王曉磊，譚劭雯，李子雁，溫際富，劉學(xué)美，姜彤彤，隋智海*

（1.臨沂大學(xué)教育學(xué)院，山東 臨沂 276000；2.菲律賓克里斯汀大學(xué)國(guó)際學(xué)院，菲律 賓馬尼拉 1004；3.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；4.齊魯制藥集團(tuán)有限公司，山東 濟(jì)南 250000；5.臨沂市河?xùn)|區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 臨沂 276034）

烏鱧（Channa argus），又稱“黑魚(yú)”“生魚(yú)”，屬鱧亞目，鱧科，鱧屬，是一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，主要分布在亞洲和非洲，我國(guó)年產(chǎn)量可達(dá)50萬(wàn)t[1-2]。但隨著養(yǎng)殖密度的不斷提高，養(yǎng)殖環(huán)境被破壞，導(dǎo)致烏鱧病害頻發(fā)，制約養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3-4]。常見(jiàn)的烏鱧細(xì)菌性疾病主要是由諾卡氏菌屬（Nocardia）引發(fā)的諾卡氏菌病[5]，由氣單胞菌屬（Aeromonas）引起的壞死性筋膜炎敗血癥[6]，由愛(ài)德華氏菌屬（Edwardsiella）引起的愛(ài)德華氏菌病[7]等。目前，病害防治主要以化學(xué)藥物為主，而藥物的大量使用，會(huì)加速病原菌產(chǎn)生耐藥性，成為超級(jí)細(xì)菌，危害養(yǎng)殖業(yè)和生態(tài)環(huán)境的發(fā)展[8-9]。

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）是一種革蘭陰性菌，屬氣單胞菌科，氣單胞菌屬，兼性厭氧菌，廣泛分布在自然界中[10-11]。維氏氣單胞菌具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)力，可感染宿主范圍較廣，包括淡水魚(yú)、兩棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類、哺乳動(dòng)物等[12-13]，目前，已從患病的鯽、羅非魚(yú)、虹鱒、鯉等中分離并鑒定，成為威脅魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)的病原菌之一[14-16]。在維氏氣單胞菌感染發(fā)病過(guò)程中，其毒力因子如：氣溶素、絲氨酸蛋白酶、細(xì)胞毒性腸毒素、細(xì)胞毒性腸毒素和黏附因子，發(fā)揮著重要作用[17-18]。因此，隨著分離株日趨多樣化，確定臨床維氏氣單胞菌分離株毒力相關(guān)因素，對(duì)了解其發(fā)病機(jī)理和流行病學(xué)至關(guān)重要[19]。

現(xiàn)從患病烏鱧肝臟、脾臟和腎臟等組織混合樣品中，分離并純化出一株優(yōu)勢(shì)菌株，采用革蘭染色、16S rRNA和gyrB基因鑒定、生理生化試驗(yàn)等多種方法，確認(rèn)此優(yōu)勢(shì)菌株是維氏氣單胞菌。通過(guò)最適溫度和最適pH值測(cè)定、藥敏試驗(yàn)和毒力基因擴(kuò)增分析，進(jìn)一步了解評(píng)估其環(huán)境適應(yīng)力、耐藥特性及其致病機(jī)制，擬為維氏氣單胞菌感染的預(yù)防和治療提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年4月，從山東省臨沂市某烏鱧養(yǎng)殖場(chǎng)取瀕臨死亡的烏鱧，裝入無(wú)菌袋，放置冰盒中，2 h內(nèi)運(yùn)至臨沂大學(xué)生命科學(xué)院食品質(zhì)量與加工實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)菌分離、純化及其形態(tài)觀察

在無(wú)菌條件下，用75%乙醇棉球?qū)貅k體表消毒，解剖后剪取部分肝臟、脾臟和腎臟，置于500 μL無(wú)菌PBS溶液中，用低速研磨器（北京天根生化科技有限公司）研磨成組織懸液，采用PBS溶液10倍稀釋，涂布在LB固體培養(yǎng)基上，置于30℃中培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。選取優(yōu)勢(shì)菌落再次劃線接種于LB固體平板上純化，30℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征。

1.3 革蘭染色

按照革蘭染色液試劑盒（青島海博生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)，從LB固體培養(yǎng)基上挑取單菌落于蒸餾水中混勻，均勻涂布在載玻片上，經(jīng)結(jié)晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脫色和番紅復(fù)染，干燥后置于光學(xué)顯微鏡下，用油鏡觀察其形態(tài)特征。

1.4 16S rRNA、gyrB基因序列擴(kuò)增與系統(tǒng)發(fā)育分析

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）說(shuō)明書(shū)，LB液體培養(yǎng)細(xì)菌16 h，經(jīng)離心后，提取其基因組DNA。隨后，以其為模板，利用16S rRNA的通用引物27F/1492F和gyrB的引物對(duì)gyrB-F/gyrB-R分別擴(kuò)增16S rRNA和gyrB基因，引物序列見(jiàn)表1[20-21]。PCR反應(yīng)體系為：2×Taq Master Mix 25μL，上下游引物各2.5 μL，ddH2O 19 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60～90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1 引物序列

