田晨 劉志輝 孟繁榮 李華 何湘蓉 胡錦興

1廣州醫(yī)科大學(xué)研究生院（廣州 510120）；2廣州市胸科醫(yī)院肺研所（廣州 510120）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）又稱為慢阻肺，是目前全球三大死因之一，長期接觸有害氣體或顆粒導(dǎo)致患者小氣道發(fā)生氣道炎癥、氣道重塑及氣道黏液阻塞是促使COPD 患者逐漸氣流受限的主要因素［1-2］。吸煙導(dǎo)致患者黏液高分泌是致使COPD 黏液阻塞的主要發(fā)病機(jī)制之一，而治療黏液高分泌被認(rèn)為可以改變患者預(yù)后。在COPD 患者中，離子-流體運(yùn)輸及高分泌的病理性黏蛋白MUC5AC 導(dǎo)致黏液高度濃縮、黏液運(yùn)輸失敗，小氣道中的黏液無法被咳嗽清除，形成氣道堵塞，促使氣流受限發(fā)生，但該過程發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不完全清楚［3-5］。本研究基于細(xì)胞水平，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選出香煙煙霧提取物（CSE）刺激人支氣管上皮細(xì)胞后差異表達(dá)基因（DEGs），并通過生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，篩選出可能參與該過程中MUC5AC 上調(diào)的信號通路并加以驗證，以期為COPD 黏液高分泌分子機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支持，并為尋找新的COPD 藥物作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人支氣管上皮細(xì)胞16HBE（廣州呼吸健康研究所的饋贈），紅雙喜牌香煙（廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司），高糖型DMEM 培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），雙抗溶液（Gibco），胰蛋白酶-EDTA（0.25%）（Gibco），總RNA 提取試劑盒（ESscience），High Capacity cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems），SYBR Green Pro Taq HS（AG），WNT 信號通路激活劑CT99021 monohydrochlo ride（Med-ChemExpress），Opti-MEM 培養(yǎng)基（Gibco），Lipofectamin 3000（Thermo Fisher Scientific）。超微量分光光度計（Thermo Scientific），VIIA7 實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 CSE 制備將4 支除去了濾嘴的紅雙喜牌香煙燃燒的煙霧以20 mL/min 速度抽吸入20 毫升PBS 溶液。利用4%NaOH 和10%HCl 溶液將pH 值調(diào)節(jié)至7.4，使用0.22 微米過濾器過濾和除菌，將收集的混合液定義為100%CSE。

1.2.2 細(xì)胞準(zhǔn)備從液氮中取出16HBE 細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇并接種于培養(yǎng)瓶中，以含5%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%時去除培養(yǎng)基，加入消化酶進(jìn)行消化，并按1∶3 的比例傳代。實驗取生長狀態(tài)良好的16HBE 細(xì)胞以5%CSE 刺激24 h。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序

1.2.3.1 提取總RNA 送檢測序收集三次實驗組（5%CSE 刺激16HBE 細(xì)胞24 h）與對照組（PBS 培養(yǎng)16HBE 細(xì)胞24 h）細(xì)提取其總RNA，使用超微量分光光度計檢測總RNA 濃度及質(zhì)量，按送檢要求稀釋后交由北京六合華大基因科技有限公司完成質(zhì)檢并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.3.2 測序結(jié)果質(zhì)控使用DNBSEQ 平臺測序，將測序所得的raw reads 通過SOAPnuke 軟件進(jìn)行質(zhì)控，去除包含接頭、未知堿基N 含量大于5%以及低質(zhì)量的reads（質(zhì)量值低于15 的堿基占該reads 總堿基數(shù)的比例大于20%）以得到Clean reads ，過濾后的Clean Reads 保存為FASTQ 格式，使用HISAT軟件將Clean reads 比對到參考序列并得到各基因的表達(dá)量，以FPKM 標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量，參考序列來自NCBI 的Homo_sapiens（GCF_000001405.39_ GRCh38.p13）。比對后通過統(tǒng)計比對率等，進(jìn)行第二次質(zhì)控。

