于彤波,付 倫,趙漢東,王 嘉,劉紅莉

西安市第八醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.肝病六科,陜西西安 710000;3.西安市人民醫(yī)院/西安市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科,陜西西安 710004

慢性乙型肝炎(CHB)是臨床常見(jiàn)的傳染性疾病，隨病情加重，可進(jìn)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌等[1]。目前主要治療藥物有干擾素類及核苷類似物兩種，核苷類似物以其用藥方便、治療療效明顯被臨床廣泛用于CHB患者的抗病毒治療[2]。CHB是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起，故針對(duì)病因進(jìn)行治療在理論上可實(shí)現(xiàn)有限療程。已有多項(xiàng)研究均指出無(wú)肝硬化的CHB患者停藥標(biāo)準(zhǔn)，然而在臨床中發(fā)現(xiàn)在停藥后，部分患者可出現(xiàn)HBV DNA的突破[3]。共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的完全衰退可作為HBV清除的標(biāo)志，接近CHB的治愈狀態(tài)，然而核苷類似物不能直接作用于共價(jià)閉合環(huán)狀DNA[4]。目前臨床尚缺乏有效的標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)核苷類似物治療CHB的效果[5]。血清HBV前基因組RNA(HBV pgRNA)是以HBV共價(jià)閉合環(huán)DNA為模板合成的基因。相關(guān)研究報(bào)道恩替卡韋在治療CHB患者時(shí)，其血清HBV pgRNA水平可作為反映HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)錄活性的指標(biāo)，推測(cè)HBV pgRNA可用于評(píng)估抗病毒治療效果[6-7]。因此本研究探討血清HBV pgRNA在核苷類似物治療CHB患者中的臨床價(jià)值，以期為臨床治療CHB提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年1月西安市第八醫(yī)院收治的167例CHB患者為研究對(duì)象。入組患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。研究對(duì)象中男性106例，女性61例；年齡23～60歲，平均(41.61±4.59)歲；體重指數(shù)18.83～27.05 kg/m2，平均(22.96±3.25)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為CHB且為初治患者；(2)入組前未接受抗乙肝病毒或核苷類似物等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他類型肝炎；(2)合并自身免疫系統(tǒng)疾??；(3)合并惡性腫瘤；(4)患有嚴(yán)重心、腦、肺等器官功能障礙；(5)神志異常不能配合治療；(5)妊娠期或哺乳期婦女。本研究經(jīng)西安市第八醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且研究對(duì)象同意參加本項(xiàng)研究，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集及血生化、T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 收集研究對(duì)象年齡、性別、體重指數(shù)及CHB治療藥物(替比夫定、替諾福韋、恩替卡韋)等資料。采集研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL，離心分離上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽紅素(TBIL)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+)，計(jì)算CD4+/CD8+。

1.2.2HBV pgRNA檢測(cè) 采集患者清晨空腹外周靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min，分離上清液置于-80 ℃冰箱保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)血清HBV pgRNA。取250 μL血清，用磁珠法提取HBV RNA，測(cè)定RNA濃度。采用熒光定量PCR儀(ABI Prism 7000型)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。RNAs反轉(zhuǎn)錄為cDNA，HBV RNA序列及內(nèi)參序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系20 μL，2×SYBP Mix 10 μL，10×cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃10 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 2 min，38個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算血清HNV pgRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物及內(nèi)參序列

1.2.3治療方法及效果評(píng)價(jià) 所有CHB患者均持續(xù)接受核苷類似物治療12個(gè)月。完全應(yīng)答：血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰、ALT正常；不完全應(yīng)答：血清HBV RNA轉(zhuǎn)陰或ALT正常。將完全應(yīng)答及不完全應(yīng)答定義為應(yīng)答，反則為不應(yīng)答。

2 結(jié) 果

2.1抗病毒治療效果 167例CHB患者持續(xù)接受12個(gè)月的核苷類似物治療后，42例(25.15%)CHB患者不應(yīng)答，125例(74.85%)CHB患者獲得應(yīng)答。

2.2CHB應(yīng)答與不應(yīng)答患者臨床資料 CHB獲得應(yīng)答患者性別、年齡、體重指數(shù)、治療藥物、TBIL、CD4+、CD8+、AST、ALT與CHB獲得不應(yīng)答患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CHB獲得不應(yīng)答患者乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)陽(yáng)性占比、HBV DNA載量、HBV pgRNA水平高于CHB獲得應(yīng)答患者，而CD4+/CD8+水平低于CHB獲得應(yīng)答患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CHB獲得應(yīng)答與不應(yīng)答患者臨床資料比較

