王 峰,陳玉真,吳志丹,尤志明,翁伯琦,俞曉敏,楊貞標

1 福建農林大學園藝學院,福州 350002 2 福建省農業(yè)科學院茶葉研究所,福州 350012 3 福建農林大學海峽聯(lián)合研究院園藝植物生物學及代謝組學研究中心,福州 350002 4 福建省農業(yè)科學院,福州 350013 5 美國加利福利亞大學河濱分校,河濱CA, 92506

茶園是我國亞熱帶丘陵山區(qū)重要的土地利用類型,大多由自然撂荒地或林地開墾而成。由于單一化的種植模式,從幼齡茶園向成齡、老齡茶園演化,以及耕作、噴藥施肥管理等因素,茶園土壤理化特性發(fā)生一系列變化。隨著植茶年限增加,茶園土壤逐步形成明顯酸化、鹽基離子缺乏、脫硅富鋁及養(yǎng)分不均衡退化等特征[1—4],且茶園土壤中茶樹自毒物質(酚類物質和咖啡堿)大量積累,勢必會影響土壤微生物群落結構及功能(部分老茶園土壤致病微生物增加)[5—7],甚至引發(fā)茶樹連作障礙問題。隨著有機農業(yè)的興起,中國有機茶產業(yè)以強大的生命力在全國不同產茶區(qū)生根萌芽,并逐漸成為中國茶產業(yè)的一個新的經濟增長點,國內鶴峰縣和武義縣更是提出推進“全域有機茶”建設的新藍圖。近年來,據國家認監(jiān)委公布的統(tǒng)計數據,我國認證的有機茶產量已超過12.7萬t/a[8],約占全國有機認證產品的40%,有機茶在國內的銷售與消費比例也是逐年增加。

與常規(guī)耕作相比,有機種植過程中不使用合成的農藥、化肥及生長調節(jié)劑等物質,而是依靠有機肥源給植物生長提供養(yǎng)分,同時采取覆草、物理和生物的防治措施進行病蟲草害防治,被認為一種可持續(xù)穩(wěn)定的農業(yè)生產體系[9],也有利于促進包括人類在內的自然界的公平與和諧共生。就其本質而言,有機種植體系通過使用有機肥料、保護性耕作措施以提高土壤肥力,為土壤微生物的繁殖提供了適宜的營養(yǎng)條件。鄧欣等研究表明[10],按照有機農業(yè)生產規(guī)程管理,隨著種植年限延長,有機茶園土壤養(yǎng)分、微生物數量和微生物生物量碳明顯增加,有機種植能夠促進茶園土壤的良性循環(huán)。Wang等[11]研究也發(fā)現(xiàn),有機茶園土壤養(yǎng)分和酶活性顯著高于常規(guī)茶園,土壤微生物豐度和多樣性指數也顯著高于常規(guī)茶園。Wu等[12]對海南龍眼園轉變?yōu)椴鑸@過程中微生物變化趨勢的研究結果表明,將龍眼果園改造為常規(guī)茶園后,土壤磷的有效性和微生物群落生物量降低,有機種植模式增加土壤中有效磷和中等有效磷組分含量,提高了土壤微生物多樣性。Gui等[13]研究表明,與常規(guī)茶園相比,有機管理茶園土壤微生物碳氮含量顯著增加,有機茶園管理顯著改變了土壤細菌群落結構,但削弱了茶園土壤細菌類群間的連通性。由此可見,有機種植可以增加土壤中微生物的活性和數量,至少不會造成其耕作區(qū)域的生物多樣性降低。另外,福建省大多數茶園是山坡地開墾而來,不同坡面養(yǎng)分在降雨侵蝕過程中的再分配引起土壤理化性質的改變,從而導致土壤微生物群落發(fā)生改變[14—16]。在此背景下,本研究以相鄰常規(guī)茶園(對照)和有機種植模式茶園為對象,分析兩種種植模式下茶園土壤微生物群落結構及多樣性沿坡位的變化趨勢,探討其不同坡位上的差異及影響因素,以期為合理評估有機種植模式的環(huán)境效益提供基礎數據,也可為有機茶園進一步推廣和應用提供科學依據。

1 研究區(qū)域與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于福建省武夷山市中遠生態(tài)茶業(yè)有限公司茶葉種植基地(117°56′E,27°34′N),海拔435m。該區(qū)域屬于亞熱帶季風氣候,四季分明,光照充足(平均日照時數1629h),雨量豐沛(年均降雨量1926.9mm),十分適宜茶樹生長發(fā)育。基地內茶園為典型的丘陵山地茶園,坡度為22°,多由林地開墾而來,土壤類型為花崗巖母質發(fā)育的紅壤。茶樹品種均為肉桂,茶園種植時間為2000年。常規(guī)茶園為長期生產茶園,每年施復合肥(N:P2O5:K2O=15:15:15)2250kg/hm2,施肥方式為撒施,按照春季追肥(2月底至3月上旬,比例為30%)、秋季追肥(8月中下旬,比例為30%)和冬季基肥(12月底至1月,比例為40%)分批次進行,梯壁清耕除草。有機茶園按照有機管理方式進行,隔年施用豆粕餅肥2250kg/hm2,梯壁留草,2005年通過杭州中農質量認證中心的認證。常規(guī)茶園和有機耕作茶園中間種植杉木保護行。

