楊天銘，劉渝辰，梁 露，甘思逸，劉宇鑫，王遠(yuǎn)興

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

臍橙營養(yǎng)豐富，含有精油，類黃酮、類胡蘿卜素、酚酸、檸檬苦素以及維生素等多種有益化學(xué)成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗突變，降膽固醇水平及調(diào)節(jié)免疫力等生理功效[1]。臍橙CitrussinensisOsbeck被稱為“柑橘之王”，主要盛產(chǎn)于江西、重慶、廣西、湖南、四川等地。其外表鮮美、香味濃郁、口感酸甜，屬于水果中的佳品。但由于臍橙園中果樹品種通常較為單一，容易受到病蟲害的威脅，黃龍病(Huanglongbing，HLB)又稱黃梢病、青果病、黃枯病，是由一種由于柑橘韌皮部定殖細(xì)菌CandidatusLiberibacter asiaticus(CLas)引起的柑橘免疫疾病[2]，柑橘黃龍病的傳播途徑一般分為兩種：一是帶病苗木或帶病接穗。二是蚜蟲與亞洲柑橘木虱(Diaphorinacitri)，果實(shí)患病后嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)，果實(shí)難以從綠轉(zhuǎn)黃，糖酸比、外形、風(fēng)味口感都無法達(dá)到商業(yè)售賣需求[3,4]，甚至造成柑橘樹枯死，果樹感染之后一般采用焚燒處理。

黃龍病由于其毀滅性的危害而被比作為柑橘產(chǎn)業(yè)的“癌癥”[5]，在世界的五大洲約50個(gè)國家和地區(qū)均有發(fā)生[6-8]。黃龍病研究時(shí)間已經(jīng)超過半個(gè)世紀(jì)，但是對(duì)患黃龍病的臍橙一般也只做廢棄處理，為了挽回果農(nóng)的損失，探尋黃龍病果皮果肉的加工再利用價(jià)值，可以提取黃龍病果皮中精油，提取黃龍病果肉中膳食纖維進(jìn)行改性[9]，從而節(jié)約資源、創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

代謝組學(xué)是一個(gè)新興的分析化學(xué)領(lǐng)域，專注于小型代謝物的鑒定[10]。代謝組學(xué)最初主要應(yīng)用于藥物應(yīng)用，現(xiàn)已成為農(nóng)業(yè)和食品科學(xué)中的不可或缺的工具，常常被用于表征植物受外界影響后的代謝動(dòng)態(tài)變化。代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)能夠識(shí)別不同地區(qū)的同一植物品種代謝成分的差異，例如本課題組采用UPLC-QTOF-MS結(jié)合非靶向代謝組學(xué)對(duì)中國6個(gè)贛南地區(qū)臍橙和7個(gè)非贛南地區(qū)臍橙進(jìn)行地理來源的鑒別，并鑒定出了42個(gè)潛在差異代謝物[11]。Parastar H[12]等采集了4種柑橘屬植物(檸檬、橙、柑橘、葡萄柚)的18個(gè)批次樣本，并采用多種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)其果實(shí)皮的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS指紋性分析，結(jié)果表明代謝組學(xué)方法可以用于對(duì)柑橘類植物的辨別。

本實(shí)驗(yàn)將基于代謝組學(xué)技術(shù)，利用UPLC-QTOF-MS分析正常臍橙與患黃龍病臍橙化學(xué)成分差異，結(jié)合化學(xué)計(jì)量軟件進(jìn)行差異分析，找出標(biāo)志性成分，并分析其變化原因，對(duì)患病臍橙的成分性質(zhì)、含量變化，以分布規(guī)律進(jìn)行研究[13]，探究患病臍橙在加工、營養(yǎng)和保健上的剩余價(jià)值，充分利用資源，為受災(zāi)農(nóng)戶挽回一定的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用贛南臍橙采于尋烏縣源興果業(yè)有限公司臍橙基地(N24.96°/E115.65°)。從結(jié)果期開始，每半個(gè)月進(jìn)行一次田間診斷，發(fā)現(xiàn)有明顯感染黃龍病癥狀的臍橙果樹(樹梢黃化，果實(shí)畸形或出現(xiàn)紅鼻子果)，做好標(biāo)記和隔離措施。到臍橙的成熟期(每年10至11月)，從做好標(biāo)記的患病果樹樹冠中央到外圍隨機(jī)采摘12個(gè)樣品，同時(shí)在最近正常臍橙果樹上隨機(jī)摘取達(dá)到正常售賣標(biāo)準(zhǔn)的12個(gè)正常臍橙樣品。果實(shí)樣品采收后立即用蒸餾水洗凈，并用攪拌機(jī)榨取果肉，放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

