黃樂，鄧月萍，孫雅晨，劉春蘭，劉麗華

（廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102）

自然水體中的硒主要為無機(jī)（硒酸鹽、亞硒酸鹽）形態(tài)[1]。硒元素是自然界中的痕量元素，在未被污染的水體中，硒質(zhì)量濃度一般為0.01～0.20 μg/L[2]。無機(jī)硒可由消化道吸收，為細(xì)胞內(nèi)硒代半胱氨酸的合成提供原料[3]。硒也是人體必需的微量元素之一，主要的生物學(xué)效應(yīng)是抗氧化性[4]，能夠提高機(jī)體免疫力[4]，防治心腦血管疾病[5-6]，并具有抗癌[5]等功效。機(jī)體攝入的硒元素通過維持含硒酶的活性，保護(hù)大腦免受過氧化損傷[7]，預(yù)防病毒感染，增強(qiáng)免疫功能[8]，抑制重金屬毒理[3]。但攝入量過高也會對人體造成毒害[9]，如加大患克山病的風(fēng)險[10]。因此，不少學(xué)者[11-12]根據(jù)相關(guān)資料，為富硒食品含硒量設(shè)定合理的范圍：下限保證補(bǔ)硒有效性，免于患上硒缺乏的疾病；上限考慮食用安全性，避免攝入過多而影響自身健康。

富硒水產(chǎn)是近年來開發(fā)補(bǔ)硒產(chǎn)品的一個新嘗試。黃蜆（Corbicula aurea Heude）隸屬于真瓣鰓目，蜆科，蜆屬，是典型的濾食性底棲生物，是常見的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品種，屬于大眾消費(fèi)品，具有較強(qiáng)的推廣潛力。貝類通過通氣作用富硒，富硒能力因硒元素形態(tài)而異。黃蜆在添加亞硒酸鈉、硒酸鈉、硒代蛋氨酸（50和500 μg/L）的環(huán)境中暴露3 d，分別引起通氣活動的加強(qiáng)、減弱和無改變[13]；在2 000 μg/L亞硒酸鈉環(huán)境中暴露1 h，富硒轉(zhuǎn)運(yùn)仍未飽和，而在約1 000 μg/L硒酸鈉、100 μg/L硒代蛋氨酸的相似條件下即飽和[2]。

現(xiàn)設(shè)置不同濃度的無機(jī)硒加富培養(yǎng)環(huán)境，采用原子熒光光譜法測定黃蜆體內(nèi)的硒含量，分析環(huán)境無機(jī)硒濃度對黃蜆體內(nèi)總硒含量的影響，初步探討黃蜆對無機(jī)硒的富集作用以及達(dá)到硒飽和的條件，并按照中國營養(yǎng)學(xué)會提供的膳食標(biāo)準(zhǔn)，評估富硒黃蜆的膳食攝入量，為補(bǔ)硒食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

2018年6月，鮮活黃蜆購自廈門市鎮(zhèn)海路市場，平均個體質(zhì)量6.643 g，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2 h后，加富培養(yǎng)。

1.1.2 質(zhì)控樣

扇貝粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW 10024，地球物理地球化學(xué)勘查研究所），含硒體積分?jǐn)?shù)為（1.5±0.3）×10-6。

1.1.3 試劑等

硝酸（HNO3）和過氧化氫（H2O2，30%）超級純；硒單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)080215]，100 mg/L，批號為17073（中國計(jì)量科學(xué)研究院）；亞硒酸鈉（Na2SeO3）、鹽酸（HCl，10%和50%）、鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）、硼氫化鉀（KBH4）、氫氧化鈉（NaOH）分析純。分析測定用水為超純水。

1.1.4 儀器設(shè)備

AFS-610B原子熒光光譜儀（北京瑞麗儀器公司）；硒編碼空心陰極燈；微波消解儀（美國CEM公司，型號MAES5）；超純水儀（美國Millipore公司，型號Elix-5+milli-Q）；電子天平（德國Sartorius公司，型號BS224S,BSA822）、電熱板（意大利Lab Tech公司，型號EH20B）。

1.2 方法

1.2.1 黃蜆培養(yǎng)