1.2 土壤樣品采集與處理

選取同一坡向的常規(guī)(Conventional tea,CT)和有機茶園(Organic tea,OT)的上坡位(Upper slope,U)、中坡位(Middle slope,M)和下坡位(Lower slope,L)作為試驗樣地,分別記為CTU、CTM 、CTL、OTU、OTM和OUL,采樣時間為2021年3月,具體采樣點見圖1,常規(guī)茶園和有機茶園之間的直線距離不超過100m。在坡面從上至下分為上坡、中坡和下坡, 上坡位距離坡頂約10m,3個坡位之間各相距約30—50m。在每個坡位沿坡面10m范圍內水平設置采樣方,設置3個10m×10m的樣方。采集每個樣方0—20cm土層樣品。采集每個樣方0—20cm土層樣品。每個樣地采集5個土鉆樣品進行充分混合,裝于冰盒中迅速帶回實驗室保存?zhèn)溆?。共采得常?guī)和有機茶園不同坡位的18個樣品。剔去根系和小石塊等雜質后,部分樣品凍存于-80℃冰箱中,用于土壤DNA提取及微生物多樣性分析；一部分樣品風干后分別過2mm和0.149mm篩用于相關土壤理化性質分析。

圖1 研究區(qū)茶園采樣點示意圖Fig.1 The sampling sites of the research area

1.3 研究方法

1.3.1土壤微生物DNA提取與高通量測序

稱取0.5g新鮮土壤樣品,采用土壤DNA提取試劑盒(FastDNA? Spin Kit for Soil,MP Biomedicals, USA)進行提取,提取過程參照說明書進行。提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品質量,用NanoDrop2000超微量分光光度計檢驗DNA的濃度和純度,稀釋合格后的樣品保存于-80℃冰箱用于PCR擴增。細菌選用16S通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)進行擴增[17]。擴增體系為20μL反應體系：4μL的5×FastPfu Buffer,2 μL的2.5mM dNTPs,0.8μL的Forward Primer(5μM),0.8μL的Reverse Primer(5μM),0.4μL的FastPfu Polymerase,0.2μL的BSA和10ng的模板DNA,補dd H2O至 20μL。擴增條件為：95℃預變性3min,95℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 45s,27個循環(huán),72℃延伸10min,10℃直到反應完成。采用Illumina Miseq (PE300,San Diego,CA,USA)高通量測序平臺測定代表細菌16S rRNA序列,委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序工作。

1.3.2土壤理化性質測定

采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定土壤有機質(SOM),采用凱氏定氮法測定土壤全氮(TN),采用堿解擴散法土壤堿解氮(AN),采用鉬銻抗比色法測定土壤有效磷(AP),采用火焰分光光度計法測定土壤速效鉀(AK),采用pH計測定土壤pH(土水比為1∶2.5),采用乙酸鈉-火焰光度法測定土壤陽離子交換量(CEC),采用環(huán)刀法測定土壤容重(BK),以上方法均參照《土壤農業(yè)化學分析方法》進行[18],試驗地土壤理化性質見表1。

表1 茶園土壤理化性質

1.4 數據處理與統(tǒng)計分析

采用 Flash軟件對測序結果進行質量過濾和優(yōu)質序列拼接,得到高質量序列。使用Uparse軟件對序列進行聚類(序列相似性設為 97%),在聚類過程中去除嵌合體,得到操作分類單元(operational taxonomic units)的代表序列。為了得到每個操作分類單元對應的物種分類信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的操作分類單元代表序列進行分類學分析,并在各個水平注釋各樣本群落物種組成信息,細菌16S rRNA比對數據庫為Silva 138(http://www.arb-silva.de)。采用Mothur(1.30.2)計算樣品的 Alpha多樣性指數來反映微生物群落的豐富度和多樣性。采用QIIME計算 Beta多樣性距離矩陣,采用R語言(version 3.3.1)vegan軟件包進行PCoA分析和作圖,研究樣本群落組成的相似性或差異性。土壤細菌功能和代謝途徑預測采用PICRUSt2(22.1.0)軟件進行分析[19],具體分析步驟基于在線分析平臺(https://cloud.majorbio.com/)。土壤細菌群落結構與土壤理化性質之間的相關性采用冗余分析(RDA),采用R語言vegan包進行分析和作圖。采用SPSS(19.0)軟件對土壤理化性質與土壤細菌多樣性指數和土壤細菌優(yōu)勢群落相對豐度的Spearman相關性進行分析。