甲醇(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)，美國ROE公司；屈臣氏蒸餾水，屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200E型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；料理機(jī)，浙江蘇泊爾股份有限公司；Agilent6538四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有Agilent1290高效液相色譜儀(四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器)、Agilent MassHunter數(shù)據(jù)處理軟件與電噴霧離子源，美國Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣液的制備

精確稱取2.00 g贛南臍橙果肉勻漿或果皮碎塊，加入4 mL 80%甲醇溶液超聲提取10 min，置于離心機(jī)中4800 r/min離心20 min，將收集的上清液用0.22 μm PTFE濾膜過濾于2.5 mL棕色螺旋進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-Q-TOF/MS的非靶向代謝組學(xué)檢測[14]。

從每個(gè)樣品的上清液中各吸取50 μL上清液混合在一起，制成質(zhì)量控制樣本QC(quality control)。在開始進(jìn)行樣品的序列分析之前，將QC樣品連續(xù)注入10 次以平衡系統(tǒng)，確保所收集數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，然后，在整個(gè)分析過程中定期分析QC樣品(每隔5個(gè)樣本)，以監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性[15]。同時(shí)，在QC樣本分析后，注入空白樣品(MeOH / H2O，80:20,v / v)，以減少序列分析過程中的殘留效應(yīng)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：色譜柱：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL；梯度洗脫：0～12 min，5%～30% B；12～27 min，30%～75%B；27～32 min，78%～95%；32～35 min，95%～5%；35～37 min，5%；后運(yùn)行時(shí)間：2 min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電子模式：電噴霧電離；干燥氣(N2)溫度：350 ℃；干燥氣流速：10.0 L·min-1；霧化器壓力，40 psig；毛細(xì)管電壓(VCap)：3500 V；碰撞電壓：120 V；質(zhì)量掃描范圍：50～1700 m/z；二級(jí)碰撞能：10～50 V。在運(yùn)行過程中，連續(xù)注入含有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)112.985 6(TFANH4)和1033.9881(HP-0921)的溶液作為質(zhì)量校準(zhǔn)的校準(zhǔn)液，以保證離子理想的質(zhì)量精度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

原始數(shù)據(jù)通過Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00(Agilent,USA)采集，并使用Agilent Masshunter Profinder B.06.00(Agilent,USA)軟件將UPLC-QTOF-MS采集的原始數(shù)據(jù)文件(.d)進(jìn)行預(yù)處理，包括數(shù)據(jù)挖掘?qū)R，參數(shù)如下：使用批量遞歸特征提??；峰過濾器-峰高(輪廓和質(zhì)心質(zhì)譜圖)：≥300 counts；離子種類-正離子：+H，+Na，+K；負(fù)離子：-H，+Cl，+CH3COO；峰高-絕對(duì)峰高：≥5000；對(duì)齊誤差：保留時(shí)間誤差：2%±0.20 min；質(zhì)量窗口：7×10-6±2.00 mDa。處理完畢后把文件導(dǎo)出為.csv文件，導(dǎo)入到Metaboanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca)進(jìn)行后續(xù)處理[16,17]：舍棄空值大于50%的化合物數(shù)據(jù)，其余用該化合物峰面積平均數(shù)填補(bǔ)；剔除質(zhì)控樣品中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)大于25%的離子數(shù)據(jù)；用總數(shù)歸一化、對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和柏拉圖標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。保存處理后的數(shù)據(jù)為.csv格式。然后將特征化合物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括主成分分析(principal component analysis,PCA)，正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)，聚類分析(cluster analysis，CA)以及熱圖分析，這種方法在之前研究證明是可行的[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

為了獲得高質(zhì)量、可靠性強(qiáng)和高質(zhì)量的非靶向代謝組學(xué)研究數(shù)據(jù)。本文對(duì)樣品分析方法的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的可靠性進(jìn)行了監(jiān)測：分別從正負(fù)離子模式的QC 樣本中隨機(jī)挑選6個(gè)特征離子，正離子模式：0.86(RT)-120.042(m/z)，8.84(RT)-386.092(m/z)，13.85(RT)-432.208(m/z)，15.99(RT)-648.181(m/z)，22.51(RT)-740.301(m/z)，32.45(RT)-368.257(m/z)；負(fù)離子模式：0.85(RT)-220.018(m/z)，7.34(RT)-264.136(m/z)，12.52(RT)-742.232(m/z)，15.96(RT)-1198.307(m/z)，21.66(RT)-727.39(m/z)，29.59(RT)-357.36(m/z)，計(jì)算離子峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations,RSD)來評(píng)估分析方法和儀器的重復(fù)性和穩(wěn)定性。結(jié)果表示，保留時(shí)間的RSD 為0.05%～0.37%，峰面積的RSD為1.01%～6.28%。此結(jié)果表明儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，所采集的數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步地研究與分析。此外，如圖1所示，在正負(fù)離子模式的所有QC樣本中，檢測出的化合物RSD<30%的占比分別為82.33%