將4個無蓋立方塑料箱（40 cm×85 cm×60 cm）作為容器，每個容器中盛放總質(zhì)量（含殼）為750.00 g的新鮮黃蜆，并配1個循環(huán)水泵，在室溫（約26℃）和自然光照下通氣培養(yǎng)。參考馮金曉等[14]設(shè)計(jì)，以15 mg/L Na2SeO3為中等質(zhì)量濃度，設(shè)置4個組，A—D組環(huán)境硒濃度依次為0（空白對照組），5，15和30 mg/L?？紤]到貝類銷售前的暫養(yǎng)期為3 d左右[14]，以及無藻類飼養(yǎng)條件下的存活情況，富集時長定為4 d。

1.2.2 黃蜆含水率及死亡率測定

每天同一時間隨機(jī)采集30個樣品，稱量含殼質(zhì)量，解剖內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、斧足，稱濕質(zhì)量；冷凍干燥，稱干質(zhì)量，放置冰箱冷藏保存?zhèn)溆?。同時記錄各組的死亡個體數(shù)，計(jì)算死亡率。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用100 μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1.00 μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液和0.20 μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)使用液；將10%HCl依次稀釋成質(zhì)量濃度為0，1.60，3.20，4.00，6.40，8.00和12.00 μg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)工作液，并測熒光強(qiáng)度（IF）。以IF值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率檢測

電子天平（德國Sartorius公司，型號BS224S）稱取0.20 g國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)扇貝粉，按照1.2.3節(jié)的步驟進(jìn)行前處理，做2～3個重復(fù)，考察檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.5 樣本的總硒含量測定

電子天平稱取0.20 g干樣，放入聚四氟乙烯消解罐，依次加入2.00 mL Milli-Q超純水、5.00 mL HNO3和1.00 mL H2O2后，放入MAES5微波消解儀；冷卻，電熱板260℃趕酸至近干，加5.00 mL 50%HCl，繼續(xù)加熱至溶液清亮無色并伴有白煙；冷卻，移入25 mL玻璃比色管，10%HCl定容，加1 mL 100 g/L K3[Fe(CN)6]掩蔽劑，混勻。10%HCl載流液，1.5%KBH4（含0.5% KOH）還原劑，AF610B原子熒光光譜儀測熒光值IF，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得比色液的硒質(zhì)量濃度（μg/L）。樣本總硒含量的換算公式：

式中：Q——樣本的總硒含量，μg/g；C——比色液的硒質(zhì)量濃度，μg/L；B——空白液的硒質(zhì)量濃度，μg/L；M——樣本的干質(zhì)量，g；0.025——樣本的體積，L。

1.2.6 膳食攝入量評估

膳食攝入量為滿足硒元素攝入量，每日可食用的黃蜆質(zhì)量（含殼質(zhì)量）。《貝類凈化技術(shù)規(guī)范》（SC/T 3013—2002）要求，貝類上市前可用循環(huán)水凈化，時間控制為36 h左右[15]，因此參照《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》（WS/T 578.3—2017）中的硒參考攝入量或可耐受攝入量[16]，采用富硒1 d的黃蜆總硒含量，計(jì)算硒元素的膳食攝入量。膳食攝入量的計(jì)算公式：

式中：U——膳食攝入量，g/d；Q——黃蜆樣本的總硒含量（含殼質(zhì)量），μg/g；S——人群每日硒攝入量標(biāo)準(zhǔn)，μg/d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019和SPSS 18.0軟件，進(jìn)行繪圖、單因素方差分析（Levene's方差齊性檢驗(yàn)）和單樣本t-檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢出限

硒濃度在0～12 μg/L，IF與硒濃度有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=40.063 0 x-1.405 6，相關(guān)系數(shù)R=0.996 6。連續(xù)7次測定空白溶液，根據(jù)檢出限（L）的計(jì)算公式L=3×S/k，得出最低檢出限為0.67 ng/mL。其中S為空白多次測量的標(biāo)準(zhǔn)方差，k表示方法的靈敏度。多次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性R2為0.985 3～0.999 0，截距為-147.91～102.93。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率為83.52%～119.26%，方法不確定度UA為0.030 1。根據(jù)樣品說明書，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)扇貝的參考值為（1.2±0.3）mg/kg，測定值為（0.964 6±0.030 1）mg/kg（n=12），在標(biāo)準(zhǔn)值允許誤差范圍內(nèi)，說明該方法準(zhǔn)確、可靠，能夠滿足黃蜆中總硒的檢測。

