胡廣 關(guān)智宇 張開偉

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，貴州 貴陽 550001)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)有多向分化、自我更新潛能,可以分化為多種間質(zhì)組織〔1〕。在哺乳動(dòng)物的骨髓基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)BMSC有分化形成骨、脂肪、神經(jīng)、軟骨、成肌細(xì)胞等多種分化潛能的細(xì)胞亞群〔2〕。BMSC來源豐富，容易分離，對(duì)供體影響較少，在一定條件下可轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞〔3〕。目前認(rèn)為是骨組織工程最重要的種子細(xì)胞來源，且具有免疫調(diào)節(jié)功能，通過細(xì)胞間的相互作用、產(chǎn)生細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞的增殖和其免疫反應(yīng)，從而起到免疫重建的功能〔4,5〕。BMSC可以分化成血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。本文旨在探討GDF-5對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、遷移的影響及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 研究細(xì)胞：分離大鼠BMSC并進(jìn)行培養(yǎng)。主要試劑與細(xì)胞：SPF級(jí)SD大鼠(河南中醫(yī)藥大學(xué)，SYXK(豫)2020-0009)；高糖DMEM培養(yǎng)基(北京凱瑞基生物科技有限公司)；胎牛血清(武漢益普生物科技有限公司)；PCR試劑盒(上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司)；流式細(xì)胞儀(基爾頓生物科技(上海)有限公司)；Transwell小室(上海子起生物科技有限公司)；磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)一抗(北京百奧萊博科技有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑(艾美捷科技有限公司)；蛋白激酶B(Akt)一抗(上海莼試生物技術(shù)有限公司)，本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1BMSC分離 無菌條件下分離大鼠脛骨、股骨，用眼科剪從股骨及脛骨的干骺端切開骨髓腔，將骨髓腔用含肝素的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行沖洗。吸管重復(fù)吹打后，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入DMEM培養(yǎng)基4 ml重懸，密度為1 073 g/ml的PercoⅡ分離液中滴加細(xì)胞重懸液按1∶1比例，1 500 r/min離心30 min，取乳白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層，添加到DMEM培養(yǎng)液稀釋混勻，1 500 r/min離心5 min，沖洗2～3次，將多余的脂肪細(xì)胞和組織液去除。用DMEM培養(yǎng)基且含有雙抗的10%胎牛血清進(jìn)行重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為20×105個(gè)/cm2接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37℃、飽和濕度為5%的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2慢病毒載體構(gòu)建 GDF-5表達(dá)抑制的慢病毒載體構(gòu)建及測(cè)定患者GDF-5的序列查找和設(shè)計(jì)(由廣州易錦公司完成)。GDF-5引物序列：上游：5′-ATGGTACCTTCGCTGCTACGGCCTTTCTCT-3′；下游：5′-TATCTAGAGGGGTAGTCTCTGGATGTGCCA-3′組成。目標(biāo)基因探針和內(nèi)參基因探針均為5′端采用FAM報(bào)告熒光標(biāo)記,3′端采用TAMRA淬滅熒光標(biāo)記。PCR體系:4.5 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，0.5 μl TaqMan microRNA assay(5×)，5.0 μl TaqMan Mix。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)熱5 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,循環(huán)40次。將細(xì)胞分為：對(duì)照組、下調(diào)組、上調(diào)組，其中對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理，對(duì)下調(diào)組、上調(diào)組按照Li-pofectamine2000說明書分別進(jìn)慢病毒滴度轉(zhuǎn)染miR-639 mimics和miR-inhibibor。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 用移液槍吸取200 μl BMSC懸液置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，混勻后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h,3 d更換一次新鮮培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合度在70%～80%時(shí)，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.4BMSCs的細(xì)胞周期檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組同凋亡檢測(cè)，消化收集細(xì)胞后，加入細(xì)胞周期液，放置30 min，然后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5細(xì)胞增殖情況檢測(cè) 采用MTT比色法檢測(cè)各組骨BMSC增殖情況，在細(xì)胞培養(yǎng)后將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×104個(gè)/ml，接種于96孔板中，把200 μl細(xì)胞懸液加入每個(gè)孔中，在37℃、5%CO2溫度下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入10 μl MTT試劑繼續(xù)孵育4 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為570 mm的細(xì)胞組OD值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(細(xì)胞組OD值/參照組OD值)×100%。