1.2.3.3 篩選差異基因進(jìn)行分析將CSE 組與對照組基因差異表達(dá)倍數(shù)（FC）取以2 為底的對數(shù)值，定義log2（FC）＞1，校正后Q 值＜0.05 的基因為DEG，使用Dr.Tom 軟件進(jìn)行基因定量分析、以篩選出差異表達(dá)基因（DEG），對DEG 進(jìn)行聚類熱圖及火山圖分析總覽DEG分布情況、差異大小及差異顯著性等信息；對DEG 進(jìn)行GO 功能注釋、KEGG pathway 功能注釋，根據(jù)注釋結(jié)果篩選出信號傳導(dǎo)相關(guān)的DEG 進(jìn)行GO_Biological Process 及KEGG pathway富集分析，尋找可能與CSE誘導(dǎo)的MUC5AC上調(diào)相關(guān)的信號通路。將可能相關(guān)的信號通路DEGs 進(jìn)行KDA 分析，篩選出KDA 基因及初始基因進(jìn)行驗證。

1.2.4 激活經(jīng)典WNT 信號通路分組及處理措施為：激動劑+CSE 組給與經(jīng)典WNT 信號通路激活劑及5%CSE 刺激；激動劑組給予經(jīng)典WNT 信號通路激活劑；CSE 組給予5%CSE 刺激；對照組給予PBS 緩沖液。

1.2.5 siRNA 干擾WNT 基因

1.2.5.1 實驗分組實驗分為6個組：siRNA+CSE組（分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT4/WNT5B/WNT6/WNT9A/WNT10A siRNA，均給予5%CSE 刺激）；siRNA 組（分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT4/WNT5B/WNT6/WNT9A/WNT10A siRNA）；陰性對照+CSE 組（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，給予5%CSE刺激）；陰性對照組（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，給與PBS 緩沖液）；CSE 組（給予5%CSE 刺激）；空白對照組（給予PBS 緩沖液）。

1.2.5.2 siRNA 轉(zhuǎn)染與CSE 刺激按每孔7.5 μL Lipofectamin 3000、75 pmol siRNA（由吉薩基因合成）及2×125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基比例混合轉(zhuǎn)染試劑，先分別以O(shè)pti-MEM 培養(yǎng)基稀釋Lipofectamin 3000 試劑及siRNA 試劑，然后將稀釋好的siRNA試劑緩慢滴加入稀釋好的Lipofectamin 3000 試劑中，將混合好的轉(zhuǎn)染試劑按實驗分組加入去除雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)基，按實驗分組給予細(xì)胞5%CSE刺激24 h，WNT5B siRNA序列正義鏈：3'-CCAAGACUGGCAUCAAGGAAUTT-5'，反義鏈：3'-AUUCCUUGAUGCCAGUCUUGGTT-5'。

1.2.6 RT-qPCR 法檢測MUC5AC 及WNT 基因轉(zhuǎn)錄水平使用離心柱法提取細(xì)胞總RNA，稀釋至20 ng/μL 后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qPCR 實驗，反應(yīng)引物如表1（由北京六合華大基因科技有限公司合成），反應(yīng)體系：2 ×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，引物各1 μL，ROX reference Dye（20 μmol/L）0.04 μL，cDNA 模板5 μL，ddH2O 3 μL，總體系為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃高溫變性5 s，58 ℃退火延伸30 s，高溫變性及退火延伸40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT算法計算并分析結(jié)果。

表1 引物列表Tab.1 Primers

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用Graphpad prism9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組數(shù)據(jù)至少來自3 次獨(dú)立重復(fù)實驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。兩組相關(guān)樣本使用配對樣本t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

2.1.1 送檢RNA 及測序數(shù)據(jù)質(zhì)檢結(jié)果送檢總RNA 樣本完整性較高（RIN 均＞9，28S/18S 均＞2）且足量，達(dá)到建庫標(biāo)準(zhǔn)。過濾后Quality ＞20的Clean reads 比率均＞97%，對比成功的Clean Reads 比例均大于93%。

2.1.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果本次測序共檢測出17 097個基因，其中429 個僅在Control 組表達(dá)，1 259 個僅在CSE 組表達(dá)（圖1），使用Dr.Tom 軟件共篩選出2 567 個差異基因（DEGs），其中上調(diào)基因1 027 個，下調(diào)基因1 540 個，DEGs 表達(dá)量聚類熱圖示生物學(xué)重復(fù)實驗組間相似度較高，對照組與實驗組有顯著差異，差異基因火山圖示差異基因表達(dá)倍數(shù)及差異程度（圖2）。

