毛 俊，王 柯

1.湖北省武漢市優(yōu)撫醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430000；2.湖北省武漢市金銀潭醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北武漢 430040

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性、進(jìn)行性氣道炎癥性疾病，好發(fā)于老年人，以持續(xù)性呼吸道癥狀和進(jìn)行性氣流阻塞為特征，嚴(yán)重影響患者肺通氣功能[1]。全球每年因COPD死亡的人數(shù)已經(jīng)超過 300萬，盡管臨床上在預(yù)防治療COPD急性加重期方面取得了一定成就，但仍不能抑制疾病進(jìn)展[2]。因此，尋找老年COPD相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)對(duì)改善患者預(yù)后十分重要。表面活性蛋白D(SP-D)是一種與肺先天免疫相關(guān)的鈣依賴性凝集素，以多種方式介導(dǎo)病原體的清除，在肺宿主防御中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是診斷肺損傷的生物標(biāo)志物[3]。趨化因子配體13(CXCL13)是B細(xì)胞趨化因子，可調(diào)節(jié)B細(xì)胞聚集至炎癥病灶，在自身免疫性疾病中CXCL13合成增加，并且與疾病進(jìn)展相關(guān)[4]。長鏈非編碼RNA漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1(lncRNA PVT1)是一種與腫瘤相關(guān)的lncRNA，參與肺癌細(xì)胞增殖分化及侵襲轉(zhuǎn)移過程[5]。本研究擬探討老年COPD患者血清中SP-D、CXCL13及l(fā)ncRNA PVT1表達(dá)特點(diǎn)，并分析以上指標(biāo)與肺功能的相關(guān)性，旨在為臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年3月至2021年5月湖北省武漢市優(yōu)撫醫(yī)院收治的300例老年COPD患者為研究對(duì)象。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②年齡≥65歲；③入組前未接受過抗感染治療。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肺組織良、惡性腫瘤及其他部位惡性腫瘤；②合并肺結(jié)核、哮喘、肺源性心臟病、感染性肺炎；③合并自身免疫性疾病。其中急性加重期患者135例(急性加重期組)，穩(wěn)定期患者165例(穩(wěn)定期組)，急性加重期患者均符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)診治中國專家共識(shí)(2017年更新版)》[7]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選擇同期在湖北省武漢市優(yōu)撫醫(yī)院進(jìn)行體檢的65例健康者納入對(duì)照組，均排除呼吸系統(tǒng)疾病、感染及免疫性疾病。所有研究對(duì)象自愿參與本研究，并簽署知情同意書。本研究獲得湖北省武漢市優(yōu)撫醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2血清標(biāo)本采集及檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血3 mL，注入干燥試管，室溫下靜置30～60 min，凝固后取上層液離心(參數(shù)：半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，時(shí)間15 min)，取血清于—70 ℃冰箱保存待檢。采用Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司，比色夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測(cè)血清SP-D、CXCL13水平，試劑盒購自美國R&D公司。取血清標(biāo)本，加入TRIzolTMplus RNA凈化試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總 RNA，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)將 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Step One PlusTM實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)系統(tǒng)(美國賽默飛Applied Biosystems)進(jìn)行qRT-PCR分析，采用2—ΔΔCt法計(jì)算lncRNA PVT1相對(duì)表達(dá)水平，lncRNA PVT1引物序列：正向引物為5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，反向引物為5′-AGAGACACCAAGACTGGCTCT-3′。β-actin(內(nèi)參)正向引物為5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′；反向引物為5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，正、反向引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 μL，加RNase-Free ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性3 min， 98 ℃變性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)30次。

1.3肺功能指標(biāo)檢測(cè) COPD患者入組當(dāng)日、健康者體檢當(dāng)日，采用FGC-A肺功能測(cè)試儀(安徽電子科學(xué)研究所)檢測(cè)第1秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1與用力肺活量(FVC)比值(FEV1/FVC)、FEV1占預(yù)計(jì)值百分?jǐn)?shù)(FEV1%pred)。