1.2.6細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組BMSC凋亡情況，將細(xì)胞傳到5孔板中，在37℃、5%CO2溫度下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入0.25%胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心處理5 min，收集離心處理后的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)清洗2次，每次清洗3 min，再次離心收集細(xì)胞，加入1 ml PI染液，在避光常溫下放置1 h，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用特異熒光標(biāo)記，標(biāo)記后在鞘液包裹下快速流動(dòng)，流動(dòng)期間發(fā)射光子，利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x檢測(cè)光子數(shù)值。

1.2.7細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組BMSC遷移能力，將細(xì)胞接種于18孔板中，細(xì)胞增長(zhǎng)至90%左右時(shí)，采用100 μl槍頭垂直劃3條直線，使用PBS反復(fù)清洗3次，每次清洗3 min，加入0.5%血清培養(yǎng)基并觀察24 h，使用倒置顯微鏡觀察各組BMSC遷移能力。

1.2.8細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室檢測(cè)各組BMSC侵襲能力，將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，細(xì)胞懸液接種于上室，100 ng/ml IL-8接種于下室，24 h后100 μg/ml三羥甲基丙烷(TMP)溶液加入下室并孵育24 h，將上室微孔中的細(xì)胞使用棉簽擦除，PBS反復(fù)清洗3次，每次清洗3 min，固定在4%多聚甲醛溶液中處理15 min，使用蘇木精染色處理10 min，用PBS清洗，每次清洗3 min，在倒置顯微鏡下觀察上室微孔下層的細(xì)胞數(shù)，觀察各組BMSC侵襲能力。

1.2.93組細(xì)胞PI3K/Akt蛋白信號(hào)通路表達(dá)量檢測(cè) 采用Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K/Akt蛋白信號(hào)通路PI3K、Akt蛋白表達(dá)量，取RIPA裂解液150 μl及苯甲基磺酰氟(PMSF)1.5 μl加在冰上孵育30 min，4℃ 1 500 r/min離心15 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。每樣樣品取15 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PDVF)膜，5%脫脂乳室溫封閉2 h,將PI3K、Akt一抗加入4℃孵育過夜；在1∶5 000二抗TBST(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)中加入TBST，用增強(qiáng)型敏化學(xué)發(fā)光底物試劑(ECL)處理，然后在凝膠成像系統(tǒng)顯像，采用Image J軟件進(jìn)行蛋白定量分析。每組檢測(cè)3次取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1GDF-5表達(dá)量比較 與對(duì)照組(2.02±0.59)相比，下調(diào)組GDF-5表達(dá)量(0.51±0.12)明顯降低(P<0.05)；與對(duì)照組相比，上調(diào)組GDF-5表達(dá)量(3.72±1.17)明顯升高(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組GDF-5表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2BMSCs的細(xì)胞周期分布 與對(duì)照組相比，下調(diào)組G1期明顯上升，S期、G2期明顯下降，上調(diào)組G1期明顯降低，S期、G2期明顯升高(均P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組G1期明顯降低，S期、G2期明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 BMSCs的細(xì)胞周期分布

2.33組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖率、凋亡率比較 與對(duì)照組相比，下調(diào)組不同時(shí)間點(diǎn)增殖率明顯降低，凋亡率明顯升高，上調(diào)組不同時(shí)間點(diǎn)增殖率明顯上升，凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組不同時(shí)間點(diǎn)增殖率明顯上升，凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 3組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

表2 3組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖率、凋亡率、細(xì)胞遷移、侵襲能力比較

2.43組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 與對(duì)照組相比，下調(diào)組細(xì)胞遷移明顯降低，侵襲數(shù)明顯升高，上調(diào)組細(xì)胞遷移明顯上升，侵襲數(shù)顯著下降(均P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組細(xì)胞遷移明顯上升，侵襲數(shù)明顯下降(均P<0.05)。見表2、圖2、圖3。

圖2 GDF-5轉(zhuǎn)染后BMSC遷移比較(×200)

圖3 GDF-5轉(zhuǎn)染后BMSC侵襲比較(蘇木精染色，×200)

2.53組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較 與對(duì)照組相比，下調(diào)組PI3K、AKT蛋白表達(dá)量明顯升高，上調(diào)組PI3K、Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組PI3K、Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)