2 結果與分析

2.1 種植模式和坡位對茶園土壤細菌Alpha多樣性的影響

圖2 相似度為0.97條件下各土壤樣品的稀釋性曲線 Fig.2 Rarefaction curves of each soil sample at similarity of 0.97CTU: 常規(guī)茶園上坡位Upper slope in conventional tea garden；CTM: 常規(guī)茶園中坡位Middle slope in conventional tea garden；CTL: 常規(guī)茶園下坡位 Lower slope in conventional tea garden；OTU: 有機茶園上坡位Upper slope in organic tea garden；OTM: 有機茶園中坡位Middle slope in organic tea garden；OTL: 有機茶園下坡位Lower slope in organic tea garden

高通量測序結果經優(yōu)化后,18個土壤樣品共獲得有效序列548250條,平均長度為410.30bp。18個土壤樣品共獲得23891個細菌操作分類單元,每個樣品操作分類單元數目為880—1817個,平均覆蓋程度為98.71%。從物種稀釋曲線可以看出(圖2),絕大多數樣品的稀釋曲線在急劇上升后變?yōu)樯仙婢?說明本次測序結果能夠反映茶園土壤微生物群落結構組成,測序深度合理。

樣品的Alpha多樣性分析(表2)結果表明,種植模式和坡位對茶園土壤細菌Alpha多樣性影響不大。常規(guī)和有機茶園土壤細菌Alpha多樣性指標均以中坡位最高,其中常規(guī)茶園中坡位土壤細菌Ace、Chao1和Simpson指數均顯著高于下坡位(P<0.05),上坡位和中坡位的土壤細菌Alpha多樣性指標之間差異不顯著(P>0.05)；有機茶園中坡位土壤細菌Shannon指數顯著高于下坡位(P<0.05),其它指標在三個坡位之間差異不顯著(P>0.05)。同一坡位,常規(guī)茶園土壤細菌Alpha多樣性指標大多要高于有機茶園,其中中坡位常規(guī)茶園土壤細菌Sobs和Simpson指數顯著高于有機茶園,常規(guī)和有機種植模式下土壤細菌其它多樣性指數差異不顯著(P>0.05)。雙因素方差分析表明,種植方式和坡位對Shannon指數和Simpson指數影響不顯著,但是種植方式和坡位對Shannon指數和Simpson指數的交互作用顯著；種植方式和坡位對Sobs指數、Ace指數和Chao1指數影響顯著(P<0.01或0.05),但兩者交互作用的影響不顯著。

2.2 種植模式和坡位對茶園土壤細菌群落結構的影響

從18份茶園土壤樣品中檢測到的細菌可劃分為29個門,82個綱,190個目,316個科,517個屬,929個種。根據圖3,在門分類水平上,豐度含量相對較高(>1%)的有綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacterita)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、WPS- 2、浮霉菌門(Planctomycetes)、粘球菌門(Myxococcota)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),其中綠彎菌門、放線菌門、變形菌門和酸桿菌門是絕對優(yōu)勢菌門,約占到了所有細菌總數的72.29%—90.67%。與常規(guī)茶園相比(圖3),有機茶園土壤放線菌門、厚壁菌門和芽單胞菌門的相對豐度極顯著增加,綠彎菌門、粘球菌門、GAL15和未知菌門(unclassified_k__norank_d__Bacteria)的相對豐度極顯著降低。

2013年政府實施了以喚醒民間投資為目的的稅制改革，在特別試驗研究費稅額扣除制度中又增加了企業(yè)間的共同研究。2015年為促進企業(yè)的開放式創(chuàng)新，將扣除率從之前的12%擴充至對方是國立研究機構或大學時達到30%，為企業(yè)時達到20%。

表2 種植模式和坡位對茶園土壤細菌Alpha多樣性的影響

在屬分類水平上(圖3),相對豐度大于1%的屬共有19個,其中AD3、熱酸菌屬(Acidothermus)、norank_f__norank_o__Elsterales和g__norank_f__Xanthobacteraceae的相對豐度大于5%。與常規(guī)茶園相比(圖3),有機茶園土壤熱酸菌屬、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)和JG30-KF-AS9的相對豐度極顯著增加,AD3、TK10及Ktedonobacteraceae、IMCC26256和OF53-F07的相對豐度極顯著降低。

圖3 各樣地細菌群落在門水平和屬水平上相對豐度Fig.3 Relative abundance of soil bacterial community at phylum and genus levels in the different sample plots