RSD/%圖1 QC樣本中離子特征RSD分布圖Fig.1 RSD distribution of ions in QC samples

和79.04%。綜合以上結(jié)果，我們可以認(rèn)為多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中所存在的誤差是由樣本本身的差異造成的，而非系統(tǒng)或分析上存在的誤差。

2.2 主成分分析

正常、黃龍病臍橙的總離子流圖(total ion chromatogramphy,TIC)如圖2所示。

通過Agilent Masshunter Profinder B.06.00和Metaboanalyst 5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，數(shù)據(jù)矩陣分為正離子模式、負(fù)離子模式和果皮、果肉4種，包含了各24個(gè)樣品和515～1440個(gè)峰(RT-m/z)。在考慮所有變量的情況下，PCA是一種可以對(duì)患黃龍病和健康臍橙進(jìn)行評(píng)估的一種非監(jiān)督判別方法，可以對(duì)樣品進(jìn)行聚類關(guān)系評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)中，PCA得分圖獲得了較好的擬合模型，其中方差R2X為0.728～0.789(表1)，均大于0.5，并高于交叉驗(yàn)證預(yù)測能力Q2(0.492～0.607)。如PCA得分圖(圖3)所示，正離子模式中方差累計(jì)貢獻(xiàn)度前二的主成分(PCs)分別為36.9%和14.9%(果皮)和42.3%和13.7%(果肉)，負(fù)離子模式中分別為36.9%和13.5%(果皮)和42.7%和15.6%(果肉)。雖然黃龍病臍橙由于受到不同程度病害影響樣品點(diǎn)較分散，但是兩種臍橙樣品在圖中還是能明顯分成兩組，說明不管在正離子模式還是負(fù)離子模式中，黃龍病臍橙和正常臍橙在化學(xué)成分含量上都存在顯著差異。

2.3 OPLS-DA模型的建立和差異化合物的探尋

除了無監(jiān)督模式的主成分分析以外，本實(shí)驗(yàn)還使用Simca 14.0對(duì)所有樣本建立正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。每組樣品在4個(gè)OPLS-DA模型中都顯示出了明顯地分離(圖4)在OPLS-DA模型中，R2Y和Q2都大于0.5，說明建立的模型具有良好的預(yù)測能力[19]。隨后，對(duì)每個(gè)模型進(jìn)行了200次的隨機(jī)置換檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，檢驗(yàn)后的R2和Q2在0.569～0.82之間，且P<0.001(CV-ANOVA)，表明所有的OPLS-DA模型都是穩(wěn)定和可重復(fù)的。

圖5 4種OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)Fig.5 Permutation test among four OPLS-DA models

通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以及各個(gè)OPLS-DA模型中的化學(xué)標(biāo)記物和篩選出VIP>1.0、P<0.001(T檢驗(yàn))且Fold Change值>2或<0.5的代謝物作為差異代謝物，有助于區(qū)別黃龍病臍橙與正常臍橙。盡管有眾多化合物峰無法被鑒定，但根據(jù)準(zhǔn)確的質(zhì)荷比、保留時(shí)間和二級(jí)圖譜，對(duì)比metlin數(shù)據(jù)庫、Ms-dial軟件和文獻(xiàn)，在正負(fù)離子模式的果皮和果肉中鑒定出了28種(果皮21種、果肉11種)潛在的差異化合物(表2)，包括氨基酸、有機(jī)酸、糖苷、酯類等。

表1 不同模型下的PCA和OPLS-DA的參數(shù)Table.1 The parameters of different PCA and OPLS-DA models

表2 基于UPLC-QTOF-MS的患黃龍病臍橙與正常臍橙的差異化合物Tab.2 Differential compounds of Huanglongbing and normal navel orange based on UPLC-QTOF-MS

續(xù)表2 基于UPLC-QTOF-MS的患黃龍病臍橙與正常臍橙的差異化合物Tab.2 Differential compounds of Huanglongbing and normal navel orange based on UPLC-QTOF-MS