表3 3組PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

BMSCs來源較廣、容易獲取、無醫(yī)學(xué)倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，是目前骨組織工程最理想的種子細(xì)胞來源。BMSC有血管生成、抗凋亡、抗纖維化、抗炎和免疫抑制等生物學(xué)特性〔6，7〕。骨髓包含多種細(xì)胞，包括血管細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等〔8，9〕。早期認(rèn)為骨髓中細(xì)胞的功能只是骨髓細(xì)胞再生、循環(huán)血細(xì)胞再生，骨髓干細(xì)胞將有可能成為治療遺傳病或變性疾病的理想來源細(xì)胞〔10，11〕。本研究結(jié)果顯示，GDF-5可有效促進(jìn)大鼠BMSC增殖、遷移。

GDF5是BMPs家族的成員，是機(jī)體軟骨形成、骨骼發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子，在軟骨形成的早期，GDF5可促進(jìn)間充質(zhì)軟骨前細(xì)胞的黏附、聚集、分化〔12，13〕。外源性GDF5可促進(jìn)BMSC的增殖及BMSC的成軟骨分化，在促進(jìn)軟骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)分泌、合成，軟骨細(xì)胞基因及蛋白表達(dá)方面有明顯效果，提示將GDF5用于促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化進(jìn)而用于細(xì)胞治療方面可發(fā)揮更重要的作用〔14，15〕。金林等〔16〕研究顯示，GDF-5可以誘導(dǎo)BMSC呈肌腱細(xì)胞分化，且去分化過程可以提高BMSC腱系分化的能力，且BMSCs在去分化后具有更高的增殖和分化潛能，經(jīng)過GDF-5處理的去分化的BMSCs更具有成肌腱細(xì)胞分化的優(yōu)勢(shì)。本文研究顯示，GDF-5可以作用于PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)PI3K、Akt蛋白表達(dá)，有效促進(jìn)BMSC向類髓核細(xì)胞分化，PI3K/Akt信號(hào)通路存在于細(xì)胞中，參與生物學(xué)過程的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中起到關(guān)鍵的作用。PI3K是位于胞質(zhì)的脂類激酶〔17〕。經(jīng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-l、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等生長(zhǎng)因子激活后，可以使質(zhì)膜上的二磷酸磷脂酰肌磷酸化為三磷酸磷脂酰肌醇。Akt包含480個(gè)氨基酸殘基，屬于一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。作為第二信使，磷脂酰肌醇3磷酸(PIP)3可以將Akt募集到質(zhì)膜，因此，Akt會(huì)被激酶丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)1、自噬和雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物Ⅰ(mTORC)2分別磷酸化，然而信號(hào)傳遞到叉頭基因(FoxO)、糖原合酶激酶(GSK)-3、mTORC1等效應(yīng)蛋白〔18，19〕。黎鑫等〔20〕研究顯示，在異常微環(huán)境中培養(yǎng)高表達(dá)IGF-1的BMSCs可以減少細(xì)胞凋亡，增加增殖，增加原癌基因表達(dá)。PI3K抑制劑、Akt磷酸化抑制劑可以逆轉(zhuǎn)BMSCs因IGF-1引發(fā)的增殖、凋亡相關(guān)生物學(xué)特性的改變，提示PI3K/Akt信號(hào)通路是IGF-1誘發(fā)BMSCs轉(zhuǎn)化過程中的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。人類多種惡性腫瘤中IGF-1在異常表達(dá),且與疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相連。有研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1等生長(zhǎng)因子可以激活PI3K/Akt信號(hào)，下游效應(yīng)蛋白mTORC1/S6K1可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制其凋亡，體外破骨細(xì)胞上清也可通過該信號(hào)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖分化〔21〕。PI3K/Akt信號(hào)通路可抑制成骨細(xì)胞分化。本研究顯示，上調(diào)GDF-5可促進(jìn)BMSC凋亡，抑制增殖、遷移、侵襲，并進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)GDF-5經(jīng)作用于PI3K/Akt信號(hào)通路，可促進(jìn)PI3K、Akt表達(dá)，發(fā)揮其促進(jìn)BMSC凋亡，抑制增殖、遷移、侵襲的作用。