李 琦，秦 雪，馮 瑞，趙 騫，鄭 鵬

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

奶牛的正常受胎和分娩是保證持續(xù)產(chǎn)奶的基礎(chǔ)，隨著奶牛的不斷選育，奶牛的產(chǎn)奶量不斷提高，而奶牛的繁殖力卻逐年降低[1]，輸精后35 d的妊娠率只有30%～50%，40%～60%的胚胎在妊娠識別和附植期間丟失[2]。胚胎附植又稱胚胎著床，是胚胎到達(dá)子宮定位后，與子宮內(nèi)膜上皮接觸、黏附和附植的過程。正常情況下，子宮只有在某個特定時期允許胚胎附植，這一時期即為附植窗口[3]。此時，胚泡滋養(yǎng)層達(dá)到侵入狀態(tài)，子宮內(nèi)膜達(dá)到接受狀態(tài)，且兩者同步發(fā)生[4]。

奶牛胚胎在妊娠識別和附植期間，卵巢上的黃體分泌的孕酮是調(diào)控子宮內(nèi)膜的同步化、保證胚泡成功附植的重要激素[5]。孕酮作用于子宮，刺激子宮腺的增長與分泌，抑制子宮肌的蠕動，為胚胎著床與發(fā)育創(chuàng)造了有利條件。奶牛妊娠早期，孕酮不足可導(dǎo)致妊娠率降低[6-7]。LPEZ等[8]研究發(fā)現(xiàn)，配種后第5天，乳汁中孕酮質(zhì)量濃度大于3 μg/L的母牛受胎率為50%，而孕酮質(zhì)量濃度小于1 μg/L的母牛受胎率僅為10%。因此，黃體功能不足、分泌孕酮水平過低，是導(dǎo)致奶牛早期胚胎附植率低的主要原因。

本試驗(yàn)使用孕酮處理奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，研究孕酮對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡和容受性的影響，為進(jìn)一步明確孕酮調(diào)控奶牛子宮容受性的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為在生產(chǎn)中提高奶牛繁殖力提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)皿(Corning)，DMEM/F12(Hyclone)，F(xiàn)BS(Gibco)，雙抗(10 000 U/mL的青霉素和10 g/L的鏈霉素，Biosharp)，孕酮(Sigma)，CCK8試劑盒(Bimake)，Cytokeratin 18(KRT-18，Bioss)，TRIzol(Invitrogen)。

1.2 免疫熒光染色解凍牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，使用 DMEM/F12+10% 胎牛血清(FBS)+1% 雙抗，在37.5℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長到80%以上時，傳代到60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行免疫熒光染色。參考WANG等[9]的方法，步驟為：PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。5% 牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。用1% BSA稀釋的一抗(KRT-18)在4℃孵育過夜。PBS清洗3次，1% BSA稀釋的熒光標(biāo)記二抗在室溫孵育1 h，用DAPI復(fù)染5 min。PBS清洗3次后，熒光顯微鏡觀察。

1.3 孕酮質(zhì)量濃度的篩選牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞生長到80%以上時，將細(xì)胞傳代至96孔培養(yǎng)板內(nèi)(每孔104個細(xì)胞)，培養(yǎng)12 h后加入不同質(zhì)量濃度的孕酮(10，25，50，100 μg/L)，24 h后加入10 μL的CCK8試劑，37℃孵育2 h，在450 nm波長下檢測，根據(jù)D450 nm值計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與處理牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長到80%以上時，傳代至60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后，將培養(yǎng)皿分3組，每組使用3個60 mm培養(yǎng)皿，分別為對照組和孕酮組(10，100 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于接下來的試驗(yàn)分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡按照凋亡檢測試劑盒(Vazyme)說明書進(jìn)行檢測。試驗(yàn)分為對照組和孕酮組(10，100 μg/L)。將細(xì)胞接種在60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，處理后的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，4℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清；用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均在4℃、1 000 r/min離心5 min后棄上清；加入100 μL 1×Binding Buffer，吹勻至單細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution吹勻，避光室溫孵育10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer混勻；染色后樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 實(shí)時熒光定量RT-PCR參考HUANG 等[10]的方法，使用TRIzol試劑提取牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用實(shí)時定量RT-PCR檢測p53、Cyto-c、Bax、Bcl-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、TLR-4、NF-κB、IL-6、VEGF、LIF、EGF和β-actin的表達(dá)。引物序列見表1，由華大基因公司合成，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，用2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的表達(dá)水平。

