許曉亮 劉輝 武燃 王蕾 左偉文 王天濤

(1唐山市第二醫(yī)院口腔科,河北 唐山 063000;2華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科；3唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院口腔系;4華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

雞卵清蛋白上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子(COUP-TF)Ⅱ是核受體超家族成員之一〔1～3〕，COUP-TFⅡ存在于靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)中，研究證實(shí)COUP-TFⅡ參與并調(diào)節(jié)著血管生成、器官形成及神經(jīng)發(fā)育等諸多生物學(xué)過程〔4〕。作為一種調(diào)節(jié)蛋白，COUP-TFⅡ 能促進(jìn)新生血管分化為具有不同結(jié)構(gòu)和功能的靜脈和動(dòng)脈，但其調(diào)節(jié)功能的機(jī)制尚不清楚。缺氧是一種生理刺激，許多病理狀態(tài)都受到缺氧的影響，缺氧誘導(dǎo)因子(HIFs)是最主要的參與缺氧應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種基因表達(dá)〔5,6〕。在哺乳動(dòng)物中HIF-1α 和HIF-2α 是研究較多的HIF 亞基，HIF-1α 和HIF-2α 可激活涉及血管生成、代謝、細(xì)胞存活和炎癥調(diào)節(jié)的多種基因〔7〕，在細(xì)胞缺氧反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，參與了缺氧條件下腫瘤細(xì)胞的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑〔8,9〕。本研究從轉(zhuǎn)錄水平確定缺氧是否能誘導(dǎo)COUP-TFⅡ表達(dá)，并闡明其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1質(zhì)粒構(gòu)建 利用人類基因組DNA(69237；Merck&CoInc.)，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析擴(kuò)增了 COUP-TFⅡ近端啟動(dòng)子區(qū)，該啟動(dòng)子區(qū)包含HIF-1α/HIF-2α缺氧反應(yīng)元件(HRE)的一致DNA結(jié)合位點(diǎn)。在COUP-TFⅡ片段插入螢火蟲熒光素酶編碼區(qū)上游后，使用基于PCR的定點(diǎn)突變將HRE序列從ACGTG突變?yōu)锳CATA。所得的2個(gè)質(zhì)粒稱為野生型(WT)-COUP-TFⅡ-Luc和突變型(MUT)-COUP-TFⅡ-Luc。

1.2熒光素酶活性檢測(cè) 構(gòu)建COUP-TFⅡ3′UTR-熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒 pMIR-COUP-TFⅡ-WT及pMIR-COUP-TFⅡ-WUT。將HIF-1α mimics、HIF-2α mimics、陰性對(duì)照、缺氧模擬劑CoCl2、磷酸鹽緩沖液(PBS)、熒光素酶、pMIR-COUP-TFⅡ-WT、pMIR-COUP-TFⅡ-WUT及陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)物孵育36 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)物。使用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒(Amboin)測(cè)定熒光素酶活性。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞EA.hy926細(xì)胞(ATCC，美國)用低糖杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)在37℃、3%O2、5%CO2和92%N2的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后細(xì)胞用DMEM在正常氧氣條件下(37℃、5%CO2、21%O2和74% N2)的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48 h。收集細(xì)胞進(jìn)一步分析。用0.25%胰蛋白酶消化生長良好的EA.hy926細(xì)胞。每孔加入2 ml DMEM，放入37℃ 5%CO2孵化器。細(xì)胞按70%細(xì)胞密度分組。將EAhy926細(xì)胞分為空載體組、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)組、COUP-TFⅡ組、HIF-1α組、HIF-2α組、siHIF-1α組、siHIF-2α組、NC對(duì)照組。每組按順序分別滴入空質(zhì)粒、VEGF、COUP-TFⅡ、HIF-1α、HIF-2α表達(dá)質(zhì)粒(均為10 μg)、HIF-1α siRNA(siHIF-1α，50 nmol/L)、HIF-2α siRNA(siHIF2α，50 nmol/L)及對(duì)應(yīng)的陽性對(duì)照質(zhì)粒在37℃和5%CO2的條件下共混孵化器繼續(xù)發(fā)展，8 h后更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染序列：HIF-1α siRNA正義鏈:5′-GTCTGCAACATGGAAGGTA-3′，HIF-1α siRNA 反義鏈:5′-GTC-GACAGCCTCACAA-3′；NC siRNA-1正義鏈:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，NC siRNA-1反義鏈:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；HIF-2α siRNA 正義鏈:5′-GCCGTACTGTCAACCTCAAGT-3′，HIF-2α siRNA 反義鏈:5′-GCCATCATCTCTCTGG-AT TTC-3′；NC siRNA-2正義鏈:5′-UAA AUCUGCA-AACCACUGGTT-3′，NC siRNA-2反義鏈:5′-ACGUG-ACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR 依照Trizol實(shí)驗(yàn)方法從細(xì)胞中提取總RNA，按RT-PCR檢測(cè)試劑盒說明行PCR，應(yīng)用β-actin 作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為20 μl，重復(fù)反應(yīng)3次，檢測(cè)結(jié)果采用2-△△Ct值計(jì)算。引物序列：HIF-1α正義鏈：5′-GTTGCCTGGAGCCCAGAGTG-3′，反義鏈：5′-CTGCCTTCAGCTGCCCTTGT-3′;HIF-2α正義鏈：5′-ACAGCTGACA AGAAAAAAAAGAG-3′，反義鏈： 5′-GGTGGCCTGGT CCAGAGC-3′;GAPDH 正義鏈：5′-AATGGACAACTGGTCGTGGAC-3′，反義鏈：5′-CCCTCCAGGG GATC TGTTTG-3′。

