王淑云，盧雅艷，李 佳

中國人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學中心耳鼻喉科，北京 100161

鼻咽癌是源于咽部上部區(qū)域的惡性腫瘤，全球每年約有10萬例鼻咽癌確診病例，其中大部分病例發(fā)生在我國，以及南亞、北非和北極地區(qū)[1-2]。鼻咽癌發(fā)病是多因素作用的結果，包括EB病毒感染、遺傳易感性、不健康的生活方式和環(huán)境危害(如吸煙和接觸灰塵污染)等[3-4]。盡管近年來對鼻咽癌的治療取得了較大進步，然而大多數(shù)鼻咽癌患者因癥狀無特異性，往往被診斷時已至中晚期，已出現(xiàn)腫瘤侵襲、遠處轉移，導致患者預后不佳[5]。因此，探索能夠診治鼻咽癌的有效生物標志物對提高患者早期診斷率、改善患者預后意義重大。組蛋白去乙?；?HDAC)是一類細胞內的金屬蛋白酶，具有調控細胞生長和凋亡的作用，可影響相關基因的轉錄和表達[6]。在雌激素受體(ER)陽性乳腺癌細胞系中沉默HDAC1會抑制細胞生長和細胞周期進程并誘導細胞死亡[7]。HDAC1在卵巢癌患者的血清中明顯升高，建議將HDAC1作為診斷卵巢癌的血清生物標志物[8]。HDAC7在生理和病理條件下調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、遷移等[9]。目前，在肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、神經膠質瘤和淋巴瘤中觀察到HDAC1、HDAC7的異常表達[10]。然而，目前鮮有關于HDAC1、HDAC7在鼻咽癌患者中表達的研究報道。因此，本研究擬探討鼻咽癌患者癌組織中HDAC1、HDAC7表達水平及其與臨床、病理特征和預后的關系，以期為鼻咽癌的診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月本院收治的鼻咽癌患者102例為研究對象，其中男50例，女52例；年齡38～72歲。納入標準：(1)病理檢查確診為鼻咽癌；(2)所有鼻咽癌患者在最初活檢時未接受過放療或化療；(3)臨床及隨訪資料完整。排除標準：(1)臨床信息不完整；(2)隨訪失敗或死亡原因不明；(3)合并其他腫瘤；(4)合并嚴重心血管疾病；(5)妊娠期女性。對102例鼻咽癌患者均連續(xù)隨訪至2021年1月。根據世界衛(wèi)生組織(WHO)的鼻咽癌組織學分類標準，所有患者都具有明確的鼻咽癌組織學診斷依據。根據國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)第8版鼻咽癌TNM分期系統(tǒng)(2017)的標準對鼻咽癌患者進行分期?；颊呒凹覍倭私獗狙芯?，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集 采集所有研究對象癌組織及癌旁組織，分別納入鼻咽癌組與癌旁組。

1.2.2免疫組織化學法檢測HDAC1、HDAC7表達 通過免疫組織化學法檢測鼻咽癌患者癌組織及癌旁組織中HDAC1、HDAC7的表達水平。石蠟切片脫蠟(10 min)，乙醇脫水(濃度順序依次為100%、95%和75%)，并用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(3 min)。將組織與3%H2O2一起孵育(20 min，室溫)以阻斷內源性過氧化物酶活性，蒸餾水洗滌(5 min)。將切片置于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值為6)中進行抗原修復，95～100 ℃下加熱10 min，然后用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(5 min)。將切片在室溫下轉移到抗原中修復10 min，采用聚丁二酸丁二醇酯(3 min)洗滌。在室溫下與10%牛血清清蛋白孵育(20～30 min)后，將組織與50 μL小鼠抗人HDAC1、HDAC7抗體(1∶5 000、1∶2 000，Boster，中國，批號：652414、741659)在4 ℃下孵育過夜。用聚丁二酸丁二醇酯作為陰性對照，然后在37 ℃下復溫30 min，用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(3 min)。每張切片用50 μL生物素偶聯(lián)的二抗在37 ℃下孵育30 min，然后用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(3 min)。將鏈霉親和素-過氧化物酶加入切片，在37 ℃下孵育30 min，并用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(4 min)。組織在室溫下用二氨基聯(lián)苯胺溶液染色，然后在控制染色時間的顯微鏡下觀察。隨后，用蒸餾水終止相應的反應。蘇木精用于復染，然后用蒸餾水洗滌切片。用稀鹽酸清洗染色切片表面，用自來水沖洗3 min。脫水后依次進行二甲苯透明和中性膠封片，顯微鏡下觀察切片。

免疫組織化學法檢測結果由兩名經驗豐富的病理學醫(yī)師采用雙盲法確認。HDAC1、HDAC7的表達產物定位在細胞質中，鼻咽癌組織細胞HDAC1、HDAC7免疫組織化學法染色后細胞質中出現(xiàn)褐色顆粒為陽性。每張切片隨機選取10個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)100個細胞。從染色強度與陽性細胞百分比兩個方面判定染色指數(shù)(SI)。染色強度：無明顯染色計0分，有淡黃色染色計1分，有棕黃色染色計2分，有棕褐色染色計3分；陽性細胞百分比：無陽性細胞計0分，陽性細胞占比<34%計1分，34%～<68%計2分，≥68%計3分。SI：SI=染色強度得分×陽性細胞百分比得分，SI≥5分為陽性表達，SI<5分為陰性表達。