2.3 種植模式和坡位對茶園土壤細菌Beta多樣性和差異物種的影響

對不同種植模式和坡位的茶園土壤細菌群落進行 PCoA分析如圖4。常規(guī)種植模式(CT)和有機種植模式(OT)茶園土壤中的細菌群落結構明顯不同(R2=0.3644；P=0.001)。在常規(guī)種植模式茶園中,不同坡位之間的樣品也能夠明顯區(qū)分(R2=0.5862；P=0.0054)；在有機種植模式茶園中,上坡位和中坡位的茶園土壤樣品較為緊密的聚集在一起,且明顯與下坡位樣品分開。置換多元方差分析(PERMANOVA)結果表明(表3),不同種植模式土壤細菌群落達到極顯著的差異(P<0.01),而不同坡位土壤細菌群落無顯著差異(P>0.05),種植模式可以解釋細菌群落29.53%的差異,坡位可以解釋細菌群落15.03%的差異,種植模式對茶園土壤細菌群落結構的影響更大。

圖4 基于Bray-Curtis距離算法的土壤細菌群落PCoA分析圖Fig.4 Principle coordinates analysis based on Bray-Curtis distance method of soil bacterial community structure

為了識別常規(guī)和有機種植模式下具有重要作用的土壤細菌群落的變化,本研究采用LEfSe分析比較在兩種種植模式下的豐度具有統(tǒng)計學差異的生物標志物(biomarker),LDA scor大于2.0的為顯著差異物種,有432種。選擇LDA score大于3.5的差異物種進行LDA進化分枝圖展示(圖5),LDA≥3.5的水平上共有57個差異物種,其中常規(guī)和有機茶園分別有31和26種。常規(guī)茶園(CT)土壤中富集的細菌主要包括放線菌門、綠彎菌門、GAL15和WPS- 2中的一些物種(圖5),如放線菌門中的微球菌目(Micrococcales)、微球菌科(Micrococcaceae)、IMCC26256和中華單胞菌屬(Sinomonas)；綠彎菌門中的纖線桿菌科(Ktedonobacteraceae)、HSB_OF53-F07、B12-WMSP1、AD3及TK10等。有機茶園(OT)土壤中富集的微生物主要包括放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門中其他一些物種,如屬于γ-變形菌綱中黃色單胞菌目(Xanthomonadales)、羅丹諾桿菌科(Rhodanobacteraceae)及Chujaibacter等；屬于放線菌門中弗蘭克氏菌目(Frankiales)、紅桿菌科(Solirubrobacteraceae)、小單孢菌科(Micromonosporaceae)及熱酸菌科(Acidothermaceae)、嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)及JG30-KF-AS9等；屬于厚壁菌門中的芽孢桿菌綱(Bacilli)、芽孢桿菌目(Bacillales)、芽胞桿菌科(Bacillaceae)、動球菌科(Planococcaceae)及芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)；屬于綠彎菌門中纖線桿菌科的JG30-KF-AS9。

圖5 土壤細菌LEfSe分析的進化分支圖(LDA 值大于3.5的物種)Fig.5 Least discriminant analysis (LDA) effect size taxonomic cladogram of the discriminants comparing soil bacteria (Only the taxa with LDA value higher than 3.5 were presented)

表3 置換多元方差分析結果

2.4 種植模式和坡位對茶園土壤細菌功能菌群的影響

基于PICRUSt的原理對茶園土壤細菌代謝功能進行預測,結果如圖6所示。常規(guī)和有機茶園種植模式下土壤細菌群落的一級功能層中包括新陳代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、細胞過程(Cellular Processes)、人類疾病(Human Diseases)及有機系統(tǒng)(Organismal Systems) 6類生物代謝功能,其中新陳代謝功能系統(tǒng)所占最大(比例為78.31%—78.83%),有機系統(tǒng)所占比例最小,僅為1.71%—1.90%。方差分析結果表明,與常規(guī)茶園相比,有機茶園土壤細菌群落的一級功能層中環(huán)境信息處理和有機系統(tǒng)所占比例顯著增加,遺傳信息處理和人類疾病系統(tǒng)所占比例顯著降低。二級功能層分析表明, 共有 46 個子功能組,其中全局概覽通路(Global and overview maps)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、能量代謝(Energy metabolism)、輔助因子和維生素的代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)和膜運輸(Membrane transport)所占比例較高(大于3%)。方差分析結果表明,與常規(guī)茶園相比,有機茶園土壤細菌碳水化合物代謝、氨基酸代謝、膜運輸、信號轉導(Signal transduction)、脂質代謝(Lipid metabolism)及外源生物降解與代謝(Xenobiotics biodegradation and metabolism)功能所占比例顯著增加,全局概覽通路、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝及轉錄功能所占比例顯著降低,其余二級功能所占比例變化不顯著。