1.5Western印跡 從細(xì)胞中提取總蛋白，檢測(cè)濃度后，在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用COUP-TFⅡ抗體進(jìn)行Western印跡分析。

1.6染色質(zhì)免疫沉淀分析 (ChIP) 按照ChIP試劑盒說明進(jìn)行ChIP，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7小鼠后肢缺血模型 C57BL/6小鼠(n=12，雄性，約25 g，12 w)從北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究所購買，飼養(yǎng)條件：溫度24℃，室內(nèi)控制，晝夜循環(huán)照明，供水充足，飼料正常。隨機(jī)分成Sham組和后肢缺少小鼠模型(PAD)組腹腔注射水合氯醛(3.33%)、400 mg/kg麻醉。腹腔注射0.5 ml抗生素，置37℃孵育箱中孵育。應(yīng)用彩色多普勒超聲檢測(cè)結(jié)扎部位下游血流速度，判斷缺血后肢模型是否成功。判定標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后血流速度降至術(shù)前值的10%以下，血流頻譜變化明顯，為造模成功。

1.8免疫組化分析 4%多聚甲醛灌注處死缺血后肢小鼠。灌注后，將小鼠后肢浸入4%多聚甲醛4 h，轉(zhuǎn)移至70%乙醇中。將組織標(biāo)本石蠟包埋，石蠟切片，厚度5 μm。免疫染色前，5 μm組織切片梯度脫蠟、水化。水化后的組織切片上滴加3% H2O2溶液室溫孵育15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。用10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中的切片微波15 min，加入一抗4℃過夜。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min。而后進(jìn)行染色，而后進(jìn)行脫水和中性樹脂封片。采用正置顯微鏡觀察切片陽性信號(hào)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1EA.hy926細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功 各組HIF-1α、HIF-2α mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。HIF-1α組HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)水平(36.77±9.06)、HIF-2α組HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)水平(34.06±7.89)高于空載體組HIF-1α mRNA(12.35±2.64)、HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)水平(13.31±2.52)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。siHIF-1α組HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)水平(6.07±1.84)、siHIF-2α組HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)水平(8.96±1.06)低于NC對(duì)照組(10.65±2.36、10.23±1.60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。表明HIF-1α、HIF-2α、HIF-1α siRNA、HIF-2α siRNA均成功轉(zhuǎn)染進(jìn)EA.hy926細(xì)胞。