2.3 黃蜆含水率及死亡率

黃蜆含水率及死亡率見表1。隨著培養(yǎng)時間的延長，各組黃蜆的死亡率均逐步上升，含水率波動較大，無明顯變化。富集結(jié)束時，D組死亡率最高。

表1 黃蜆生長指標(biāo)測定結(jié)果（n=30）

2.4 膳食攝入量評估

若以蜆作為單一補(bǔ)硒食品，不同年齡人群可食用富硒黃蜆的含殼質(zhì)量見表2。

2.5 樣本的總硒含量

2.5.1 個體總硒含量日變化

富硒黃蜆硒含量呈持續(xù)上升的變化趨勢，見圖1。A—D組日變化均表現(xiàn)極顯著水平（P＜0.01）。A組和B—D組之間存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖1 黃蜆體內(nèi)總硒含量（以干質(zhì)量計(jì)）變化趨勢

黃蜆在不同時間內(nèi)富硒倍率見圖2。由圖2可見，各組富硒倍率持續(xù)升高，隨環(huán)境硒濃度的增加而增加，且組間差距隨培養(yǎng)時間的延長而加大。

圖2 黃蜆在不同富集時間的富硒倍率

2.5.2 各組織總硒含量變化趨勢

A—D組各組織總硒含量變化趨勢見圖3（a）（b）（c）（d）。由圖3可見，B—D組黃蜆各部位的總硒含量明顯升高，外套膜＞斧足＞內(nèi)臟團(tuán)（P＜0.01）。3～4 d時，D組的外套膜和斧足、C組的內(nèi)臟團(tuán)總硒含量下降圖3（c）（d）。

圖3 不同組黃蜆總硒含量（以干質(zhì)量計(jì)）變化趨勢

不同組織總硒含量的變化趨勢見圖4（a）（b）（c）。由圖4可見，0～4 d，總硒含量基本都隨培養(yǎng)濃度的增加而增加，但3～4 d的D組外套膜、斧足以及C組內(nèi)臟團(tuán)的總硒含量均開始降低。

圖4 黃蜆不同組織內(nèi)總硒含量（干質(zhì)量）變化趨勢①

3 討論

3.1 黃蜆不同組織總硒含量的差異

無機(jī)硒可以通過被動吸收的形式進(jìn)入細(xì)胞[17]，主要由外套膜緊鄰?fù)馓浊坏亩鄬w實(shí)現(xiàn)。另外，硒可能與脂類，尤其是細(xì)胞膜上的脂類結(jié)合，而瓣鰓綱外套膜部分的脂肪含量較高[14]。紫貽貝（Mytilus edulis）和海灣扇貝（Argopecten irradians）外套膜硒含量同樣高于其他組織[17]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。肌肉是動物體內(nèi)重要的硒貯備庫，通常以硒代蛋氨酸的形態(tài)穩(wěn)定貯存[18]。培養(yǎng)后期，斧足的富硒倍率降低，是由于斧足肌蛋白與硒的結(jié)合趨近飽和狀態(tài)[17]。

與“刺參消化道中總硒含量普遍偏高”[18]不同，黃蜆內(nèi)臟團(tuán)總硒含量最低。原因在于刺參消化道結(jié)構(gòu)簡單，消化能力弱，無消化腺，也無特化出與解毒、排泄相關(guān)的組織和器官，因此硒易在腸道積累。而黃蜆有完整的消化道和消化腺[19]，具有呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和較完善的排泄系統(tǒng)（比原腎更為進(jìn)化的后腎），因此攝入的硒容易被消化、利用或排泄[20]，硒不易在內(nèi)臟積累。

值得注意的是，本研究僅分外套膜、斧足和內(nèi)臟團(tuán)，外套膜部分實(shí)際包含了外套膜和鰓。由Fournier等[13]研究結(jié)果可知，黃蜆個體富硒大小依次為內(nèi)臟團(tuán)、鰓、外套膜、斧足，富硒含量與經(jīng)由鰓器官的總硒含量成正比，即鰓是富硒的主導(dǎo)器官。本研究中“外套膜”測定部分因包含鰓器官，測定結(jié)果高于外套膜硒含量。

