劉潘婷，向 瑜，周紅菊，陳 瀑

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400016

乙型肝炎病毒(HBV)血清學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)是乙型肝炎臨床診斷和治療的重要依據(jù)，其血清學(xué)模式仍是評(píng)價(jià)疾病狀態(tài)的重要指標(biāo)。隨著實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法靈敏度的提高及抗病毒藥物的廣泛使用，HBV e抗原(HBeAg)和HBV e抗體(HBeAb)共存的特殊模式不斷被檢測(cè)出來(lái)[1-2]，這種HBV特殊血清學(xué)模式給臨床診療帶來(lái)一定的困惑，對(duì)其研究有助于了解HBV感染狀態(tài)，提高對(duì)慢性乙型肝炎(CHB)的診療水平。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染者血清或血漿中存在HBV前基因組RNA(HBV RNA)，HBV RNA是由感染肝細(xì)胞核內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)轉(zhuǎn)錄形成的部分前基因組RNA(pgRNA)不經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄而直接獲取病毒包膜蛋白分泌出肝細(xì)胞外產(chǎn)生，因此，血清HBV RNA水平能夠反映cccDNA表達(dá)水平及其轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)，HBV RNA作為一種具有潛在臨床檢測(cè)價(jià)值的新指標(biāo)成為研究熱點(diǎn)。有研究顯示血清HBV RNA與HBV感染狀態(tài)、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、治療和預(yù)后等方面關(guān)系密切[3]。HBV RNA作為一種新的病毒學(xué)指標(biāo)，目前少見(jiàn)其在HBV感染血清學(xué)特殊模式中的水平及其與傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物相關(guān)性的研究。本文通過(guò)研究HBeAg和HBeAb共同陽(yáng)性模式中血清HBV RNA表達(dá)水平及其在不同基因型中表達(dá)情況，同時(shí)分析HBV RNA與HBV DNA、HBV表面抗原(HBsAg)、HBeAg、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的相關(guān)性，探討其檢測(cè)意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月至2020年12月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診及住院進(jìn)行治療的且HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)中HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBV核心抗體(HBcAb)均為陽(yáng)性的CHB患者108例(A組)作為研究對(duì)象，其中男74例、女34例，年齡17～75歲、平均(40.90±13.69)歲。另選取同期在在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診及住院進(jìn)行治療的HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)中HBeAg陽(yáng)性、HBeAb陰性的CHB患者45例(B組)和HBeAg陰性、HBeAb陽(yáng)性的CHB患者33例(C組)作為對(duì)照。A組和B、C組患者均符合文獻(xiàn)[4]的CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他肝炎病毒及艾滋病毒感染；(2)其他肝臟疾病(如自身免疫性肝炎、酒精性肝炎等)；(3)近期使用免疫抑制劑治療。研究方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 ARCHITECT系統(tǒng)i4000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及血清HBsAg、HBV表面抗體(HBsAb)、HBeAg、HBeAb和HBcAb配套檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)雅培公司；Cobas c701全自動(dòng)生化分析儀及血清ALT、AST配套檢測(cè)試劑購(gòu)自Roche公司；Cobas Z480熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司，HBV基因分型檢測(cè)試劑盒購(gòu)自寶瑞源生物技術(shù)有限公司；HBV核酸定量測(cè)定試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司；HBV pgRNA(HBV RNA)測(cè)定試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?購(gòu)自北京熱景生物技術(shù)股份有限公司。

1.3方法

1.3.1HBV血清學(xué)標(biāo)志物和肝功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 采集A組及B、C組患者外周血4 mL于促凝管，4 000 r/min離心6 min，收集血清，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，避免反復(fù)凍融。然后按試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用ARCHITECT系統(tǒng)i4000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑檢測(cè)A組及B、C組患者血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb；采用Cobas c701全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測(cè)A組及B、C組患者血清ALT、AST水平。HBsAg的值為相應(yīng)檢測(cè)值以10為底所取對(duì)數(shù)。

1.3.2HBV基因分型檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法，在Cobas Z480熒光定量PCR儀檢測(cè)A組及B、C組患者血清中感染HBV B、C、D 3種基因型。

1.3.3HBV DNA、HBV RNA載量檢測(cè) 使用分離膠管上層血清，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，按照HBV核酸定量測(cè)定試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?說(shuō)明書(shū)在Cobas Z480熒光定量PCR儀上檢測(cè)HBV DNA載量，單位為IU/mL；運(yùn)用HBV pgRNA(HBV RNA)測(cè)定試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?在cobas Z480熒光定量PCR儀上檢測(cè)HBV RNA載量，單位為copy/mL。HBV DNA、HBV RNA的值均為相應(yīng)檢測(cè)值以10為底所取對(duì)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Shapiro-wilk檢驗(yàn)及正態(tài)分布圖判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)性分布，非正態(tài)分布的連續(xù)變量以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。多組間樣本比較采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，組間兩兩比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)經(jīng)Bonferroni校正法調(diào)整為α=0.017。