2.2COUP-TFⅡ啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)與HIF-1α、HIF-2α存在一致的HRE COUP-TFⅡ啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)HRE位置權(quán)重矩陣(PWM)見圖1A。從Ensembl基因組瀏覽器獲得的COUP-TFⅡ啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)的序列，利用ConTra v2(http://bioit2.irc.ugent.be/contra/v3/)服務(wù)器識(shí)別結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列基序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于COUP-TFⅡ 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與HIF-1α/HIF-2α存在一致的HRE ，見圖1B。

圖1 用生物信息學(xué)方法分析COUP-TFⅡ啟動(dòng)子區(qū)HIF-1α/HIF-2α結(jié)合位點(diǎn)(HRE)

2.3缺氧條件下COUP-TFⅡ啟動(dòng)子激活 創(chuàng)建了1個(gè)WT COUP-TFⅡ-Luc報(bào)告載體，其中包含COUP-TFⅡ-TSS的-400至-100 bp的DNA片段，見圖2。在常氧或低氧條件下培養(yǎng)EA.hy926細(xì)胞，并測(cè)定熒光素酶活性以確定COUP-TFⅡ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活。與PBS組(33.77±2.87)相比，CoCl2組COUP TFⅡ啟動(dòng)子活性(68.35±6.34)增加約2倍。在缺氧條件下，COUP-TFⅡ啟動(dòng)子活性(82.47±7.29)比在正常氧氣條件下(29.87±2.31)提高約2.5倍。用突變的HRE(ACGTG>ACATA)構(gòu)建MUT-COUP TFⅡ-Luc報(bào)告載體進(jìn)行以上實(shí)驗(yàn)。這種突變消除了缺氧對(duì)COUP-TFⅡ啟動(dòng)子的作用。

圖2 COUP-TFⅡ啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因(COUP-TFⅡ-Luc)示意圖

2.4缺氧誘導(dǎo)COUP-TFⅡ在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 與常氧條件相比，EA.hy926細(xì)胞在缺氧條件下，6 h COUP-TFⅡ 水平無明顯差異(t=0.731；P>0.05)。持續(xù)缺氧72 h后，在顯微鏡下觀察到大量細(xì)胞凋亡(>50%)，將干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。選取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12、24、48 h)檢測(cè)COUP-TFⅡ 的mRNA和蛋白表達(dá)變化。見圖3。EA.hy926細(xì)胞在缺氧條件下48 h后COUP-TFⅡ mRNA表達(dá)(4.25±0.37)較VEGF mRNA表達(dá)(3.43±0.28)明顯增加(P<0.001)；與常氧條件下COUP-TFⅡ蛋白表達(dá)(1.00±0.09)相比，缺氧12、24、48 h后COUP-TFⅡ蛋白表達(dá)(3.35±0.27、3.79±0.38、4.41±0.45)明顯增加(P<0.001)。

2.5HIF-1α和HIF-2α誘導(dǎo)COUP-TFⅡ啟動(dòng)子激活 將WT-COUP-TFⅡ-Luc質(zhì)粒和HIF-1α或HIF-2α共轉(zhuǎn)染到EA.hy926細(xì)胞中。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組〔(33.21±3.52)%、(33.21±3.52)%〕相比，HIF-1α或HIF-2α過表達(dá)可顯著增加WT-COUP-TFⅡ-Luc的熒光素酶活性〔(91.64±8.76)%、(99.23±9.41)%；均P<0.001〕。隨后EA.hy926細(xì)胞中使用RT-PCR結(jié)果顯示，與空載體組相比(1.00±0.09、1.00±0.09)，過表達(dá)HIF-1α或HIF-2α顯著增加COUP-TFⅡ表達(dá)(3.11±0.29、5.21±0.48；均P<0.001)。 Western印跡結(jié)果顯示，與空載體組比較(1.00±0.10)，過表達(dá)HIF-1α或HIF-2α明顯增加COUP-TFⅡ蛋白表達(dá)(2.78±0.21、3.89±0.39；均P<0.001)。在EA.hy926細(xì)胞中用siRNA降低HIF-1α和HIF-2α表達(dá)，在缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞48 h后Western印跡檢測(cè)COUP-TFⅡ的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，HIF-1α或HIF-2α降低后COUP-TFⅡ蛋白表達(dá)(0.67±0.05、0.54±0.04)明顯降低(P<0.001)，見圖4。

