葉 蕊，周玉紅，趙 雪，劉瑞廣，宋 丹，余紅嵐，王 宇△

1.貴陽市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，貴州貴陽 550025

流感嗜血桿菌(Hi)為革蘭陰性桿菌，無芽孢、無鞭毛，呈長(zhǎng)桿狀、球桿狀、絲狀等多形性，定植于人的鼻咽部，是引起社區(qū)獲得性感染的重要病原體，也是重要的條件致病菌。根據(jù)有無莢膜，可將Hi分為有莢膜(可分型)和無莢膜(不可分型)兩類?？煞中桶╝～f等6種血清型；不可分型無莢膜，不與任何一種分型血清凝集，即不可分型Hi(NTHi)菌株。隨著b型Hi(Hib)疫苗在全球范圍內(nèi)的推廣應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外相關(guān)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)均表明Hib感染下降明顯，但非莢膜型Hi，尤其是NTHi正在悄然取代Hib逐漸成為重要的兒童下呼吸道感染的優(yōu)勢(shì)病原菌，并呈快速上升趨勢(shì)[1-3]。研究顯示嬰幼兒、老年人是最高危人群，其中免疫力低下及有基礎(chǔ)合并癥的個(gè)體是最易感人群并與高病死率相關(guān)。因此，如何控制NTHi及其他血清型Hi的感染是重要的公共衛(wèi)生問題。此外，隨著各類抗菌藥物的廣泛使用，Hi對(duì)各類抗菌藥物耐藥率及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶率不斷增加，Hi感染分布特點(diǎn)及耐藥性因呈地域性的差異而備受關(guān)注。本研究對(duì)貴陽市第一人民醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)Hi感染病例進(jìn)行分析，以了解本院Hi的分型與分布、產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶及耐藥基因的關(guān)系，有助于正確分析Hi 的耐藥機(jī)制，合理選擇抗菌藥物治療，提高臨床治療效果。

1 材料與方法

1.1菌株來源 1 170株Hi菌株(剔除來自同一患者相同部位的分離菌株)分離自本院2018年1月至2021年12月兒童及成人住院患者的呼吸道標(biāo)本，其中922株分離自痰液標(biāo)本，229株分離自咽拭子標(biāo)本，7株分離自肺泡灌洗液標(biāo)本2株分離自血液。

1.2試驗(yàn)材料 血平板、巧克力平板、MH平板、HTM平板購(gòu)于廣州市迪景微生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；β-內(nèi)酰胺酶測(cè)試條購(gòu)于重慶龐通醫(yī)療器械有限公司。Ⅴ因子、Ⅹ因子、Ⅴ+Ⅹ因子紙片購(gòu)于溫州市康泰生物科技有限公司。采用Hi標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 49247)、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 29213)、糞腸球菌(ATCC 29212)監(jiān)測(cè)質(zhì)控。

1.3儀器與試劑 恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、瞬時(shí)離心機(jī)、生物安全柜、PCR 擴(kuò)增儀(杭州晶格公司)、電泳儀(北京君意公司)和凝膠成像系統(tǒng)(VILBER BIO IMAGING公司)、BD全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)、TaKaRa ExTaq 試劑盒 (日本 TaKaRa公司)、DL1000 標(biāo)志物。

1.4引物合成 依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]和GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物。包括Hi特異性外膜蛋白引物omp6、Fuck基因、莢膜bexA基因、β-內(nèi)酰胺酶TEM-1，ROB-1基因等，用于Hi的鑒定、莢膜分型及氨芐西林耐藥Hi基因分型。見表1。

表1 PCR引物序列

1.5方法

1.5.1標(biāo)本分離及培養(yǎng) 標(biāo)本接種嚴(yán)格遵循《臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)進(jìn)行操作。將合格送檢標(biāo)本分別接種于血平板及含有萬古霉素的巧克力平板上，孵育條件：5% ～10% CO2，35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取巧克力平板上呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的透明或半透明、濕潤(rùn)、光滑、易乳化的疑似菌落，革蘭染色，鏡檢為革蘭陰性短小桿菌。

1.5.2菌株鑒定 用接種環(huán)挑取經(jīng)18～24 h培養(yǎng)的新鮮菌落于5 mL無菌水內(nèi)，調(diào)制成0.5麥?zhǔn)隙染鷳乙海脽o菌棉拭子浸濕0.5麥?zhǔn)暇壕鶆蛲坎加贛H平板表面，粘貼Ⅴ因子、Ⅹ因子、Ⅴ+Ⅹ因子紙片后置于5%～10%CO2、35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。若Ⅴ因子、Ⅹ因子邊緣無細(xì)菌生長(zhǎng)，Ⅴ+Ⅹ因子紙片邊緣可見細(xì)菌明顯生長(zhǎng)則初步鑒定為Hi。