2 結(jié) 果

2.1A組血清學(xué)指標(biāo)和HBV基因分型比較 A組中血清HBV RNA為2.98(1.78，4.20)copy/mL，HBV DNA為5.38(4.20，6.46)IU/mL，HBsAg為3.42(3.04，3.79)IU/mL，HBeAg為3.46(1.69，8.36)S/CO，ALT為53.50(31.25，233.00)U/L，AST為55.00(29.00，201.25)U/L；HBV基因分型中，B基因型占69.44%(75/108)，C基因型占18.52%(20/108)，D基因型占3.70%(4/108)，未分型占8.33%(9/108)。

2.2A組B、C基因型血清HBV RNA及HBV DNA水平比較 A組B基因型75例、C基因型20例、D基因型4例，B、C基因型血清HBV RNA及HBV DNA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3A組血清HBV RNA與其他血清學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析 A組血清HBV RNA與HBV DNA、HBsAg、ALT、AST呈正相關(guān)(r=0.723，P<0.001；r=0.270，P=0.005；r=0.479，P<0.001；r=0.395，P<0.001)，與HBeAg無(wú)相關(guān)(r=0.111，P=0.253)。

表1 A組B、C基因型血清HBV RNA與HBV DNA水平比較[M(P25,P75)]

2.43組患者血清HBV RNA與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析 3組中HBV RNA與HBV DNA呈正相關(guān)(P<0.05)，在A、B組中HBV RNA與HBsAg呈正相關(guān)(P<0.05)，在B組中HBV RNA與HBeAg呈正相關(guān)(P<0.05)，在A和C組中HBV RNA與ALT、AST 呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.53組間血清學(xué)指標(biāo)比較及組間兩兩比較 3組血清HBV RNA、HBV DNA、HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組血清HBV RNA、HBV DNA、HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平均明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.017)；A組血清HBsAg、AST水平均高于B組，A組血清HBeAg水平低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.017)；B組HBV RNA、HBV DNA、HBeAg水平均高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.017)。見(jiàn)表3。

表2 3組患者血清HBV RNA與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析

表3 3組間血清學(xué)指標(biāo)比較[M(P25,P75)]

3 討 論

HBV血清學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)仍是乙型肝炎臨床診斷和治療的重要依據(jù)，HBV抗原和抗體同時(shí)陽(yáng)性的血清學(xué)特殊模式在臨床及流行病學(xué)研究中不斷被發(fā)現(xiàn)，HBeAg和HBeAb同時(shí)陽(yáng)性是常見(jiàn)的特殊血清學(xué)模式之一，目前有研究報(bào)道HBeAg和HBeAb共存現(xiàn)象可能與血清學(xué)轉(zhuǎn)換期、前核心區(qū)(PC)和(或)雙基底核心啟動(dòng)子(BCP)突變導(dǎo)致HBeAg在轉(zhuǎn)錄或翻譯階段表達(dá)減少、病毒再活動(dòng)期等因素有關(guān)[1-2]，針對(duì)特殊血清學(xué)模式的研究有助于提高臨床相應(yīng)診療水平。

cccDNA是HBV復(fù)制的初始模板，HBV的持續(xù)復(fù)制依賴(lài)于可轉(zhuǎn)錄生成RNA的cccDNA，cccDNA是反映HBV感染和復(fù)制的直接證據(jù)，其在肝細(xì)胞核中長(zhǎng)期存在是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化和停藥后復(fù)發(fā)的重要原因[5]，清除cccDNA才表明乙型肝炎達(dá)到治愈，但cccDNA的檢測(cè)由于需要肝組織穿刺活檢，臨床難以普遍開(kāi)展。既往研究表明，血清HBV DNA和HBsAg與肝組織內(nèi)cccDNA的活性呈正相關(guān)，因此被常規(guī)用于劃分HBV感染的進(jìn)程、確定治療時(shí)間、觀察藥物療效和停藥時(shí)機(jī)等臨床診療中，但隨著對(duì)HBV的深入研究，特別是核苷及核苷酸類(lèi)似物(NAs)等抗病毒藥物廣泛運(yùn)用于臨床以來(lái)，這些傳統(tǒng)血清學(xué)指標(biāo)已被證實(shí)有其局限性：血清HBV DNA的消失僅能代表病毒的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程被有效抑制，并不能真實(shí)反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)[6]；HBsAg由于來(lái)源的多樣性，既可來(lái)源于cccDNA，也可來(lái)源于整合的HBV DNA片段[7-8]，在反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA水平上也存在局限性。有研究證實(shí)HBV RNA是由感染肝細(xì)胞核內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄形成的部分pgRNA不經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄而直接獲取病毒包膜蛋白分泌出肝細(xì)胞外產(chǎn)生，能夠反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)，被認(rèn)為是一種新型的潛在血清學(xué)標(biāo)志物，可作為cccDNA的替代標(biāo)志物來(lái)評(píng)估HBV復(fù)制及感染狀態(tài)[9-10]。