圖1 各組基因表達(dá)數(shù)量韋恩圖Fig.1 The Wayne Chart of gene expression of each group

圖2 差異基因表達(dá)Fig.2 The expression of differential gene

2.1.3 GO、KEGG pathway 功能注釋注釋結(jié)果如圖3、4，注釋到信號通路相關(guān)的DEGs 共有1 000 個。

圖3 KEGG Pathway 分類注釋柱狀圖Fig.3 The analysis of KEGG pathway term

2.1.4 GO_BP 及KEGG Pathway 富集分析富集結(jié)果顯示信號傳導(dǎo)相關(guān)DEGs 主要富集到以下信號通路中，見圖5。

圖5 GO-BP 及KEGG pathway 富集分析Fig.5 GO-BP and KEGG pathway enrich ment analysis

2.1.5 WNT 信號通路相關(guān)DEGs 進(jìn)行差異分析數(shù)據(jù)顯示富集到WNT 信號通路的相關(guān)DEGs 共57 個，其中23 個基因上調(diào)（表2），34 個基因下調(diào)（表3）；KDA 分析結(jié)果顯示10 個KDA 基因及22個初始基因，KDA 基因中的WNT 基因包括上調(diào)基因WNT9A，下調(diào)基因WNT4、WNT5B、WNT10A，初始基因中的WNT 基因包括下調(diào)基因WNT6（圖6）。

表3 下調(diào)的WNT 信號通路富集基因Tab.3 The down-regulated enrichment gene in WNT signalling pathway

圖6 KDA 分析Fig.6 KDA analysis

表2 上調(diào)的WNT 信號通路富集基因Tab.2 The up-regulated enrichment gene in WNT signalling pathway

2.2 CSE刺激16HBE后WNT基因轉(zhuǎn)錄水平CSE組較對照組WNT4、WNT5B、WNT6、WNT10A 轉(zhuǎn)錄水平均下調(diào)，CSE 組WNT9A 轉(zhuǎn)錄水平較對照組上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。此結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致（圖7）。

圖7 WNT 基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.7 Transcription level of WNT gene

2.3 激活Wnt/β-Catenin 信號通路對16HBE 細(xì)胞MUC5AC 轉(zhuǎn)錄水平的影響在不給予CSE 刺激的情況下，WNT 信號通路激活組MUC5AC mRNA相對于對照組明顯上調(diào)，而在給予香煙煙霧刺激的情況下，激活經(jīng)典WNT 信號通路較不激活MUC5AC mRNA，無顯著變化趨勢（圖8）。

圖8 MUC5AC 轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.8 Changes of transcription level of MUC5AC

2.4 敲低WNT基因?qū)?6HBE細(xì)胞MUC5AC轉(zhuǎn)錄水平影響敲低WNT4、WNT6、WNT9A、WNT10A基因前后對MUC5AC 轉(zhuǎn)錄水平的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。敲低WNT5B 基因能顯著提升16HBE 細(xì)胞MUC5AC 轉(zhuǎn)錄水平（圖9）。

圖9 MUC5AC 轉(zhuǎn)錄水平相對表達(dá)量Fig.9 Relative expression of MUC5AC transcript level

