王 劭，肖世峰，程曉霞，江丹丹，林鋒強，朱小麗，陳少鶯，陳仕龍*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

小鵝瘟是由鵝細小病毒(goose parvovirus，GPV)引起的雛鵝和雛番鴨的一種傳播快、病死率高的高度接觸性傳染病，該病最早于1956年在我國江蘇等養(yǎng)鵝地區(qū)發(fā)生，并很快蔓延到全國各養(yǎng)鵝地區(qū)，但極少見到番鴨發(fā)病[1]。自1997年以來該病在福建莆田、福清等地的番鴨養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)流行，發(fā)病幼番鴨以腹瀉、腸黏膜脫落形成栓塞為主要特征，發(fā)病率為50%～70%，病死率為40%～65%，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[2]。有報道從臨床剖檢為小腸纖維素性栓塞的患病幼番鴨肝脾勻漿中分離到包括PT株在內(nèi)的地方流行番鴨小鵝瘟病毒(Muscovy duck origin goose parvovirus，MDGPV)，并證實國內(nèi)流行的番鴨小鵝瘟病原為番鴨源鵝細小重組病毒[3-4]。

細胞自噬是一種在真核細胞中高度受調(diào)控的、溶酶體依賴性的重要細胞代謝調(diào)控過程，通過降解非功能性蛋白聚集體和衰老或損傷的細胞器，重新合成大分子物質(zhì)或產(chǎn)生三磷酸腺苷[5]，通過細胞自噬不僅可以為細胞提供養(yǎng)分來應對營養(yǎng)缺乏、低氧和炎癥等應激狀態(tài)，也可以消除潛在的感染因子而使細胞得以繼續(xù)生存，但自噬的過度激活或自噬功能的障礙也參與了一些疾病的致病過程[6-7]，因此細胞自噬在維持生物體的細胞動態(tài)平衡、發(fā)育、衰老、退化及免疫防御等方面都扮演著重要的角色[8]。自噬不僅是固有免疫系統(tǒng)的重要組分，而且也可以通過內(nèi)源性抗原提呈調(diào)節(jié)適應性免疫應答，協(xié)調(diào)宿主抵抗或清除包括病毒在內(nèi)的不同病原微生物[9]。隨著自噬相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路分子機制的深入研究，自噬被認為是免疫系統(tǒng)中一個完整的部分，既可以感知病毒感染，又具有抗病毒效應[10]。因此，自噬與病毒之間相互調(diào)控作用機制的闡釋，對于深入研究病毒感染的侵入機制以及發(fā)展預防和治療病毒感染的新方法都具有非常重要的作用。

自噬代表了一種重要的細胞內(nèi)在防御機制，可以抵御包括病毒在內(nèi)的細胞內(nèi)病原體的入侵，可以通過特異性識別被泛素修飾的病毒成分，將其運送到溶酶體選擇性降解與病毒顆粒相關(guān)的免疫抗原，還可以促進病毒成分與專門激活先天免疫途徑的受體之間相互作用，或促進抗病毒適應性免疫的激活[11]。為了應對這種壓力，病毒進化出各種復雜的策略來避免抗病毒自噬反應或操縱自噬機制以促進自身復制。ZHANG等[12]研究表明，豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)感染豬睪丸細胞(swine testis cells，ST)后不僅可以誘導細胞自噬，還能借助細胞過程促進PPV的復制。ZHANG等[13]的研究進一步表明PPV感染豬胎盤滋養(yǎng)層細胞(porcine placenta trophoblast cells，PTC)早期，雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)誘導的完全自噬通量或RAPA+巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1，Baf A1)共同誘導的不完全自噬促進了PPV的復制，而3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)、自噬相關(guān)蛋白5(autophagy related protein 5，ATG5)基因敲除可以抑制自噬體的形成并降低了PPV在PTC中的復制水平。人細小病毒 B19(human parvovirus B19，B19)感染UT7/Epo-S1細胞中Ⅱ型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3)，即LC3-Ⅱ蛋白表達量在感染細胞中顯著增加，表明B19 感染可誘導細胞內(nèi)自噬體的增加。此外，3-MA 對自噬的抑制作用顯著促進 B19 感染介導的細胞死亡，這些結(jié)果揭示了 B19 感染的細胞可通過自噬穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境,維持細胞存活的新機制[14]。鱗翅目濃核病毒(lepidopteran ambidensovirus)非結(jié)構(gòu)蛋白的表達導致雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin，mTOR)通路失活，抑制負調(diào)控自噬的mTORC1信號通路，從而激活昆蟲細胞自噬并控制細胞信號傳導機制，有利于病毒mRNAs的翻譯，從而促進病毒蛋白的高水平表達[15]。