1.2.3隨訪 術后每3個月通過電話和問卷調查信對患者進行隨訪。從最初的手術日期到死亡日期為總生存期。通過家庭報告確定患者的死亡，并通過查閱公共記錄進行核實。所有患者出院后均隨訪3年或直至患者死亡。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理及統(tǒng)計分析，HDAC1、HDAC7在組織中的表達采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用多因素Cox回歸模型探討影響鼻咽癌預后的相關因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1癌旁組、鼻咽癌組中HDAC1、HDAC7表達情況比較 鼻咽癌組HDAC1、HDAC7陽性率高于癌旁組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2不同特征鼻咽癌患者的 HDAC1、HDAC7表達情況比較 不同性別、年齡鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結轉移、有復發(fā)的鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7陽性率明顯高于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無淋巴結轉移、無復發(fā)的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3鼻咽癌患者預后情況 102例鼻咽癌患者出院至隨訪結束，3年生存率為60.8%(62/102)。HDAC1陽性和陰性患者3年總生存率分別為45.7%(32/70)和93.8%(30/32)，而HDAC7陽性和陰性患者3年總生存率分別為51.4%(38/74)和85.7%(24/28)；HDAC1、HDAC7陽性的鼻咽癌患者3年生存率均明顯低于HDAC1、HDAC7陰性的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 癌旁組、鼻咽癌組中HDAC1、HDAC7表達情況比較[n(%),n=102]

表2 HDAC1、HDAC7表達與鼻咽癌臨床、病理特征的關系[n(%)]

2.4影響鼻咽癌患者預后的單因素分析 腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結轉移、有復發(fā)的鼻咽癌患者3年生存率明顯低于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無淋巴結轉移、無復發(fā)的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.5影響鼻咽癌患者預后的多因素Cox回歸分析 TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、分化程度低、HDAC1陽性、HDAC7陽性是鼻咽癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表3 影響鼻咽癌患者預后的單因素分析[n(%)]

表4 影響鼻咽癌患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

鼻咽癌是我國華南地區(qū)耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤，轉移和復發(fā)是其治療失敗的主要因素。早期預測鼻咽癌預后需要一種特異度及靈敏度高，且成本效益高的新型血清蛋白生物標志物，以減少鼻咽癌治療失敗。由BRLF1編碼的Rta蛋白(一種轉錄激活因子)是EB病毒早期裂解的產物，是調節(jié)EB病毒感染從潛伏期到裂解階段變化的關鍵因素，因此被提出作為診斷鼻咽癌的分子生物標志物。此外，微小RNA(miR)-10b和miR-34也是用于鼻咽癌診斷和預后評估的潛在新型核酸標志物。然而，這些標志物不能用于預測鼻咽癌轉移和復發(fā)。

HDAC1、HDAC7在許多生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用，包括細胞分化、基因表達、免疫系統(tǒng)調節(jié)、細胞衰老、程序性細胞死亡和致癌過程。GUO等[11]的研究證實HDAC1、HDAC7參與致癌、血管生成、細胞增殖和侵襲過程，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關。另外，ISHIKAWA等[12]也證實腫瘤的許多生理、病理過程與HDAC1、HDAC7相關，如腫瘤的免疫調節(jié)、細胞凋亡、耐藥性等，并且HDAC1、HDAC7還參與癌基因激活和抑癌基因失活。另有研究已在各種腫瘤中檢測到HDAC1、HDAC7的異常表達，包括結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和食管癌[13]。既往研究表明，HDAC1、HDAC7的表達升高可抑制細胞凋亡，與星形細胞瘤患者預后不良關系密切[14]。HDAC1、HDAC7陽性表達與ER/孕激素受體表達呈負相關，可預測浸潤性導管乳腺癌的不良預后[15]。本研究結果顯示，鼻咽癌組HDAC1、HDAC7陽性率高于癌旁組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結轉移、有復發(fā)的鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7陽性率明顯高于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無淋巴結轉移、無復發(fā)的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明HDAC1、HDAC7與鼻咽癌臨床、病理特征有關。

HDAC1、HDAC7是反映癌癥發(fā)生和某些癌癥侵襲性的生物標志物。據報道，與正常大腸黏膜組織相比，大腸腺癌組織中HDAC1、HDAC7過度表達，HDAC1、HDAC7在上皮和固有層中均被發(fā)現(xiàn)，HDAC1、HDAC7也被證實與大腸癌的淋巴結轉移相關[16]。在機制方面，HDAC1、HDAC7可以增加抗凋亡Bcl-xl和Bcl-2的表達豐度，并降低促凋亡Bax蛋白水平[17]。HDAC1、HDAC7還被證明在多種惡性腫瘤中高表達，可能作為預后不良的標志物，靶向降低HDAC1、HDAC7表達水平可能是腫瘤的一種治療方法[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1、HDAC7陽性的鼻咽癌患者3年生存率均明顯降低(P<0.05)。且鼻咽癌患者預后的單因素分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結轉移、有復發(fā)的鼻咽癌患者3年生存率明顯低于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無淋巴結轉移、無復發(fā)的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HDAC1、HDAC7陽性是鼻咽癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。臨床研究表明，HDAC1、HDAC7結合癌胚抗原和糖類抗原19-9可用于結直腸癌早期診斷[20]，本研究未探討HDAC1、HDAC7對鼻咽癌的診斷效能，這將在后續(xù)研究中進行。

綜上所述，鼻咽癌患者癌組織中HDAC1、HDAC7高表達，其與臨床、病理特征有關，HDAC1、HDAC7陽性是鼻咽癌患者預后不良的獨立危險因素。