圖3 EA.hy926細(xì)胞在缺氧條件下不同時(shí)間點(diǎn)COUP-TFⅡ蛋白表達(dá)

2.6HIF-1α、HIF-2α與COUP-TFⅡHRE的相互作用 EA.hy926細(xì)胞缺氧時(shí)，HIF-1α或HIF-2α能與COUP-TFⅡ啟動(dòng)子結(jié)合，見圖5。用HIF-1α 或HIF-2α特異性抗體免疫沉淀EA.hy926細(xì)胞COUP-TFⅡ、HRE與HIF-1α或HIF-2α之間的蛋白DNA復(fù)合物，同時(shí)使用羊抗兔IgG作為對(duì)照組，采用RT-PCR對(duì)COUP-TFⅡ-HRE位點(diǎn)進(jìn)行免疫沉淀物中的DNA分析。COUP-TFⅡ-HRE含有抗HIF-1α或抗HIF-2α的抗體(1.00±0.95 vs 18.53±1.67；1.00±0.95 vs 23.12±1.98，P<0.01)，但不含有羊抗兔IgG，相比之下，COUP-TFⅡ無HRE遠(yuǎn)端區(qū)的無法檢測(cè)到PCR信號(hào)(P>0.05)，即HIF-1α和HIF-2α均能與COUP-TFⅡ-HRE特異性結(jié)合，但不能與無HRE的遠(yuǎn)端結(jié)合。以上結(jié)果顯示HIF-1α或HIF-2α與COUP-TFⅡHRE之間存在相互作用。

圖5 ChIP分析HIF-1α和HIF-2α與COUP-TFⅡ相互作用

2.7COUP-TFⅡ在小鼠缺血后肢的表達(dá)增加 相比Sham組，PAD組COUP-TFⅡ的蛋白水平明顯升高，見圖6。與Sham組(17.56±1.56)相比，PAD組每個(gè)細(xì)胞的IOD值(24.13±2.27)明顯升高(P<0.01)。

圖6 COUP-TFⅡ在小鼠缺血后肢表達(dá)(IHC染色，×500)

3 討 論

本研究結(jié)果表明，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和HIF-2α參與調(diào)控COUP-TFⅡ表達(dá)。COUP-TFⅡ又被稱為NR2F2，已經(jīng)證實(shí)在神經(jīng)發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，是腫瘤微環(huán)境中一種重要的調(diào)節(jié)血管生成生長因子〔10,11〕。在小鼠模型中，破壞COUP-TFⅡ可導(dǎo)致血管生成和心血管疾病的生成〔12,13〕。HIF參與調(diào)控多種基因的表達(dá)，如血管生成、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞外基質(zhì)合成、細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤侵襲性等〔14〕。HIF由不穩(wěn)定的α亞基和穩(wěn)定的β亞基組成，可與HRE結(jié)合。已有研究表明，HIF-1α和HIF-2α對(duì)靶基因的特異性起重要作用，而C端激活區(qū)則激活了共同的靶基因〔15〕。研究表明HIF通?？捎扇毖鯒l件誘導(dǎo)〔16〕。在本研究中，建立了一個(gè)EA.hy926細(xì)胞系模型，并觀察到HIF-1α和HIF-2α均可單獨(dú)激活COUP-TFⅡ表達(dá)。當(dāng)HIF-1α或HIF-2α被敲除時(shí)，COUP-TFⅡ蛋白在缺氧條件下的表達(dá)水平被顯著抑制，表明HIF-1α和(或)HIF-2α參與COUP-TFⅡ轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示缺氧誘導(dǎo)因子 HIF-1α，HIF-2α可誘導(dǎo)COUP-TFⅡ mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)缺氧誘導(dǎo)COUP-TFⅡ表達(dá)在生理和病理過程中的潛在作用可能作為未來的一個(gè)前瞻性研究重點(diǎn)。