目前尚未見MDGPV復制與細胞自噬之間關(guān)系的報道，本試驗利用MDGPV分別感染番鴨胚成纖維細胞(primary Muscovy duck embryo fibroblasts，MDEFs)與鴨胚胎肝間充質(zhì)干細胞(duck embryo liver mesenchymal stem cells，DuLMSCs)，通過檢測自噬信號通路中相關(guān)蛋白的表達情況，明確細胞自噬與MDGPV復制之間的關(guān)系，以期進一步明晰MDGPV分子致病機理及其與宿主細胞間的關(guān)系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞MDGPV-PT株細胞適應毒由本實驗室保存；MDEFs按常規(guī)方法制備；DuLMSCs為本實驗室保存。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Anti-LC3B antibody(L7543)、Anti-phospho TFEB(Ser142)(ABE1971-I)購自Sigma-Aldrich公司；Anti-TFEB rabbit polyclonal antibody(D123310)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Anti-phospho-mTOR(Ser2448)antibody(BM4840)、Anti-mTOR antibody(BM4182)、Anti-β-actin antibody(BM0627)、HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-mouse IgG(H+L)(BA1051)、HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG(H+L)(BA1055)、FITC Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG(H+L)(BA1105)購自博士德生物工程有限公司；RAPA(HY-10219)、氯喹(Chloroquine，CQ)(HY-17589A)、3-MA(HY-19312)購自MedChem Express公司。

1.3 激光共聚焦顯微鏡觀察將MDEFs(DuLMSCs)細胞接種于預先放入了蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞長到覆蓋率為80%左右時，利用感染復數(shù)(MOI)為1的MDGPV-PT感染細胞24 h(并設陰性對照組細胞)，預冷PBS洗滌3次、每次5 min，棄上清；4% 多聚甲醛固定細胞爬片10 min，預冷PBS洗滌3次、每次5 min，棄上清；2% Triton X-100通透細胞10 min，PBS洗滌3次、每次5 min，棄上清；5% BSA封閉2 h，預冷PBS洗滌3次、每次5 min，棄上清；加入兔抗 LC3-Ⅱ抗體(1∶500)4℃孵育過夜，預冷PBS洗滌3次、每次 5min；加入羊抗兔 IgG-FITC(1∶100)37℃ 孵育1 h 后，預冷PBS洗滌3次、每次 5 min；最后用 DAPI 染色并封片，室溫孵育5 min，預冷PBS洗滌3次、每次5 min；置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 病毒感染與藥物分組處理將處于對數(shù)生長期的MDEFs(DuLMSCs)細胞接種于6孔板，培養(yǎng)至細胞匯合度為80%，共9組細胞，分別命名為：MDGPV-PT感染組、MDGPV-PT滅活組、正常細胞對照組、RAPA組、3-MA組、CQ組、RAPA+PT組、3-MA+PT組、CQ+PT組。MDGPV-PT感染組使用1MOI MDGPV-PT株吸附單層細胞2 h，再用無菌PBS洗去未黏附病毒，加入含2%血清的細胞維持液；MDGPV-PT滅活組用甲醛滅活的PT病毒株吸附2 h；正常細胞對照組不做處理。RAPA組、3-MA組和CQ組分別使用100 nmol/L，5 mmol/L，50 μmol/L預處理30 min；RAPA+PT組、3-MA+PT組、CQ+PT組分別先使用100 nmol/L RAPA、5 mmol/L 3-MA、50 μmol/L CQ預處理30 min，再用1 MOI PT病毒株吸附2 h。藥物處理組細胞均換成含有上述等同濃度藥物的新鮮細胞維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以上9組細胞均置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6，12，18，24，30，36 h。