圖6 不同種植模式下預測的茶園土壤細菌一級和二級功能層Fig.6 Soil bacterial function prediction in different cropping models圖中一級功能層中：新陳代謝 Metabolis；遺傳信息處理Genetic Information Processing；環(huán)境信息處理 Environmental Information Processing；細胞過程 Cellular Processes；人類疾病 Human Diseases；有機系統(tǒng) Organismal Systems。二級功能層中：全局概覽通路Global and overview maps；碳水化合物代謝Carbohydrate metabolism；氨基酸代謝 Amino acid metabolism；能量代謝 Energy metabolism；輔助因子和維生素代謝 Metabolism of cofactors and vitamins；膜運輸 Membrane transport；Translation Cellular community-prokaryotes；類脂化合物代謝Lipid metabolism；信號轉導 Signal transduction；復制和修復 Replication and repair；核苷酸代謝 Nucleotide metabolism；異種生物降解和代謝 Xenobiotics biodegradation and metabolism；其他次生代謝物的生物合成Biosynthesis of other secondary metabolites；其它氨基酸代謝 Metabolism of other amino acids；折疊、定位和降解 Folding, sorting and degradation；萜類和多酮類化合物的代謝Metabolism of terpenoids and polyketides；聚糖的生物合成和代謝Glycan biosynthesis and metabolism；細胞運動 Cell motility；細胞生長和死亡 Cell growth and death；內分泌系統(tǒng)Endocrine system；抗菌劑耐藥性 Drug resistance: antimicrobial；細菌傳染病 Infectious disease: bacterial；癌癥概述 Cancer: overview；衰老 Aging；神經變性疾病 Neurodegenerative disease；運輸和分解代謝 Transport and catabolism；病毒性傳染病 Infectious disease: viral；環(huán)境適應 Environmental adaptation；內分泌代謝病Endocrine and metabolic disease；抗腫瘤藥耐藥性 Drug resistance: antineoplastic；神經系統(tǒng) Nervous system；心血管疾病 Cardiovascular disease；癌癥:特定類型 Cancer: specific types；轉錄Transcription；免疫系統(tǒng) Immune system；藥物依賴性 Substance dependence；寄生傳染病 Infectious disease: parasitic；免疫性疾病 Immune disease；分泌系統(tǒng) Excretory system；消化系統(tǒng) Digestive system；循環(huán)系統(tǒng) Circulatory system；發(fā)育和再生 Development and regeneration；感官系統(tǒng) Sensory system；細胞群落-真核生物 Cellular community-eukaryotes；信號分子和傳導Signaling molecules and interaction

2.5 土壤理化性質與細菌多樣性及群落結構的相關性

土壤理化性質和細菌群落Alpha多樣性的相關性見圖7。土壤有機質和全氮與細菌Shannon 指數呈極顯著負相關,與Simpson指數極顯著正相關；土壤速效鉀與細菌Chao1指數呈顯著正相關,土壤pH與Sobs和Chao1指數呈顯著正相關,其余指標與土壤細菌多樣性指數之間相關性均未達到顯著性水平?？傮w而言,土壤有機質、全氮、pH對土壤細菌群落多樣性影響較為顯著。

對各樣地土壤細菌門和屬(相對豐度前10)與土壤理化性質進行Spearman 相關性分析,結果見圖8。在門水平上,綠彎菌門與土壤速效磷呈顯著正相關,與土壤全鉀、速效鉀和pH之間極呈顯著負相關；放線菌門與土壤全鉀呈顯著正相關,而酸桿菌門與土壤全鉀呈顯著正相關；厚壁菌門與土壤有機質、全鉀、速效鉀和pH呈顯著或極顯著正相關,與土壤容重、陽離子交換量、全磷和速效磷呈顯著或極顯著負相關；WPS- 2與土壤全鉀和堿解氮呈顯著或極顯著負相關,與土壤陽離子交換量和全磷呈極顯著正相關；粘球菌門與土壤速效鉀和pH呈顯著負相關,與土壤容重呈顯著正相關；GAL15與土壤土壤全鉀、堿解氮和pH呈顯著或極顯著負相關,與土壤容重、陽離子交換量、全磷和速效磷顯著或極顯著負相關；芽孢菌門與土壤全鉀呈極顯著正相關。在屬水平上,土壤有機質和全氮與大多數土壤細菌屬無明顯相關性,土壤全鉀、速效鉀和pH與大多數細菌屬存在顯著或極顯著相關性；未定義Elsterales屬和慢生根瘤菌屬與土壤性質之間相關性不顯著。

圖7 土壤細菌Alpha多樣性指數與土壤理化性質之間的斯皮爾曼相關性分析Fig.7 Spearman correlations between soil bacterial Alpha diversity and soil physical and chemical properties SOM: 土壤有機質 Soil organic matter；TN:總氮Total nitrogen；AN: 堿解氮 Alkaline-N；TP:總磷Total phosphorus；AP: 速效磷Available phosphorus; TK: 總鉀Total potassium；AK: 速效鉀 Available K；CEC:陽離子交換量Cation exchange capacity；pH；BK: 土壤容重 Soil bulk density;*表示P<0.05；** 表示P<0.01；***表示P<0.001