有研究表明，HBV感染的不同時(shí)期血清HBV RNA水平和HBV DNA、HBsAg水平相關(guān)性不同，在HBeAg陽(yáng)性的CHB患者中表現(xiàn)出相關(guān)性，而在HBeAg陰性患者中相關(guān)性弱或不相關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果顯示，A組血清HBV RNA與HBV DNA、HBsAg、ALT、AST呈正相關(guān)(r=0.723，P<0.001；r=0.270，P=0.005；r=0.479，P<0.001；r=0.395，P<0.001)；在A、B組中HBV RNA與HBsAg呈正相關(guān)，在A和C組中HBV RNA與ALT、AST呈正相關(guān)，由此可見(jiàn)A組血清HBV RNA與其他病毒血清標(biāo)志物和肝功能指標(biāo)的相關(guān)性總體上要優(yōu)于B、C組，且與HUANG等[11]研究結(jié)果一致。在B組中HBV RNA與HBeAg呈正相關(guān)(P<0.05)，在A和C組中HBV RNA與ALT、AST 呈正相關(guān)(P<0.05)，這種相關(guān)性的差異可能與病毒感染狀態(tài)、病毒變異、疾病進(jìn)展和治療等因素有關(guān)，需進(jìn)一步分析研究。

本研究結(jié)果顯示，A組血清HBV RNA水平均高于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.017)；A組血清HBsAg、AST水平均高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.017)，提示A組患者病毒復(fù)制活躍，肝功能損傷程度較為嚴(yán)重。本研究還發(fā)現(xiàn)，A組血清HBeAg水平低于B組，且HBeAg大多處于低水平。HBeAg低水平通常被認(rèn)為可能是患者正處于免疫清除期，HBeAb中和部分HBeAg，HBeAg正趨于陰轉(zhuǎn)的血清學(xué)轉(zhuǎn)換期。理論上，這個(gè)時(shí)期RNA和DNA水平也應(yīng)隨之下降，多項(xiàng)研究也表明HBV RNA水平下降能較強(qiáng)地預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換[13]。由本研究結(jié)果推斷出，A組患者可能與PC和(或)BCP突變或者HBV處于再活動(dòng)期等因素關(guān)系更大，VAN CAMPENHOUT 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HBV RNA水平與PC和(或)BCP突變有關(guān)，這之間的關(guān)系還需要更多的研究來(lái)證實(shí)。本研究結(jié)果也顯示，A組血清HBV RNA水平與HBV DNA有良好的相關(guān)性，HBV RNA可協(xié)同HBV DNA檢測(cè)，幫助臨床醫(yī)生及時(shí)了解此類(lèi)特殊血清學(xué)模式CHB患者病情變化，調(diào)整診療策略，提升治療效果。

本研究結(jié)果顯示，A組檢測(cè)到了B、C、D基因型，其中以B基因型多見(jiàn)(75/69.44%)，其次為C基因型(20/18.52%)，D基因型占比最少(4/3.70%)，這與文獻(xiàn)[4]的報(bào)道結(jié)果一致，表明A組HBV感染者基因型無(wú)特殊表現(xiàn)，進(jìn)一步比較A組B、C基因型間血清HBV RNA和HBV DNA水平，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有研究顯示，D基因型HBV RNA水平要高于B、C基因型[12]，本研究因D基因型例數(shù)太少(4例)未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。一般而言，CHB患者血清HBV RNA水平均低于HBV DNA水平[14-15]。本研究結(jié)果也顯示，A組血清HBV RNA水平總體隨著HBV DNA水平降低而降低。

綜上所述，HBeAg和HBeAb共同陽(yáng)性CHB患者血清HBV RNA與HBV DNA具有良好的相關(guān)性，血清HBV RNA檢測(cè)具有潛在的臨床意義，但其檢測(cè)優(yōu)勢(shì)需進(jìn)一步研究分析。本研究的不足之處在于沒(méi)有針對(duì)A組及B、C組行HBV RNA動(dòng)態(tài)觀察。血清HBV RNA是一項(xiàng)新的檢測(cè)項(xiàng)目，隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，靈敏度更高、特異度更好的HBV RNA檢測(cè)方法開(kāi)始運(yùn)用于臨床，后期將對(duì)其進(jìn)一步深入研究。