3.2 富集時間的影響

試驗(yàn)中，僅D組后期出現(xiàn)了富硒飽和點(diǎn)，通過無機(jī)硒代謝途徑消耗[20]，硒值下降。無機(jī)硒主要通過滲透作用進(jìn)入動物細(xì)胞，最終還將達(dá)到一定平衡濃度[14，17]。由于被動運(yùn)輸由細(xì)胞膜兩側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的濃度差決定，黃蜆在一定時間內(nèi)，不斷吸收環(huán)境中無機(jī)硒，并且高濃度硒環(huán)境中黃蜆吸收硒的速率快，也更早達(dá)到飽和。D組后期死亡率偏高，斧足硒值出現(xiàn)降低趨勢，或由于過量無機(jī)硒的生理毒性[21]，損害了貯硒功能。

3.3 富硒濃度的影響

高硒培養(yǎng)促進(jìn)富硒，出現(xiàn)飽和，但生理毒性[21]也影響硒貯效率。低硒培養(yǎng)的硒貯存效率偏低。中硒培養(yǎng)不僅能有效促進(jìn)富硒，而且能保證斧足中穩(wěn)定的硒貯存。Fournier等[2]并未觀察到黃蜆個體在亞硒酸鈉加富環(huán)境中的飽和狀態(tài)，很可能是由于環(huán)境濃度不夠高（在2 000 μg/L濃度范圍內(nèi)），并且暴露時間太短（1 h）。

本研究在自然條件下培養(yǎng)黃蜆，對培養(yǎng)水充氧和過濾，沒有投餌和控溫，而黃蜆的富硒培養(yǎng)還可能受營養(yǎng)狀況、環(huán)境溫度、營養(yǎng)鹽等其他因素的影響。Fournier等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在藻類密度為（0.5～10）×105cells/mL時，黃蜆個體在硒環(huán)境暴露期的濾食通氣率，會隨藻類密度的增加而降低。本試驗(yàn)黃蜆個體的健康狀況因缺少藻類餌料受到限制，但暫無證據(jù)表明對硒吸收水平產(chǎn)生影響。

3.4 膳食攝入量評估

肉類和水產(chǎn)類是膳食攝入硒的主要來源[22]，攝入硒大小依次為水產(chǎn)類、谷物、畜禽肉類、蔬菜、水果[23]。中國居民膳食以谷物為主，蔬果為輔，因此建議增加膳食多樣性，多吃水產(chǎn)類[24]。黃蜆富硒能力強(qiáng)，適合富硒產(chǎn)品開發(fā)。成人每日硒的參考攝入量為60 μg/d，可耐受最高攝入量為400 μg/d[16]，若以蜆作為單一補(bǔ)硒食品，成年人每天需攝入678.10～4 521.00 g未富硒黃蜆（含殼質(zhì)量），如食用富硒1 d的黃蜆，則只需攝入28.97（D組）～75.41 g（B組）。當(dāng)然，人類膳食營養(yǎng)是個復(fù)雜的過程，不能單一而論，有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)語

添加無機(jī)硒可有效提高黃蜆對硒的吸收、轉(zhuǎn)化與儲存水平。高濃度組，培養(yǎng)后期出現(xiàn)飽和點(diǎn)、甚至過飽和點(diǎn)。此外，硒的膳食攝入量評估結(jié)果顯示了黃蜆作為補(bǔ)硒食品的強(qiáng)大潛力。在未來研究方面，可通過測定富硒過程中，硒在黃蜆不同組織存在的形態(tài)，進(jìn)一步完善對富硒機(jī)制的認(rèn)知，亦可從分子層面上探究黃蜆對無機(jī)硒毒理效應(yīng)的應(yīng)對機(jī)制。值得注意的是，補(bǔ)硒食品的開發(fā)利用通常涉及養(yǎng)殖工程和食品工程等，這也表明了多學(xué)科、交叉學(xué)科研究對于現(xiàn)代高質(zhì)量漁業(yè)生產(chǎn)的重要性。