1.5.3藥敏試驗(yàn) 采用世界衛(wèi)生組織推薦的紙片擴(kuò)散法(K-B法),挑取單個(gè)菌落配置成0.5麥?zhǔn)隙鹊木鷳乙?，用無菌棉拭子浸濕0.5麥?zhǔn)暇壕鶆蛲坎加贖i藥敏試驗(yàn)平板(HTM藥敏平板)上，粘貼藥敏紙片后置于5%～10%CO2，35～37 ℃環(huán)境培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，遵循美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2021版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。并采用衛(wèi)生部臨檢中心的Hi(ATCC 49247)作為質(zhì)控菌株。

1.5.4β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定 采用頭孢硝噻吩紙片法進(jìn)行測(cè)定。紙片用無菌水潤(rùn)濕后,蘸取Hi菌落,10 min 內(nèi)紙片由黃色變紅色即為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，為陽性,不變色為陰性。用金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、糞腸球菌(ATCC 29212)作為質(zhì)控菌株。

1.5.5菌株DNA模板制備 采用DNA提取試劑盒(購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取DNA模板。保存于-20 ℃冰箱備用。

1.5.6PCR檢測(cè) 采用TaKaRa ExTaq試劑盒(日本TaKaRa公司)，反應(yīng)體系參照說明書。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min(以O(shè)mp6為例，其余基因引物退火溫度見表1)。用無菌去離子水作陰性對(duì)照。

1.5.7瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠加樣槽中，同時(shí)留1個(gè)空孔加入5 μL 1 000 bp相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，恒壓100 V 25 min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增條帶，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果判斷：P6基因和Fuck基因均陽性則為Hi；P6基因陽性，F(xiàn)uck基因陽性，bexA基因陰性則為NTHi；P6基因陽性，F(xiàn)uck基因陽性，bexA基因陽性則為莢膜型Hi。

1.5.8產(chǎn)物測(cè)序 將條帶明亮的PCR產(chǎn)物送至昆明擎科生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中網(wǎng)上查詢比較，進(jìn)行 Blast比對(duì)分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用WHONET5.6對(duì)所分離菌進(jìn)行藥敏分析，統(tǒng)計(jì)各抗菌藥物敏感率、耐藥率的情況，應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件及Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Hi的PCR鑒定與分型 本研究收集的Hi菌株經(jīng)PCR鑒定分型檢測(cè)后均為NTHi。P6、Fuck基因，PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖見圖1，均未檢出bexA基因。

2.2Hi分布及抗菌藥物耐藥性分析 收集的1 170株Hi菌株共來自19個(gè)科室，主要來自兒科及呼吸內(nèi)科，各占67.44%(789/1 170)、9.6%(101/1 170)，其余來自其他各個(gè)科室(耳鼻喉科、全科、腎內(nèi)科等)。2018-2021年2歲以下兒童Hi分離率為54.44%(637/1 170)，≥60歲以上老年人Hi分離率為17.18%(201/1 170)。將所有病例分為兒童組(≤14歲)及成人組(>14歲)，并進(jìn)行各年度及2018-2021年耐藥率的分析。2018年成人組與兒童組阿奇霉素、左氧氟沙星耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，2020年成人組與兒童組氨芐西林、頭孢呋辛、左氧氟沙星耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2～6。

表2 2018年Hi對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)

表3 2019年Hi對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)

表4 2020年Hi對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)

表5 2021年Hi對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)

表6 2018-2021年Hi對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)

2.3菌株β-內(nèi)酰胺酶及其耐藥基因檢測(cè) 2018-2021年547株氨芐西林耐藥菌株經(jīng)頭孢硝噻吩紙片法檢出426株β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株，經(jīng)PCR及瓊脂凝膠電泳檢測(cè)耐藥基因型均為TEM-1型，未檢出ROB-1基因型。見表7。PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖見圖2。

表7 2018-2021年Hi β-內(nèi)酰胺酶的檢出率對(duì)比

3 討 論

Hi常引起社區(qū)獲得性呼吸道感染、肺炎、支氣管炎、急性中耳炎、細(xì)菌性腦膜炎等疾病；嚴(yán)重者可引起化膿性腦膜炎和敗血癥等全身感染[5]；主要感染免疫力相對(duì)低下的人群，如圍產(chǎn)兒、嬰幼兒、老年人等[2]；感染以冬春季節(jié)高發(fā)[6-7]；Hib是引起兒童Hi疾病的主要原因[8]，但隨著Hib疫苗的推廣應(yīng)用，Hib的感染極大減少，而其他血清型及NTHi的感染呈逐年上升趨勢(shì)[9]。

本次研究的1 170株Hi，主要分布于兒科，以患肺炎為主。檢出Hi的標(biāo)本包括痰、咽拭子、分泌物、肺泡灌洗液、血液等，其中以痰標(biāo)本常見，占78.80%(922/1 170)。這與TORUMKUNEY等[10]檢出標(biāo)本類型研究一致，這可能與呼吸道感染常見咳痰癥狀，痰液獲得性高相關(guān)。2018-2021年2歲以下兒童Hi分離率為54.44%(637/1 170)，≥60歲以上老年人Hi分離率為17.18%(201/1 170)。2歲以下兒童占比超過50%，可能與該年齡段兒童的免疫系統(tǒng)不健全，缺乏對(duì)Hi的抵抗力有關(guān)；老年人感染的原因是機(jī)體免疫力、生理功能等隨著年齡的增長(zhǎng)不斷衰退，同時(shí)伴隨各系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病的原因等導(dǎo)致感染率增加[11]。