1.5 Western blot檢測自噬相關(guān)因子蛋白的表達分別收集感染組與藥物處理組不同時間點MDEFs(DuLMSCs)細胞，用預冷PBS洗滌細胞2次，并加入裂解液，冰浴裂解30 min。13 000×g離心10 min后取上清，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸 10 min后，12 000×g離心10 min。將處理好的樣品進行 SDS-PAGE 電泳，用半干法(15 V，20 min)將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，用 50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉 1 h；一抗4℃ 孵育過夜，然后 TBST 洗膜 3 次、每次 5 min；室溫孵育對應的抗兔或抗小鼠的IgG-HRP二抗 1 h，TBST 洗膜 3 次、每次 5 min；加 ECL 發(fā)光液，自顯影儀曝光照相。

2 結(jié)果

2.1 MDGPV感染細胞后誘導細胞內(nèi)自噬體的形成在自噬過程中，細胞溶質(zhì)形式的LC3(LC3-Ⅰ)與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合形成LC3-PE結(jié)合物(LC3-Ⅱ)，隨即被招募到自噬體膜上。LC3-Ⅱ作為自噬體標記物，廣泛用于監(jiān)測自噬。本研究利用激光共聚焦顯微鏡觀察LC3標記自噬熒光顆粒的形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒感染MDEFs(DuLMSCs)細胞24 h 后，與正常對照組細胞相比，自噬熒光蛋白聚集點明顯增加(圖1，2)。結(jié)果表明，MDGPV-PT細胞適應毒感染MDEFs和DuLMSCs細胞后能夠誘導細胞自噬。

A～C.MDGPV感染的MDEFs細胞；D～F.正常對照組MDEFs細胞

2.2 MDGPV-PT細胞適應毒感染、自噬激活劑和抑制劑對MDEFs細胞的影響Western blot檢測MDGPV-PT感染、自噬激活劑和抑制劑處理的MDEFs細胞自噬標志蛋白LC3-Ⅱ水平變化，結(jié)果如圖3所示：MDGPV-PT感染組、RAPA組和RAPA+PT組中LC3-Ⅱ表達量均呈現(xiàn)先增加后逐步減少的趨勢，且LC3-Ⅱ表達量分別在處理24，30，18 h后達到最大，表明RAPA處理與PT感染均可誘導MDEFs細胞自噬，其中RAPA+PT組中LC3-Ⅱ表達量最大值時間提前，表明RAPA做為一種mTOR變構(gòu)抑制劑，可直接抑制mTOR的活性，可以促進MDGPV-PT誘導的MDEFs細胞自噬[16]；CQ和CQ+PT組LC3-Ⅱ的表達量發(fā)生了累積，表明CQ通過阻止自噬體與溶酶體的融合，作用于MDEFs細胞自噬的后期階段，從而阻斷了完整自噬流的產(chǎn)生[17]；3-MA與3-MA+PT組中LC3-Ⅱ表達量明顯減少，表明3-MA能特異性抑制Ⅲ型磷酸肌醇3磷酸激酶(Class Ⅲ PI3K)，進而抑制自噬體的形成，可以阻斷MDGPV-PT誘導的MDEFs細胞自噬[18-19]。正常對照細胞組與PT滅活組一樣，均未見LC3-Ⅱ蛋白明顯表達，表明這兩組細胞自噬活性比較低或自噬相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路未激活。為了揭示MDGPV復制是否是誘導自噬所必需的，使用甲醛滅活的MDGPV感染MDEFs細胞，與正常細胞對照組一樣，甲醛滅活的MDGPV感染的MDEFs細胞中的LC3蛋白沒有從LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，結(jié)果表明MDGPV誘導細胞自噬需要病毒的有效復制。

