597-5p 結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖，C：Western印跡檢測ARHGEF4蛋白表達(dá)圖6 LncRNA LINC00941靶向miR-597-5p，miR-597-5p 靶向ARHGEF4

1～2，si-LINC00941+anti-miR-NC組,si-LINC00941+anti-miR-597-5p組圖7 Western印跡檢測CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)

2.7上調(diào)ARHGEF4能夠逆轉(zhuǎn)LINC00941低表達(dá)對LN18細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-LINC00941+pcDNA-NC組比較，si-LINC00941+pcDNA-ARHGEF4組ARHGEF4、CyclinD1、MMP2和MMP9表達(dá)水平、細(xì)胞活性、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)，見表6，圖8。

表5 下調(diào)miR-597-5p 能夠逆轉(zhuǎn)LINC00941低表達(dá)對LN18細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

表6 上調(diào)ARHGEF4能夠逆轉(zhuǎn)LINC00941低表達(dá)對LN18細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

1～2:si-LINC00941+pcDNA-NC組、si-LINC00941+pcDNA-ARHGEF4組圖8 上調(diào)ARHGEF4能夠逆轉(zhuǎn)LINC00941低表達(dá)對LN18細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病率高、侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差，中位無進(jìn)展生存期及中位總生存期較短；隨著科研的發(fā)展，一些新興靶向抗腫瘤藥物應(yīng)運(yùn)而生，給神經(jīng)膠質(zhì)瘤的醫(yī)治帶來了新希望〔10〕。研究表明LncRNA與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，如肺腺癌患者存活率降低與LINC00941高表達(dá)有關(guān)〔11〕。結(jié)直腸癌組織中LINC00941 RNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，干擾LINC00941表達(dá)可降低結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖速度〔12〕。本實驗結(jié)果表明LINC00941或可能與膠質(zhì)瘤有關(guān)。本實驗進(jìn)一步轉(zhuǎn)染LINC00941干擾表達(dá)載體，表明LINC00941低表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

有研究報道m(xù)iR-597-5p在HPV16陽性子宮頸癌中差異表達(dá)〔13〕。miR-597-5p與胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)〔14〕。本實驗結(jié)果顯示，miR-597-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中低表達(dá)，高表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。下調(diào)miR-597-5p能逆轉(zhuǎn)LINC00941低表達(dá)對LN18細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。本實驗通過Targetscan預(yù)測顯示miR-597-5p與ARHGEF4具有結(jié)合位點(diǎn)，且雙熒光素酶實驗證實miR-597-5p可靶向調(diào)控ARHGEF4。研究報道靶向ARHGEF4的小干擾RNA有效傳遞到胰腺癌細(xì)胞中可抑制胰腺腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔15〕。本實驗結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中ARHGEF4高表達(dá)，低表達(dá)ARHGEF4可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。且本實驗還發(fā)現(xiàn)上調(diào)ARHGEF4均能逆轉(zhuǎn)LINC00941低表達(dá)對LN18細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

綜上，LncRNA LINC00941下調(diào)表達(dá)可能通過miR-597-5p/ARHGEF4分子軸抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。為以LncRNA LINC00941及其互作分子作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療靶點(diǎn)及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤靶向藥物的研發(fā)提供新思路。