圖8 土壤理化性質與細菌門和屬水平Spearman相關性熱圖Fig.8 Spearman correlations between relative abundance of soil bacteria and soil properties

圖9 門水平和屬水平土壤細菌與土壤性質的冗余分析Fig.9 Redundancy analysis between the relative abundance of soil bacteria at phylum and genus levels and soil properties

表4 環(huán)境因子對RDA結果的解釋權重

3 討論

與常規(guī)種植模式相比,有機種植模式的核心在于生產過程中完全或基本不使用化學生產資料(化肥、農藥及生長調節(jié)劑等)[20],大多采用有機肥滿足農作物的養(yǎng)分需求。土壤微生物群落豐度、多樣性及組成對于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的完整性、功能服務價值和可持續(xù)發(fā)展性至關重要,但它們通常也會因農業(yè)管理模式改變而發(fā)生變化[21—23]。由于土壤微環(huán)境(有無覆蓋物、有機肥投入及輪作等)的不同,有機種植模式下土壤微生物有更好的豐富度和均勻性,且常規(guī)種植模式的土壤微生物群落結構和有機種植模式的土壤微生物群落結構明顯不同[24]。Lori等[25]基于全球149個樣地薈萃分析結果表明,有機種植模式下土壤微生物量碳、微生物氮、總磷脂脂肪酸、脫氫酶、脲酶和蛋白酶活性比常規(guī)種植模式高32%—84%,但不同氣候區(qū)、土地利用方式和作物生命周期(一年生或多年生)之間的差異很大。本研究結果表明,常規(guī)茶園土壤細菌Alpha多樣性指標大多要高于有機茶園(表2),說明有機種植模式并未提高茶園土壤細菌群落多樣性指數,這與Gui等[13]對浙江武義等地有機茶園的研究結果相似。然而江西婺源和湖南有機茶園的一項研究卻表明,有機種植模式下的茶園土壤細菌群落的Alpha多樣性增加[11]。茶園土壤細菌群落多樣性對種植模式轉變的不同響應很可能是由于不同區(qū)域有機種植持續(xù)時間、管理方式及地理位置差異而造成的。上述提到的江西婺源和湖南有機茶園的研究中,兩者有機管理模式持續(xù)時間均超過20年,每年持續(xù)施用有機肥,有機肥持續(xù)分解帶來的有機質對土壤細菌群落多樣性有積極的影響。而本研究中,有機茶園管理時間相對較短,且隔年才施用豆粕餅肥,因而其對土壤細菌群落多樣性的影響不明顯。美國愛荷華州立大學研究農場的長期試驗也表明,玉米-大豆-燕麥-苜蓿輪作有機管理模式雖然明顯改變了土壤細菌群落結構,但是土壤細菌多樣性無顯著影響,并強調廣泛的管理實踐和地理位置的重要性[26]。

雖然茶園土壤細菌群落的多樣性方面對于有機種植模式有著不同的響應機制,但本研究結果表明,土壤細菌群落結構由于有機種植模式的不同而發(fā)生明顯的變化,這與以往多數的研究結果是一致的[27—28]。對不同種植模式茶園土壤細菌群落組成來看,PCoA分析圖清楚地區(qū)分了常規(guī)和有機種植模式下茶園土壤細菌群落組成之間的差異(圖4),這說明有機種植模式成功塑造了茶園土壤微生物群落組成。從坡面尺度來看,本研究中常規(guī)和有機茶園土壤細菌多樣性指標均以中坡位最高(表2),說明坡位對土壤細菌群落多樣性具有明顯影響。同時,在常規(guī)種植模式茶園中不同坡位之間的細菌群落能夠明顯區(qū)分,而有機種植模式茶園中上坡位和中坡位的茶園土壤細菌群落存在明顯重疊區(qū)域,這說明有機種植模式降低了土壤細菌群落組成之間的空間異質性,這可能與有機茶園自然生草所形成的梯壁阻隔帶對整體坡面降雨和養(yǎng)分再分配有關[29]。在丘陵山地坡面上,地形與管理方式是決定土壤理化性質及微生物變化的重要因素,坡面養(yǎng)分在降雨侵蝕過程中的再分配是造成其土壤理化及微生物分布的差異主要因素[30]。福建省山地茶園大多采用等高梯臺種植方式,梯臺方式將坡面分割成若干梯面,改變了地表微地形,能夠一定程度攔截地表徑流,從而使得土壤養(yǎng)分沿茶園坡面進行再分配,故而導致不同坡位的土壤細菌群落組成明顯不同。何燕等[31]對南方丘陵山區(qū)不同坡位茶園研究發(fā)現(xiàn),茶園土壤肥力沿坡面變化明顯,土壤肥力表現(xiàn)為下坡位>上坡位>中坡位。相比常規(guī)種植茶園梯臺清耕作業(yè)而言,自然生草所形成的隔離帶對整體坡面徑流分配和土壤侵蝕過程有分割攔截作用[32],從而削落了土壤水分、養(yǎng)分等土壤性質在坡面的空間分布(導致土壤養(yǎng)分在中坡位聚集,表1)。而這些因素的差異又會影響茶樹生長、根系分泌物數量及土壤有機質的積累, 從而間接影響土壤細菌群落結構組成,進而導致有機茶園不同坡位土壤細菌群落組成變異性更大。