2 結(jié) 果

2.13組基線資料、肺功能指標(biāo)比較 3組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。急性加重期組、穩(wěn)定期組合并基礎(chǔ)疾病比例、吸煙史比例高于對(duì)照組，F(xiàn)EV1、FEV1/FVC、FEV1%pred低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。急性加重期組FEV1、FEV1/FVC、 FEV1%pred低于穩(wěn)定期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.23組血清SP-D、CXCL13水平及l(fā)ncRNA PVT1表達(dá)比較 急性加重期組血清SP-D、CXCL13水平及l(fā)ncRNA PVT1表達(dá)均高于穩(wěn)定期組和對(duì)照組，穩(wěn)定期組血清SP-D、CXCL13水平及l(fā)ncRNA PVT1表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3SP-D、CXCL13水平及l(fā)ncRNA PVT1表達(dá)與肺功能指標(biāo)的相關(guān)分析 COPD患者血清SP-D、CXCL13水平及l(fā)ncRNA PVT1表達(dá)均與FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

2.4SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鑒別COPD急性加重期和穩(wěn)定期的效能 SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鑒別COPD急性加重期和穩(wěn)定期的曲線下面積(AUC)分別為0.707、0.671、0.696。SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1聯(lián)合檢測(cè)鑒別COPD急性加重期和穩(wěn)定期的AUC為0.878，大于SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1單獨(dú)檢測(cè)的AUC(Z=5.922、6.741、6.470，P<0.05)，見表4和圖1。

表1 3組基線資料、肺功能指標(biāo)比較或n(%)]

組別n基礎(chǔ)疾病糖尿病高血壓高脂血癥FEV1(L)FEV1/FVC(%)FEV1%pred(%)急性加重期組13562(45.93)*73(54.07)*54(40.00)*43.65±4.41*#56.80±5.79*#58.24±6.35*#穩(wěn)定期組16580(48.48)*89(53.94)*62(37.58)*55.02±6.72*64.28±5.17*67.01±7.06*對(duì)照組6513(20.00)15(23.08)10(15.38)77.35±8.9579.26±7.0276.01±8.43F/χ216.53620.45413.005595.947333.056146.446P<0.001<0.0010.001<0.001<0.001<0.001

表2 3組血清SP-D、CXCL13水平及l(fā)ncRNA PVT1表達(dá)比較

表3 SP-D、CXCL13水平及l(fā)ncRNA PVT1表達(dá)與肺功能指標(biāo)的相關(guān)分析

表4 SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鑒別COPD急性加重期和穩(wěn)定期的效能

圖1 SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鑒別COPD急性加重期和穩(wěn)定期的ROC曲線

3 討 論

COPD 是全球第三大死亡原因，吸煙、空氣污染、職業(yè)暴露是COPD發(fā)病的高危因素[8]。老年人由于機(jī)體功能衰退，免疫力和抵抗力減弱，加之共病的影響，更容易發(fā)生COPD，持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng)、漸進(jìn)性氣流受限導(dǎo)致氣道狹窄，黏液阻塞，肺實(shí)質(zhì)破壞和肺彈性喪失，影響肺通氣功能。隨著COPD癥狀加重和惡化，肺功能逐漸降低，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[9]。