A～C.MDGPV感染的DuLMSCs細胞；D～F.正常對照組DuLMSCs細胞

圖3 不同處理組MDEFs細胞LC3-Ⅱ表達的Western blot檢測結(jié)果

2.3 MDGPV-PT細胞適應毒感染對MDEFs細胞p-mTOR水平的影響為進一步確定MDGPV引發(fā)MDEFs細胞自噬的途徑，對感染細胞內(nèi)磷酸化mTOR(p-mTOR)以及總mTOR水平進行Western blot分析，結(jié)果如圖4所示：正常細胞對照組p-mTOR 和mTOR的表達量變化幅度很?。籔T組p-mTOR蛋白表達量逐漸下降，而mTOR表達量基本不變，因此自噬調(diào)控信號通路蛋白p-mTOR表達量在各時間點的動態(tài)變化表明MDGPV-PT可以誘導MDEF細胞自噬。

圖4 不同處理組MDEFs細胞p-mTOR表達的Western blot檢測結(jié)果

2.4 MDGPV-PT細胞適應毒感染對MDEFs細胞p-TFEB水平的影響為了進一步確定MDGPV引發(fā)MDEFs細胞自噬是否與mTOR/TFEB信號通路有關(guān)，對感染細胞內(nèi)TFEB(TFEB)以及磷酸化TFEB(p-TFEB)水平進行Western blot分析，結(jié)果如圖5所示：正常細胞對照組TFEB以及p-TFEB的表達量變化幅度很?。籔T組細胞質(zhì)中p-TFEB表達量逐漸下降，而細胞中TFEB總蛋白表達量基本不變。結(jié)果表明，MDGPV-PT感染可以通過mTOR/TFEB信號途徑，降低TFEB磷酸化水平，促進MDGPV感染MDEFs細胞中溶酶體生物合成以及自噬相關(guān)基因的表達。

圖5 不同處理組MDEFs細胞p-TFEB表達的Western blot檢測結(jié)果

2.5 MDGPV-PT細胞適應毒感染、自噬激活劑和抑制劑對DuLMSCs細胞的影響應用Western blot檢測MDGPV-PT感染、自噬激活劑和抑制劑處理DuLMSCs細胞后6，12，18，24，30，36 h監(jiān)測LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖6所示：在β-actin表達量一致的基礎(chǔ)上，可以發(fā)現(xiàn)，與正常對照細胞組與PT滅活組相比，MDGPV-PT感染組、RAPA組和RAPA+PT組，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化均呈現(xiàn)先增加后逐步減少的趨勢，且LC3-Ⅱ表達量分別在處理24，30，18 h后達到最大，其中RAPA+PT組24 h時DuLMSCs細胞中LC3-Ⅱ表達量的明顯升高表明RAPA可以促進病毒誘導的自噬發(fā)生；CQ和CQ+PT組LC3-Ⅱ的表達量發(fā)生了累積，表明CQ作為經(jīng)典的自噬抑制劑，通過改變?nèi)苊阁w的酸性環(huán)境阻斷自噬體與溶酶體的結(jié)合，使得大量的待降解蛋白在細胞中堆積，從而阻斷了藥物處理與病毒感染DuLMSCs細胞中完整自噬流的產(chǎn)生；3-MA與3-MA+PT組中LC3-Ⅱ表達不明顯，表明3-MA可以作用于自噬誘導階段，通過靶向VPS34激酶在自噬體形成的早期階段，干擾或抑制MDGPV-PT誘導的DuLMSCs細胞自噬[20-21]。正常對照細胞組與PT滅活組一樣，均未見LC3-Ⅱ蛋白明顯表達，表明這兩組細胞中尚無激活的自噬流產(chǎn)生。為了解滅活的MDGPV是否能夠誘導細胞自噬的發(fā)生，使用甲醛滅活的MDGPV感染MDEFs細胞，與正常的MDGPV感染組相比，甲醛滅活MDGPV感染MDEFs細胞后，Western blot未檢測到活病毒誘導的明顯LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，卻類似于正常細胞對照組的檢測結(jié)果，表明甲醛滅活的MDGPV感染細胞后不能誘導有效的自噬應答。