經(jīng)NCBI在線BLAST完成序列同源性分析，選取部分16S rRNA和gyrB基因序列，利用MEGA-X軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining Method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析序列同源性。

續(xù)表

1.5 生理生化特性鑒定

按照微量生化反應(yīng)管（青島海博生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)，從LB固體平板上刮取菌落，于PBS中混勻，測(cè)定菌液在600 nm處的吸光值（OD600），并調(diào)至約0.2（0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?，?0 μL細(xì)菌懸液接種至各類微量生化反應(yīng)管，于30或42℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄反應(yīng)管顏色變化，參照說(shuō)明書(shū)鑒定細(xì)菌生理生化特性。

1.6 最適溫度和最適pH值測(cè)定

將細(xì)菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，5 000 r/min離心，PBS重懸，按照1%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的液體LB中，分別置于25，30，37和40℃搖床中培養(yǎng)48 h，每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每隔2 h測(cè)定OD600值，取平均值作為最終結(jié)果。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，確定最適溫度。隨后按照1%的接種量，分別轉(zhuǎn)接至pH值為5，6，7和8的新鮮液體LB中，置于37℃搖床中培養(yǎng)48 h，每個(gè)pH值設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每隔2 h測(cè)定吸光值OD600，取平均值作為最終結(jié)果。繪制生長(zhǎng)曲線，確定最適pH值。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法，測(cè)定細(xì)菌藥物敏感性。用37℃震蕩液體過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌，用無(wú)菌PBS稀釋至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度，涂布100 μL菌液于LB平板，貼上藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品），置于37°C恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑（mm），重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，判定分離菌株的耐藥程度。

1.8 毒力基因檢測(cè)

以細(xì)菌基因組DNA為模板，參照文獻(xiàn)[23]合成引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，分別擴(kuò)增檢測(cè)細(xì)胞毒性腸毒素基因（act）、菌溶素基因（aer）、脂肪酶基因（lip）、絲氨酸蛋白酶基因（ser）、熱不穩(wěn)定腸毒素基因（alt）、熱穩(wěn)定腸毒素基因（ast）和鞭毛蛋白基因（fla）和彈性蛋白酶基因（ahyB）等8種維氏氣單胞菌毒力基因。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s、退火溫度（表1）30 s、72℃延伸20～30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并觀察結(jié)果。隨后，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，經(jīng)NCBI的Blastn比對(duì)，鑒定其序列是否正確，以確定菌株的毒力基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌菌落形態(tài)及革蘭染色

從烏鱧病變內(nèi)臟組織中分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌株（暫命名為WL-3）。將WL-3接種在LB固體培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，可形成圓形、中間隆起、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)且半透明的淡黃色菌落[圖1（a）]。經(jīng)革蘭染色，WL-3在油鏡下呈現(xiàn)紅色、短桿狀、兩端鈍圓的特征，是一種革蘭陰性菌[圖1（b）]。

圖1 菌株WL-3

2.2 16S rRNA和gyrB序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

以WL-3基因組DNA為模板，利用引物對(duì)27F/1492F和gyrB-3F/gyrB-14R分別擴(kuò)增16S rRNA和gyrB基因，結(jié)果見(jiàn)圖2（a）（b）。由圖2可見(jiàn)，16S rRNA擴(kuò)增條帶大小約為1 500 bp，gyrB擴(kuò)增條帶大小約為1 100 bp，均與預(yù)期目的片段大小一致。

圖2 基因PCR擴(kuò)增

16S rRNA和gyrB基因序列經(jīng)NCBI的Blastn比對(duì)分析見(jiàn)圖3（a）（b）。由圖3可見(jiàn)，均顯示菌株WL-3與維氏氣單胞菌的相似度最高，分別為99.70%（16S rRNA）和99.81%（gyrB）。從中選取部分同源性較高的同屬菌株序列，利用Mega-X構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，顯示菌株WL-3與維氏氣單胞菌自然聚在一支中。

圖3 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.3 生理生化特性

生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，菌株WL-3可利用葡萄糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇和乳糖等5種碳源；精氨酸雙水解酶、V-P試驗(yàn)等2項(xiàng)指標(biāo)均呈陽(yáng)性反應(yīng)；在無(wú)鹽和3%NaCl胰胨水中生長(zhǎng)；但纖維二糖、阿拉伯糖、鼠李糖、尿素酶、明膠酶、氧化酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、6%～10%NaCl胰胨水、42℃生長(zhǎng)等13項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表2 菌株WL-3的生理生化特性①