2.3影響核苷類似物治療效果的多因素分析 將HBeAg狀態(tài)(陰性=0，陽(yáng)性=1)、HBV DNA載量、HBV pgRNA、CD4+/CD8+作為自變量，將治療效果(應(yīng)答=0，不應(yīng)答=1)作為因變量納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示HBeAg狀態(tài)(OR=3.849)、HBV DNA載量(OR=2.789)、HBV pgRNA(OR=4.016)為核苷類似物治療CHB效果的影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 多因素Logistic回歸分析核苷類似物治療CHB效果的影響因素

2.4血清HBV pgRNA預(yù)測(cè)核苷類似物治療效果的價(jià)值 ROC曲線分析顯示血清HBV pgRNA預(yù)測(cè)核苷類似物治療CHB效果的AUC、靈敏度、特異度、約登指數(shù)及最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為0.855(95%CI：0.792～0.905)、64.29%、95.20%、0.595、5.54 lg copy/mL。見(jiàn)圖1。

3 討 論

HBV感染為導(dǎo)致CHB的根源，如果控制不當(dāng)可進(jìn)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌，因此積極地抗HBV治療可延緩疾病的進(jìn)展，改善CHB患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸[9]。核苷類似物的應(yīng)用極大地提高了CHB的治療效果，然而核苷類似物無(wú)法完全消除HBV，并且隨意停藥可造成疾病的反復(fù)，因此采取有效的手段評(píng)估核苷類似物治療停止意義重大[10]。pgRNA是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的直接產(chǎn)物，可反映肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的活性[11]。HUANG等[12]研究指出，血清HBV pgRNA是CHB患者治療12周時(shí)最初病毒學(xué)應(yīng)答的預(yù)測(cè)指標(biāo)，且為除HBV DNA外唯一可獨(dú)立預(yù)測(cè)病毒學(xué)治療應(yīng)答的指標(biāo)。另有報(bào)道指出，恩替卡韋治療CHB期間HBV RNA的表達(dá)降低，研究者認(rèn)為血清HBV pgRNA可預(yù)測(cè)CHB病毒學(xué)應(yīng)答[13]。因此，探討血清HBV pgRNA水平對(duì)預(yù)測(cè)核苷類似物治療CHB的效果具有現(xiàn)實(shí)意義。

本研究167例CHB患者持續(xù)接受12個(gè)月的核苷類似物治療后，42例(25.15%)CHB患者不應(yīng)答，與既往研究報(bào)道結(jié)果相符[14-15]，表明替比夫定、替諾福韋、恩替卡韋治療CHB效果相近。CHB獲得不應(yīng)答患者HBeAg陽(yáng)性占比、HBV DNA載量、HBV pgRNA水平高于CHB獲得應(yīng)答患者，而CD4+/CD8+水平低于CHB獲得應(yīng)答患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示上述指標(biāo)可能與核苷類似物治療CHB效果有關(guān)。利用多因素Logistic回歸分析顯示，HBeAg狀態(tài)、HBV DNA載量、HBV pgRNA均與核苷類似物治療CHB效果有關(guān)，與既往研究報(bào)道結(jié)果相符[16-17]。有報(bào)道指出，血清HBV DNA與HBsAg表達(dá)水平與肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA活性線性相關(guān)，HBV DNA被用作判定CHB患者病毒學(xué)應(yīng)答、療效評(píng)價(jià)及停藥的指標(biāo)[18]。然而在核苷類似物治療CHB過(guò)程中，CHB患者血清HBV DNA的消失不能用于判定肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA清除或處于轉(zhuǎn)錄沉默，將持續(xù)消失的HBV DNA作為核苷類似物停藥標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)CHB復(fù)發(fā)[19-20]。血清HBV pgRNA是HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的HBV轉(zhuǎn)錄中間產(chǎn)物，多以病毒顆粒的形式存在于血清中[21]。有研究證實(shí)，恩替卡韋治療CHB患者過(guò)程中，HBV pgRNA可反映肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的殘留及轉(zhuǎn)錄[22-23]。筆者利用ROC曲線分析血清HBV pgRNA預(yù)測(cè)核苷類似物治療CHB效果的價(jià)值，結(jié)果顯示AUC為0.855，最佳截?cái)帱c(diǎn)為5.54 lg copy/mL，提示血清HBV pgRNA預(yù)測(cè)核苷類似物治療CHB獲得應(yīng)答的效能較高，當(dāng)HBV pgRNA降低至5.54 lg copy/mL時(shí)，可考慮停藥。

綜上所述，血清HBV pgRNA表達(dá)水平與核苷類似物治療CHB獲得應(yīng)答有關(guān)，檢測(cè)血清HBV pgRNA水平有助于預(yù)測(cè)核苷類似物治療CHB的效果。