圖6 不同處理組DuLMSCs細胞LC3-Ⅱ表達的Western blot檢測

2.6 MDGPV-PT細胞適應毒感染對DuLMSCs細胞p-mTOR水平的影響對感染DuLMSCs細胞內(nèi)磷酸化mTOR(p-mTOR)以及總mTOR水平進行Western blot分析，在內(nèi)參基因β-actin恒定表達的基礎(chǔ)上，結(jié)果顯示，正常細胞對照組p-mTOR和mTOR以及PT組mTOR蛋白表達無明顯差異，而在PT感染DuLMSCs細胞后p-mTOR表達量逐步減少，其變化趨勢與MDEFs細胞病毒感染組基本一致，表明MDGPV-PT感染可以誘導DuLMSCs細胞發(fā)生自噬(圖7)。

圖7 不同處理組DuLMSCs細胞p-mTOR表達的Western blot檢測結(jié)果

2.7 MDGPV-PT細胞適應毒感染對DuLMSCs細胞p-TFEB水平的影響為了解MDGPV感染引發(fā)的DuLMSCs細胞自噬與mTORC1下游調(diào)控因子TFEB表達是否具有相關(guān)性，對感染DuLMSCs細胞內(nèi)p-TFEB以及總TFEB水平進行Western blot分析，結(jié)果顯示，正常細胞對照組p-TFEB和TFEB以及PT感染組TFEB蛋白表達無明顯差異，而在PT感染DuLMSCs細胞后p-TFEB表達量逐步減少，表明MDGPV-PT感染可以通過 mTOR信號通路使TFEB去磷酸化，提高MDGPV感染DuLMSCs細胞的溶酶體自噬水平(圖8)。

圖8 不同處理組DuLMSCs細胞p-TFEB表達的Western blot檢測結(jié)果

3 討論

LC3蛋白是自噬體的重要組成部分，屬于微管相關(guān)蛋白家族(microtubule associated protein，MAP)成員，包括2種可相互轉(zhuǎn)化的形式即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，參與了自噬體膜的形成。自噬開始后細胞質(zhì)中LC3的C端被自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related protein，Atg)Atg4蛋白酶酶切后生成胞漿可溶型LC3-Ⅰ，而LC3-Ⅰ被Atg7活化并與細胞器膜中的PE以泛素樣反應的方式共軛形成脂質(zhì)化膜結(jié)合型LC3-Ⅱ[22]。因此，LC3蛋白在細胞自噬發(fā)生過程中被選擇性地招募到自噬小泡中，這可以被認為是自噬降解途徑中，從彌漫性胞質(zhì)定位到特征性點狀自噬小體雙層膜定位模式的再分配。LC3-Ⅱ是自噬體膜(autophagic membrance)延伸和閉合所必需的，在吞噬小體的內(nèi)膜和外膜上都有分布，已成為研究自噬水平高低的標志性蛋白[23]。本試驗MDGPV-PT細胞適應毒感染MDEFs和DuLMSCs細胞后，LC3-Ⅱ表達量均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，在MDEFs細胞組中的表達水平更高，說明MDGPV-PT感染可以誘發(fā)MDEFs 和DuLMSCs細胞的自噬活性，并且細胞自噬效應隨著病毒感染時間的不同而產(chǎn)生變化。本研究中，正常對照細胞MDEFs 和DuLMSCs對照組中LC3-Ⅱ表達量很低，表明試驗選取的細胞在通常情況下保持著極低的自噬水平，細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)性好。