表1 引物信息

1.7 Western blot檢測參考ADEGOKE等[11]的方法，將處理后的細(xì)胞用PBS洗滌，用胰蛋白酶消化收集，再次用PBS洗滌細(xì)胞2次，去除上清液后，加入150 μL RIPA裂解緩沖液進(jìn)行蛋白提取。用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。采用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后與一抗(p53、Bax、Cyto-c、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、VEGF、LIF和β-actin；1∶1 000，Bioss公司)在4℃過夜孵育。清洗膜3次，每次10 min，用二抗(HRP標(biāo)記，1∶3 000，Bioss公司)在室溫下孵育1 h。洗滌3次，用ECL-Western blot檢測系統(tǒng)檢測(Amersham Biosciences)。用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的免疫熒光染色顯微鏡下觀察可見，牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈典型的上皮樣細(xì)胞，用KRT-18(細(xì)胞角蛋白-18)進(jìn)行免疫熒光染色，細(xì)胞質(zhì)被染成綠色，細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色。證實(shí)該細(xì)胞為牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(圖1)。

A.KRT-18染色；B.DAPI染色；C.合成圖

2.2 孕酮對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞活力和凋亡的影響使用CCK8檢測了不同濃度的孕酮對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，孕酮對細(xì)胞活力的影響不顯著(圖2)(P>0.05)。分別使用10 μg/L(牛體內(nèi)的生理質(zhì)量濃度)和100 μg/L的(高質(zhì)量濃度)孕酮處理細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的孕酮處理對細(xì)胞凋亡未見顯著影響(圖3)(P>0.05)。

相同字母表示組間差異不顯著，不同字母表示組間差異顯著，P <0.05。下同

A.對照組；B.10 μg/L；C.100 μg/L；D.流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 孕酮對子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，孕酮對牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Bax、Bcl-2、p53、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表達(dá)沒有顯著改變(圖4)(P>0.05)。Western blot分析顯示，孕酮對牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Bax、p53和Caspase-9的蛋白表達(dá)沒有顯著改變(圖5)(P>0.05)。

A～H.分別為Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax、p53、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3

A.Western blot;B～D.Bax、p53、Caspase-9

2.4 孕酮對子宮容受性相關(guān)因子表達(dá)的影響熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，孕酮顯著增加了LIF和VEGF的mRNA表達(dá)，降低了TLR-4的表達(dá)(P<0.05)，對NF-κB、IL-6和EGF的表達(dá)沒有影響(圖6)(P>0.05)。Western blot分析顯示，孕酮顯著下調(diào)了TLR-4的蛋白表達(dá)水平，上調(diào)了LIF和VEGF的蛋白表達(dá)水平(圖7)(P<0.05)。

A～F.分別為TLR-4、LIF、VEGF、NF-κB、IL-6、EGF

A.Western blot;B～D.TLR-4、LIF、VEGF

3 討論

附植期間孕酮分泌不足會影響胚胎附植，尤其是高產(chǎn)奶牛肝臟代謝旺盛，高的代謝率使血漿中孕酮等類固醇激素在肝臟中被代謝，血液循環(huán)中孕酮濃度隨之降低，導(dǎo)致胚胎丟失率上升[12]。為此，很多學(xué)者在奶牛配種后補(bǔ)充外源性的孕酮，用來降低早期胚胎丟失率，提高奶牛的妊娠率[13-14]。FORDE等[15]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充孕酮可以改變胚胎發(fā)育階段子宮內(nèi)膜關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，對預(yù)防早期胚胎丟失具有重要意義。然而，孕酮調(diào)控子宮內(nèi)膜的具體機(jī)制還不清楚。