相比種植模式改變土壤細菌多樣性而言,常規(guī)種植和有機模式下差異的微生物具體有哪些(尤其是參與養(yǎng)分循環(huán)和有益微生物)可能更為重要。LEfSe分析結果表明常規(guī)和有機模式下產生了大量顯著差異的微生物類群(圖5),在不同的門或屬的分類學水平上分布很多差異的微生物,其中大多數微生物與土壤養(yǎng)分循環(huán)有關。與常規(guī)茶園相比,有機茶園土壤放線菌門、厚壁菌門和芽單胞菌門的相對豐度極顯著增加。變形菌門中包括可以固氮的細菌[33],有機種植模式茶園中參與氮素循環(huán)的芽孢桿菌屬、芽孢八疊球菌屬、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)及弗蘭克氏菌目(Frankiales)等豐度含量顯著增加,這與印度潘特納加邦有機農場[34]和荷蘭瓦赫寧根有機農場[35]的研究結果一致。同時,節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)是一種具有較高遺傳適應性的細菌,能利用各種有機物碳源和能源并降解土壤中難降解的物質[36],有機種植模式提高了茶園土壤節(jié)桿菌屬細菌相對豐度。另外,有機種植模式通常被認為能夠降低土壤中致病性細菌的豐度,降低土傳病害的發(fā)生。有研究表明,抑病性細菌在控制土傳病害中起著重要作用,在有機模式下厚壁菌門和放線菌門豐度増加被認為和土壤抑病性密切相關[37]。此外,一些特定的細菌種屬,如假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、伯克氏菌屬(Burkholderia)及放線菌屬(Actinomyces) 能夠起到溶解病原菌、防治植物土傳病害、分泌抗菌抑制劑和誘導植物抗性蛋白表達等多種作用[38—40],在健康土壤中相對豐度較高。本研究中,有機茶園土壤中類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、芽孢桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)、脂環(huán)酸芽胞桿菌屬(Alicyclobacillus)和短芽胞桿菌屬(Brevibacillus)的相對豐度是常規(guī)茶園的2.85、25.37、3.24、3.72和3.33倍；同時,一些致病菌如黃桿菌屬(Flavisolibacter)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)和普氏菌屬(Prevotella)等在有機茶園中的相對豐度也顯著低于常規(guī)茶園,說明有機種模式能夠促進茶園土壤中具有生態(tài)防控和促生功能有益細菌的積聚,且能夠一定程度抑制土壤一些致病菌的繁殖,緩解長期植茶帶來的連作障礙。

已有研究表明,種植模式對土壤細菌群落結構的影響,可能會進一步導致土壤細菌群落功能組成的差異[41]。PICRUSt是一款基于標記基因序列來預測功能豐度的軟件平臺,其通過與 KEGG 數據庫比對,能夠將細菌的變化情況和生物功能聯(lián)系起來[42]。本研究中,利用 KEGG 代謝途徑對不同種植模式下土壤細菌功能進行預測,不同種植模式下茶園土壤細菌共涉及代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理等6個代謝通路,分屬于46個子功能,充分證明其功能上的豐富性。在一級功能層中,代謝功能系統(tǒng)所占最大(比例為78.31%—78.83%),有機系統(tǒng)所占比例最小(僅為1.71%—1.90%),說明代謝在茶園土壤細菌生長過程中有著極其重要的作用,這與以往的研究結果一致[43]。有研究表明,由于功能基因中代謝功能的主要作用是通過攝取氨基酸、碳水化合物、維生素等營養(yǎng)物質來保證細菌的生長[44]。本研究中與代謝相關的二級功能層中氨基酸代謝、碳水化合物代謝和能量代謝占比較高,氨基酸代謝可以幫助細菌吸收氨基酸,有利于加速有機物礦化,促進植物氮素吸收利用[45]；碳水化合物代謝與固氮、溶磷等作用密切相關,有利于促進植物的氮、磷循環(huán)[46—47]。茶園采用有機管理模式后,茶園自然生草使得茶園生態(tài)系統(tǒng)根系更為豐富,隨著植被凋落物和根際沉積物中的復雜化合物增加,土壤細菌需要復雜的酶來分解這些大分子,因而促使細菌碳水化合物代謝、氨基酸代謝、膜運輸、信號轉導、脂質代謝及外源生物降解與代謝功能得以加強,提高其功能基因的豐度,進而使表層土壤碳氮循環(huán)效率得以提升。