本研究收集的Hi菌株經(jīng)PCR鑒定分型檢測(cè)后均為NTHi，均未檢出bexA基因，這與ELDERE 等[2]、王姜琳等[12]研究結(jié)果一致。通過2018-2021年兒童與成人藥敏結(jié)果對(duì)比可見2018年兒童的阿奇霉素耐藥率和2018-2021年兒童的左氧氟沙星耐藥率和2018年、2020年成人的左氧氟沙星耐藥率與我國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)比較，均高于全國(guó)水平，其余抗菌藥物均低于其監(jiān)測(cè)結(jié)果[13-17]。針對(duì)2018年兒童組阿奇霉素較高耐藥率的情況，臨床依據(jù)耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果調(diào)整用藥習(xí)慣，2019-2021年兒童組阿奇霉素耐藥率有了明顯的降低。因?yàn)榕R床對(duì)于兒童及成人兩個(gè)年齡群在入院肺炎診治時(shí)用藥習(xí)慣不同，呈現(xiàn)出對(duì)于氨芐西林、頭孢呋辛、左氧氟沙星等抗菌藥物耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究2018-2021年氨芐西林及頭孢呋辛兒童組與成人組的耐藥率均為波動(dòng)性變化，這與2018-2021年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)變化一致[13-17]。2020年氨芐西林及頭孢呋辛兒童組與成人組的耐藥率均呈現(xiàn)小幅度降低，但2018年與2021年比較兩種抗菌藥物的耐藥率明顯上升。本研究2018-2021年兒童組左氧氟沙星耐藥率均高于每年度細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，耐藥率增高幅度以2019年較為明顯，考慮喹諾酮類抗菌藥物的作用機(jī)制，需謹(jǐn)慎使用該藥物。對(duì)于該藥物的抑菌環(huán)邊緣值結(jié)果需確保菌種純度，必要時(shí)進(jìn)行結(jié)果復(fù)核。本研究2018年與2021年耐藥率比較可見兒童組及成人組的阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑等抗菌藥物的耐藥率均呈上升趨勢(shì)，兒童組及成人組均對(duì)三代頭孢菌素、美羅培南等抗菌藥物敏感性較高。可能是因?yàn)榈貐^(qū)不同，耐藥率有所差異，但耐藥趨勢(shì)一致。

氨芐西林作為Hi感染的首選用藥，隨著廣泛的使用，耐藥率也逐漸上升，根據(jù)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示2018—2021年其耐藥率從57.2%上升至72.9%，上升幅度明顯。氨芐西林的耐藥通過兩種作用機(jī)制，其中β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是主要的機(jī)制，它通常由TEM-1基因和罕見的ROB-1基因編碼[18]。第2種機(jī)制是細(xì)菌細(xì)胞壁上青霉素結(jié)合蛋白 3(PBP3) 的 ftsI 基因氨基酸位點(diǎn)置換使空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)菌與 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物親和力下降，并影響氨基青霉素、β-內(nèi)酰胺酶抑制類抗菌藥物和第一、二代頭孢的抗菌藥物活性[19]。本研究547株氨芐西林耐藥菌株經(jīng)頭孢硝噻吩紙片法，檢出426株β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株，陽性率77.88%(426/547)；耐藥基因型均為TEM-1型，未檢出ROB-1基因型，這與王姜琳等[12]、秦惠宏等[20]報(bào)道一致。β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株(BLNAR)的檢出，是否是導(dǎo)致本院β-內(nèi)酰胺酶陽性，以及第一、二代頭孢菌素和氨芐西林耐藥率高的原因還有待進(jìn)一步研究，應(yīng)引起重視。本次β-內(nèi)酰胺酶檢出率較全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)高，可能是由于各地區(qū)用藥習(xí)慣不同而導(dǎo)致，氨芐西林已不適用于Hi感染首選治療。

研究發(fā)現(xiàn)，定植于下呼吸道的NTHi可釋放高度炎癥抗原，如脂寡糖等，長(zhǎng)期不被消除會(huì)引起宿主的慢性復(fù)發(fā)性感染，反復(fù)抗菌藥物治療又增加耐藥菌株[21]。目前，一些國(guó)家都因Hib結(jié)合疫苗的接種降低了Hib感染率[22-23]，而我國(guó)一些地區(qū)Hib結(jié)合疫苗的聯(lián)合接種率僅為54.9%[24]，面對(duì)NTHi及其他血清型Hi感染的增加，有必要將Hib疫苗納入國(guó)家免疫Ⅰ類計(jì)劃，并及時(shí)實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化的監(jiān)測(cè)方案和分型方法來監(jiān)測(cè)NTHi極為重要。本研究進(jìn)一步提示本院針對(duì)Hi感染應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)檢測(cè)并進(jìn)行分型研究，積極普及疫苗接種，以及結(jié)合藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果合理選用抗菌藥物，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。