大量研宄證實(shí)，孕酮作用于表達(dá)孕酮受體的所有類型細(xì)胞，對細(xì)胞的增殖及其相應(yīng)激素受體的表達(dá)都有重要的調(diào)節(jié)作用[16]。CUI等[17]研究表明，孕酮對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖沒有影響。NGUYEN等[18]研究表明，孕酮顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的凋亡，而對正常的子宮內(nèi)膜細(xì)胞和卵巢基質(zhì)細(xì)胞沒有影響。FAKOWSKA等[19]研究表明，高濃度的孕酮顯著促進(jìn)子宮基質(zhì)細(xì)胞的增殖，對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的影響不顯著。WANG等[20]研究顯示，孕酮對奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖與凋亡沒有影響，但能緩解干擾素引起的凋亡，卻不能緩解放線菌酮(cycloheximide，CHX)引起的凋亡。奶牛胚胎附植期，奶牛體內(nèi)孕酮質(zhì)量濃度維持在5～15 μg/L[3-8]，本試驗(yàn)使用的孕酮質(zhì)量濃度為10～100 μg/L，結(jié)果顯示，孕酮對于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的活力、增殖和凋亡沒有明顯的作用。因此，單獨(dú)的孕酮處理，不能引起子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡[21-23]。

黃體形成后，持續(xù)分泌的孕酮可使子宮內(nèi)膜增厚，減少子宮在妊娠期間的收縮活動，抑制母體對胎兒的免疫排斥反應(yīng)，抑制發(fā)情活動，促進(jìn)子宮血管擴(kuò)張，以利于胚胎著床[24]。LIF是胚胎著床的重要細(xì)胞因子，LIF表達(dá)降低，會導(dǎo)致小鼠的胚胎無法著床[25]，奶牛胚胎移植時，添加LIF可使奶牛的妊娠率顯著提高[26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，孕酮提高了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的LIF表達(dá)，預(yù)示著LIF對奶牛胚胎的附植具有重要的調(diào)節(jié)作用。胚胎著床時，胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞相互作用，形成新的組織。新組織的形成常伴隨著新生血管的形成，為新生組織的增殖和分化提供了營養(yǎng)供給[27]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種促進(jìn)血管生成和調(diào)節(jié)血管通透性的細(xì)胞因子，其對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用[28]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，孕酮可促進(jìn)VEGF的表達(dá)，因此，孕酮在調(diào)控胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

子宮腔與外界相通，具有固有的防御體系。當(dāng)子宮發(fā)生感染時，子宮的防御體系發(fā)生一系列反應(yīng)來清除病原微生物。家畜妊娠后，黃體分泌的孕酮能降低淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活性，抑制子宮和外周血的中性粒細(xì)胞的吞噬活性[29]，對子宮的免疫應(yīng)答產(chǎn)生一定的影響。TLR4/NF-κB是調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程中的重要細(xì)胞信號通路，之前的研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，活化TLR-4/NF-κB/IL-6后，使用孕酮能顯著降低TLR-4/NF-κB/IL-6的表達(dá)[30-31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，孕酮能夠抑制TLR-4的表達(dá)，但對NF-κB和IL-6的表達(dá)沒有影響，這可能是由于細(xì)胞沒有受到外界刺激，沒有產(chǎn)生炎癥和免疫反應(yīng)，所以，單獨(dú)的孕酮處理，不能降低細(xì)胞的NF-κB和IL-6的表達(dá)。

綜上所述，孕酮不影響奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡，但能提高子宮容受性，降低免疫反應(yīng)。