續(xù)表

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用藥敏紙片法測(cè)定菌株WL-3對(duì)30種抗生素的敏感性，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，該菌對(duì)氨芐西林、多西環(huán)素、卡那霉素、紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明等12種藥物有較強(qiáng)耐藥性；對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星等2種抗生素中度敏感；對(duì)頭孢唑啉、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢呋辛、丁胺卡那、新霉素、氯霉素、氧氟沙星等16種抗生素高度敏感。結(jié)合臨床用藥原則，可考慮適當(dāng)使用硫酸新霉素粉（水產(chǎn)用）來(lái)進(jìn)行防治。

表3 分離菌株WL-3藥敏試驗(yàn)結(jié)果①

2.5 部分毒力基因檢測(cè)

菌株WL-3的毒力基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，aer、alt、ahyB、act可以擴(kuò)增出單一條帶，與預(yù)期大小一致，而lip、ser、ast、fla沒(méi)有擴(kuò)增條帶。隨后對(duì)目的條帶進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)Blastn比對(duì)，其序列與腸毒素、脂肪酶、蛋白酶以及血溶素基因相似度達(dá)到100%，表明該菌株攜帶了多種毒力基因。

圖4 分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.6 最適溫度和最適pH值測(cè)定

菌株WL-3在不同的溫度和pH值下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，25～37℃時(shí)，菌株WL-3均能生長(zhǎng)，最適溫度是37℃，42℃時(shí)不能生長(zhǎng)；pH值為5～8時(shí)，均能生長(zhǎng)，最適pH值為7。

圖5 分離菌株WL-3在不同溫度和pH值生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

3 討論

3.1 病原菌的分離和鑒定

截至目前，已從患病烏鱧中分離得到不同種類病原菌，如殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌等[23-26]，其中，維氏氣單胞菌是一種人、獸、魚(yú)共患病原菌，廣泛分布在自然界中，既可感染魚(yú)類、引發(fā)敗血病和潰瘍綜合征等，也可以感染人類、引發(fā)敗血癥和胃腸炎等癥狀[27]。

針對(duì)臨沂市某烏鱧養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)皮膚潰爛病，從患病烏鱧體內(nèi)分離純化得到一株優(yōu)勢(shì)的革蘭陰性菌株WL-3，其生理生化特性與草魚(yú)源維氏氣單胞菌16-1、鯽源維氏氣單胞菌CFJY-623和維氏氣單胞菌ATCC 35624既相似，又不同[22，28]。雖然生理生化特征分析在細(xì)菌鑒定中十分常用，但也存在難度較高且準(zhǔn)確性低的缺陷，需要結(jié)合分子鑒定法[29]。16SrRNA和gyrB均為保守基因，存在于所有細(xì)菌中，是區(qū)別細(xì)菌種屬關(guān)系最有效和最精確的方法之一[30]。經(jīng)Blast比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，菌株WL-3的16SrRNA和gyrB基因序列與已知的維氏氣單胞菌同源性最高，并且與維氏氣單胞菌聚在一支中。因此，鑒定此分離菌株為維氏氣單胞菌WL-3。

3.2 致病性與致病機(jī)理

氣單胞菌毒力因子，如生物活性因子、黏附因子、水解酶和腸毒素等，與其致病性息息相關(guān)，也是評(píng)估其潛在致病性的良好指標(biāo)之一[31]。菌株WL-3的毒力基因檢測(cè)顯示，其攜帶了aer、alt、ahyB、act等4種毒力基因，分別編碼菌溶素、熱不穩(wěn)定腸毒素、彈性蛋白酶和細(xì)胞毒性腸毒素。菌溶素通過(guò)與糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白結(jié)合，破壞宿主的細(xì)胞膜，引發(fā)細(xì)胞凋亡[32]。彈性蛋白酶通過(guò)破壞和降解宿主免疫蛋白，加速其感染和定植[33]。腸毒素具有溶解紅細(xì)胞、破壞組織細(xì)胞系、在結(jié)扎腸環(huán)模型中引起液體分泌反應(yīng)等生物學(xué)活性功能[34]。菌株攜帶毒力因子多少與致病性強(qiáng)弱有一定相關(guān)性，說(shuō)明該菌株具有潛在致病性,但毒力基因與其致病機(jī)理的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。生長(zhǎng)曲線測(cè)定顯示，該菌株可以在不同的溫度、pH值和NaCl濃度（≤3%）下生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，這與維氏氣單胞菌CFJY-623相似[22]。這些結(jié)果有助于了解氣單胞菌的發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)特征，繼而評(píng)估感染引發(fā)病害的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 病害的預(yù)防及控制方法

目前治療皮膚潰爛病、爛鰓病、出血癥等魚(yú)類疾病的主要方法仍然是使用抗菌藥物。經(jīng)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌WL-3對(duì)氨芐西林、多西環(huán)素、卡納環(huán)素、紅霉素、四環(huán)素等多種藥物有較強(qiáng)抗性，但對(duì)頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶、丁胺卡那、新霉素、氯霉素等藥物敏感?？筛鶕?jù)水產(chǎn)用藥規(guī)定，選擇合適的敏感藥物，如硫酸新霉素粉（水產(chǎn)用）進(jìn)行相應(yīng)的治療。