SP-D是一種上皮細(xì)胞衍生的免疫調(diào)節(jié)劑，主要由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和下呼吸道Clara細(xì)胞分泌，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、參與肺初始免疫應(yīng)答等作用，在維持肺表面活性劑穩(wěn)態(tài)、肺先天免疫中發(fā)揮重要作用[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)急性加重期組血清SP-D水平高于穩(wěn)定期組和對(duì)照組，表明SP-D與COPD發(fā)病及急性發(fā)作均有關(guān)，檢測(cè)血清SP-D水平可反映COPD病情變化。相關(guān)分析結(jié)果顯示，SP-D與FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred呈負(fù)相關(guān)，說明SP-D水平越高，肺功能損傷越嚴(yán)重，SP-D水平升高可能原因?yàn)轫憫?yīng)肺組織局部炎癥刺激，肺組織損傷越嚴(yán)重，肺泡表面合成SP-D越多。LPEZ-CANO等[13]報(bào)道SP-D水平在肥胖2型糖尿病肺損傷患者血清中升高，且與FEV1呈負(fù)相關(guān)。YAMAKAWA 等[14]研究結(jié)果顯示，血清 SP-D 水平升高是系統(tǒng)性硬化癥和混合性結(jié)締組織病并發(fā)間質(zhì)性肺疾病的潛在預(yù)測(cè)因子，與肺活量下降有關(guān)。分析SP-D參與COPD的機(jī)制為轉(zhuǎn)化生長因子β可誘導(dǎo)SP-D水平升高，且可調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞，在炎癥環(huán)境中轉(zhuǎn)化生長因子β增加 SP-D表達(dá)，從而參與宿主免疫防御[15]。

CXCL13是一種B淋巴細(xì)胞趨化因子，由濾泡樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在次級(jí)淋巴器官中產(chǎn)生，CXC 趨化因子受體5是CXCL13的受體，CXCL13通過激活CXC 趨化因子受體5調(diào)節(jié)B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群歸巢，在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)血清CXCL13水平在COPD患者中也明顯升高，且在急性加重期更高，說明CXCL13可促使COPD發(fā)病和病情加重。本研究中相關(guān)分析結(jié)果顯示，CXCL13水平與肺功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，提示CXCL13水平升高可誘導(dǎo)肺功能下降。ALTURAIKI等[17]研究結(jié)果顯示CXCL13水平在呼吸道合胞病毒感染小鼠模型中升高，并促使氣道淋巴細(xì)胞聚集。XUE等[18]報(bào)道血清CXCL13水平升高與間質(zhì)性肺疾病的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，是間質(zhì)性肺炎診斷的標(biāo)志物。分析CXCL13參與COPD的可能機(jī)制為三級(jí)淋巴器官(也稱異位淋巴樣組織)在COPD 進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，T濾泡輔助樣細(xì)胞表面CXCL13在樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)下表達(dá)增加，并促使異位淋巴樣組織產(chǎn)生[19]，異位淋巴樣組織可促使肺組織病理纖維化、肺功能惡化[20]。

lncRNA PVT1是原癌基因 N-myc的下游基因，在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)[21]。已知lncRNA PVT1參與哮喘發(fā)病，lncRNA PVT1通過負(fù)向調(diào)控miR-15a-5p或海綿miR-29c-3p，激活磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶-B-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶分子信號(hào)傳導(dǎo)，促使CD4+T 細(xì)胞向輔助性T細(xì)胞2分化，從而誘導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng)發(fā)生，促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖和氣道重塑[22]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA PVT1與COPD也存在密切關(guān)系，lncRNA PVT1高表達(dá)與肺功能下降有關(guān)，分析可能的原因?yàn)閙iR-146a是lncRNA PVT1的靶點(diǎn)，也是公認(rèn)的慢性氣道呼吸系統(tǒng)疾病的抗炎介質(zhì)，可抑制COPD腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、白三烯B4等致炎介質(zhì)表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)作用[23]，miR-146a是lncRNA PVT1的下游靶標(biāo)，lncRNA PVT1通過負(fù)向調(diào)控miR-146a誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與COPD發(fā)病過程[24]。

綜上所述，老年COPD患者血清SP-D、CXCL13水平及l(fā)ncRNA PVT1表達(dá)均升高，高水平SP-D、CXCL13，高表達(dá)lncRNA PVT1與COPD急性加重及肺功能下降均有關(guān)。本研究不足之處為尚未分析SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1與老年COPD患者臨床治療結(jié)局的關(guān)系，待進(jìn)一步追蹤臨床治療結(jié)局加以證實(shí)。