茶樹作為高酚酸含量及根系分泌酚酸較高的多年生作物[48],其生物學特性和耕作制度(施肥、生草覆蓋、除草及農藥等)都可能使土壤理化性質發(fā)生改變,如土壤酸化嚴重,鋁、氟和酚類物質在茶園土壤中富集,進而影響對土壤細菌多樣性和群落結構[49]。本研究結果表明,土壤有機質、全氮、pH是影響土壤細菌群落多樣性的主要土壤因子,這與多數的研究結果基本一致[50—51]。冗余分析結果也表明,土壤堿解氮、速效磷、全磷、全鉀和pH對土壤中的細菌群落組成有顯著或極顯著的影響,這說明土壤營養(yǎng)元素和pH改變了不同種植模式下茶園土壤細菌群落結構。以往研究表明大尺度范圍內土壤pH值是影響土壤細菌群落結構的重要因子[52—53],土壤pH雖然不改變細菌群落本身,但是直接或間接地改變土壤養(yǎng)分可有效性、酶活性及根系分泌物等,從而對土壤細菌群落多樣性及組成產生影響。Lauber等[54]關于美國南北的88份陸地土壤研究結果顯示,土壤pH值與細菌群落組成、譜系多樣性均顯著相關,土壤pH對美國陸地范圍內的土壤細菌群落結構起決定作用；Zhou等[55]基于全球1235個實驗觀察結果發(fā)現(xiàn),土壤pH處于一定范圍(生態(tài)位)時,土壤pH是驅動全球土壤微生物對環(huán)境響應的的重要預測因子；有關中國東部農田[56]、亞熱帶闊葉林[57]、青藏高原高寒濕地[58]和草地[59]研究結果也證實土壤pH是影響細菌群落地理分布的主要環(huán)境因子。與常規(guī)茶園相比,由于施用豆粕有機肥和自然生草覆蓋使得有機茶園土壤pH顯著提高了0.36—0.50個單位,因而部分與pH呈顯著正相關的厚壁菌門含量明顯增加(圖8)。同時,除了土壤pH外,土壤中氮磷鉀等營養(yǎng)元素含量與細菌群落密切相關。本研究中,RDA結果揭示了堿解氮、速效磷、全磷和全鉀是影響土壤細菌群落結構和組成的關鍵因素(圖9,表4),說明常規(guī)種植模式的大量化肥投入明顯增加速效養(yǎng)分含量(尤其是速效磷含量大幅度積累)的同時也影響細菌群落的組成。Geel等[60]研究表明,有機種植模式對葡萄園土壤叢枝菌根多樣性方面的潛在好處被土壤高磷水平所嚴重損害,減少養(yǎng)分投入,提高土壤pH值是改善土壤叢枝菌根多樣性的關鍵步驟；Li等[61]研究發(fā)現(xiàn),土壤有效磷對根際微生物的相互作用非常重要,向土壤中施用大量有效磷可能導致植物有益微生物的消耗,同時增加致病微生物豐度并影響植物健康。本研究中也發(fā)現(xiàn)(表5),土壤全磷和速效磷與致病菌黃桿菌屬和鞘脂單胞菌屬之間呈顯著或極顯著正相關,與土壤中有益菌(類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、短芽胞桿菌屬和芽單胞菌屬)之間呈顯著或極顯著負相關。由此可見,速效磷含量過高的常規(guī)茶園可以通過適當減施磷肥或短期內不施磷肥來降低茶園土壤致病微生物的數量,還可以通過增施有機肥或土壤改良劑來提高土壤pH,從而增加土壤有益微生物數量,進而有利于茶園土壤微生物區(qū)系的協(xié)調發(fā)展。

表5 土壤磷與土壤致病菌和有益菌Spearman相關性分析

4 結論

相比常規(guī)茶園而言,有機種植模式對于茶園土壤細菌群落多樣性無明顯變化,但顯著改變了茶園土壤細菌群落結構。常規(guī)種植模式茶園中不同坡位之間的細菌群落能夠明顯區(qū)分,有機種植模式降低了茶園土壤細菌群落的空間異質性。PICRUSt2功能預測表明,茶園土壤細菌群落主要涉及6個一級功能層和46個二級功能層,土壤細菌群落在代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息方面功能活躍。有機種植模式提高了土壤細菌碳水化合物代謝、氨基酸代謝、膜運輸、信號轉導、脂質代謝及外源生物降解與代謝功能,有利于增強土壤碳氮代謝能力。Spearman相關分析和冗余分析結果表明,土壤堿解氮、速效磷、全磷、全鉀和pH是影響土壤細菌群落豐度和多樣性的主要影響因子。總之,有機種植模式改變了茶園土壤細菌群落結構,增加土壤有益細菌的數量,促進土壤細菌代謝功能,對茶園可持續(xù)發(fā)展及合理耕作具有重要意義。