在鑒定差異化合物后，差異化合物在兩種臍橙中的相對(duì)含量如圖6，圖7所示。從圖中可以看到，贛南臍橙在患黃龍病后，果皮中的氨基酸和包括柚皮苷在內(nèi)的糖苷類含量明顯增高，這與王強(qiáng)[9]等的研究結(jié)果一致，其中苯丙氨酸含量在患病臍橙果皮中偏高可能是因?yàn)楸奖仡惖拇x在植物抵御外界威脅中起到重要的作用[20]。Kiefl.J[21]等對(duì)患黃龍病臍橙的研究發(fā)現(xiàn)，被感染的果實(shí)有刺激性苦澀味和金屬味，果汁味淡，這與本研究中發(fā)現(xiàn)的果皮中葡萄糖含量降低，果肉中檸檬苦素含量升高也能相互對(duì)應(yīng)。康聰[22]等研究發(fā)現(xiàn)黃龍病菌會(huì)影響砂糖橘的氨基酸的代謝，這與我們發(fā)現(xiàn)患病果肉中的氨基酸升高一致。植物中的類黃酮糖苷類主要存在的方式有以C-C鍵直接連接于類黃酮糖苷配基上或者以O(shè)-linked的方式連接于類黃酮糖苷配基的羥基上[23]，柑橘中以黃烷酮-O-糖苷類、黃酮-O-糖苷類和黃酮-C-糖苷類含量最為豐富[24]，而通過本實(shí)驗(yàn)可以得到的剃刀草素-3-O-蕓香苷、蘆丁、木犀草素-7-蕓香苷、香葉木素-7-O-蕓香糖苷、槲皮素-7-O-蕓香糖苷和柚皮苷在患病后含量增加。其余的差異化合物比如異黃連素、脫落酸、米托里定等在患病臍橙中含量偏少，而蘆丁、8-羥基芥子酸、4-羥基睪酮、對(duì)羥基苯丙胺、苯丙氨酸、6''-O-L-Arabinopyranosylastragalin等則是在患病臍橙中含量更多。

圖6 2種臍橙果肉中差異化合物的含量Fig.6 Contents of differential compounds in pulp of two kinds of navel oranges

圖7 兩種臍橙果皮中差異化合物的含量Fig.7 Contents of differential compounds in peels of two kinds of navel oranges

2.4 差異成分的聚類分析

通過MetaboAnalyst 5.0對(duì)黃龍病臍橙差異成分做聚類分析，計(jì)算差異成分皮爾遜系數(shù)可以繪制出如下熱圖(Heatmap)(圖8，圖9)，熱圖可以有效地對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行控制并展示研究對(duì)象的差異變化情況。從熱圖可以看出，兩種組分的臍橙可以被明顯分開，這與PCA和OPLS-DA的結(jié)果一致。聚類分析顯示，糖苷類化合物比如剃刀草素-3-O-蕓香苷、木犀草素-7-蕓香苷、蘆丁、香葉木素-7-O-蕓香糖苷、槲皮素-7-O-蕓香糖苷和柚皮苷聚為一類，說明他們?cè)诟涕袤w內(nèi)可能具有相關(guān)性，含量變化趨勢相近。此外。脫落酸、異黃連素、葡萄糖和氨基酸聚為一類，同樣說明它們的含量變化趨勢接近，具有相近的生物合成途徑。

圖8 患黃龍病與正常臍橙果皮的差異化合物的熱圖分析Fig.8 Heatmap analysis of differential compounds among peers of huanglongbing and normal navel oranges

圖9 患黃龍病與正常臍橙果肉的差異化合物的熱圖分析Fig.9 Heatmap analysis of differential compounds among pulp of huanglongbing and normal navel oranges

3 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用了UPLC-QTOF-MS對(duì)患黃龍病的臍橙與正常臍橙的非揮發(fā)性成分進(jìn)行了測定。結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件，利用主成分分析結(jié)果和正交偏最小二乘判別分析，篩選出28種差異化合物。其中黃酮糖苷類化合物是區(qū)分兩種臍橙的主要差異代謝物，在植物感染黃龍病后，果實(shí)中的黃酮糖苷類物質(zhì)有富集的效果。聚類熱圖分析與主成分分析一致，將正常臍橙樣品和黃龍病臍橙分開。同時(shí)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)糖苷類化合物和柚皮苷動(dòng)態(tài)變化趨勢一致，脫落酸、異黃連素、葡萄糖和氨基酸動(dòng)態(tài)變化趨勢一致。這些結(jié)果有助于我們了解臍橙患黃龍病后的成分變化，給我們?cè)诜乐位蛘哞b別患病果樹提供了一個(gè)新的思路，同時(shí)也對(duì)患病臍橙果實(shí)的加工處理提供了新的方向。