mTOR是一種進化上相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為自噬啟動階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可受生長因子、營養(yǎng)物質(zhì)、能量狀態(tài)與氧化應激等多種因素的影響，可抑制細胞自噬的發(fā)生，是自噬的負調(diào)控分子[24]。mTOR包含mTORC1和mTORC2兩種復合物，其中mTORC1是自噬過程的主要調(diào)節(jié)因子，在營養(yǎng)和能量充足的條件下，處于活化狀態(tài)的mTORC1通過磷酸化ATG13，阻止其與Atg1、Atg17、Atg101形成unc-51樣激酶1(unc-51-like kinase 1，ULK1)復合物，進而阻斷細胞質(zhì)膜上ULK1復合物參與自噬小體的形成，同時促進核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)黏附，阻礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落形成自噬體膜，從而抑制自噬。當細胞處于營養(yǎng)和能量不足等應激狀況下時，mTORC1磷酸化程度降低，對ULK1與Atg13的磷酸化抑制作用減弱，促使ULK1自磷酸化并磷酸化Atg1、Atg13、Atg101和其他Atg蛋白。激活的ULK1 復合物隨后轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的隔離膜上，啟動膜泡成核反應并介導自噬體的形成[25]。因此，mTOR 磷酸化(p-mTOR)激活程度也是研究自噬的一個重要觀察指標[26]。本研究Western blot檢測結(jié)果表明，MDGPV-PT細胞適應毒感染的細胞中mTOR信號通路調(diào)控正常，p-mTOR蛋白表達水平出現(xiàn)逐漸減少的趨勢，說明MDGPV-PT感染MDEFs 和DuLMSCs誘發(fā)細胞自噬時，細胞內(nèi)mTOR磷酸化水平被抑制。相比之下，MDEFs 和DuLMSCs正常對照細胞中的mTOR及其磷酸化水平均保持相對穩(wěn)定，說明陰性對照細胞自噬水平極低。

轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)是堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈bHLH-LZ(basic-helix-loop-helix leucine zipper)類轉(zhuǎn)錄因子中MiTF/TFE(microphthalmia-transcription factor E)家族的成員之一，能夠通過識別回文E盒基序(GTCACGTGAC)，活化下游基因并促其轉(zhuǎn)錄，參與多種細胞調(diào)控，其被確定為調(diào)節(jié)溶酶體功能及自噬的關(guān)鍵因子，在調(diào)節(jié)協(xié)同溶酶體表達和調(diào)控(coordinated lysosomal expression and regulation，CLEAR)網(wǎng)絡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，TFEB的活化可以增加溶酶體相關(guān)蛋白的合成，加快自噬過程，正向調(diào)節(jié)自噬體形成[27]。有研究表明，TFEB絲氨酸(Serine，Ser)位點磷酸化是mTORC1靶蛋白感應與通路調(diào)控的一個組成部分，TFEB 的Ser142位點磷酸化則抑制 TFEB 活化，可以下調(diào)細胞自噬水平，而去磷酸化的TFEB 可以進入細胞核與核內(nèi)CLEAR序列結(jié)合，促進下游溶酶體相關(guān)基因的表達，增強溶酶體的生物合成及生理功能，細胞自噬水平也隨著TFEB表達的增加而提高[28]。因此，TFEB是細胞自噬的重要調(diào)控因子。本研究應用Western blot檢測MDGPV-PT細胞適應毒感染細胞和正常對照細胞中TFEB與p-TFEB的表達情況，病毒感染MDEFs和DuLMSCs細胞后，p-TFEB表達水平呈下降趨勢，參與溶酶體自噬生物發(fā)生。相比之下，MDEFs 和DuLMSCs正常對照細胞中的TFEB及其磷酸化水平均保持相對穩(wěn)定，說明陰性對照細胞自噬水平低，胞質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)生理正常。

本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)甲醛滅活的MDGPV-PT感染的MDEFs 和DuLMSCs細胞中LC3蛋白沒有從LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，說明MDGPV-PT感染細胞能夠誘導自噬，并且這種誘導需要病毒的復制，細胞自噬在MDGPV的生活周期中可能發(fā)揮著重要的功能。MDGPV如何誘導自噬體以及利用自噬體的形成來實現(xiàn)病毒復制增殖的機理，還有待于進一步的深入研究。綜上所述，本研究首次證實MDGPV-PT細胞適應毒感染MDEFs 和DuLMSCs細胞能夠誘導細胞自噬，且與細胞內(nèi)mTOR信號通路中p-mTOR與p-TFEB水平降低有關(guān)。