3 討論

一直以來，吸煙都被認(rèn)為與慢性阻塞性肺病黏液高分泌有關(guān)，但其機(jī)制尚不清楚。為探索參與該機(jī)制的信號通路及相關(guān)基因，本研究通過以CSE 刺激16HBE 細(xì)胞，選取使MUC5AC 轉(zhuǎn)錄水平最大程度上調(diào)的刺激條件（5%CSE，24 h）來培養(yǎng)16HBE 細(xì)胞，并提取總mRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CSE 主要引起16HBE 細(xì)胞血管生成及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK 信號通路、WNT信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子β 受體負(fù)調(diào)控相關(guān)信號通路、PI3K-Akt 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、AMPK 信號通路、Rap1 信號通路等信號通路表達(dá)異常。其中TGF-β3（轉(zhuǎn)化生長因子β3）已被證明通過調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞自噬途徑促進(jìn)MUC5AC高表達(dá)［6］。PI3K/AKT 信號通路被證明參與直腸癌黏蛋白MUC2 的過度分泌［7］。AREG（雙調(diào)蛋白）能通過激活HBECs 中EGFR-PI3Kα-AKT/ERK 通路來增強(qiáng)PM（顆粒物質(zhì)）誘導(dǎo)的炎癥和黏液高分泌［8］。在LPS 誘導(dǎo)的哮喘模型中，激活A(yù)MPK/SOCS1 能抑制MUC5AC 的表達(dá)［9］，Rap1 可以成為非經(jīng)典WNT信號通路下游信號［10］，但它是否與MUC5AC 分泌相關(guān)目前鮮有報道。MAPK 級聯(lián)反應(yīng)及表皮生長因子受體（EGFR）基因的異常表達(dá)被大量實驗證明在香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌當(dāng)中發(fā)揮重要作用，EGFR 及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）分別能通過激活氣道上皮細(xì)胞中的MAPK 級聯(lián)反應(yīng)及NFκB 信號通路從而在MUC5AC 基因表達(dá)和產(chǎn)生中起到關(guān)鍵作用［11-14］。然而針對以上靶點(diǎn)所開發(fā)黏液分泌抑制藥物由于藥物副作用、易耐藥性等原因終止了臨床實驗［15］。進(jìn)一步探索COPD 黏液高分泌分子機(jī)制，并尋找新的藥物作用靶點(diǎn)仍是所需努力的方向。

圖4 GO 分類注釋柱狀圖Fig.4 The analysis of GO term

本研究觀察到兩種富集均提示了WNT 信號通路，且其已在慢性呼吸道疾病中得到廣泛研究［16-18］。有研究表明多種WNT 及WNT 靶基因在健康吸煙者和患有COPD 的吸煙者中下調(diào)［19］，經(jīng)典WNT 信號通路激動劑氯化鋰可減輕實驗性肺氣腫［20］。而FMCA 等［21］卻報道了相反的結(jié)果，他們的研究表明，與非吸煙者和吸煙對照組相比，COPD 患者WNT/β-Catenin 途徑在氣道上皮中上調(diào)。非經(jīng)典信號通路中的WNT-5A 也被證明在COPD 患者中表達(dá)上調(diào)，且WNT-5A 干擾了經(jīng)典信號通路介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞修復(fù)［22］，總之無論是經(jīng)典或非經(jīng)典WNT 信號通路均被證實在COPD 中存在異常表達(dá)，但其差異趨勢及其在COPD 中的作用機(jī)制存在爭議。

盡管WNT 信號通路在COPD 中被廣泛研究，但其是否參與COPD 中黏液高分泌的發(fā)生鮮有文獻(xiàn)報道。LIU 等曾報道敲低內(nèi)源性經(jīng)典WNT 信號通路效應(yīng)蛋白β-catenin 能顯著下調(diào)高滲引起的16HBE 細(xì)胞MUC5AC 蛋白的表達(dá)水平［23］。而ZHANG 等的實驗表明在小鼠哮喘模型中，對Wnt信號通路負(fù)向調(diào)節(jié)因子進(jìn)行抑制可明顯上調(diào)MUC5AC 的表達(dá)水平［24］，這些實驗提示W(wǎng)NT 信號通路參與調(diào)節(jié)MUC5AC 的表達(dá)，由此推測WNT 信號通路可能也參與COPD 中氣道黏液高分泌的發(fā)生過程。于是將轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中WNT 信號通路相關(guān)差異基因進(jìn)行KDA 分析，結(jié)果提示表達(dá)下調(diào)的非經(jīng)典WNT4、WNT5B 基因、表達(dá)下調(diào)的經(jīng)典WNT6、WNT10A及上調(diào)的經(jīng)典WNT9A 為KDA基因或初始基因。隨后使用RT-qPCR 實驗驗證了這些基因的測序結(jié)果并進(jìn)一步使用經(jīng)典WNT信號通路激動劑及siRNA 干擾技術(shù)來驗證該通路及相關(guān)基因是否參與16HBE細(xì)胞MUC5AC的上調(diào)，結(jié)果顯示在無CSE刺激時，激動WNT信號通路能明顯上調(diào)MUC5AC 轉(zhuǎn)錄水平［（3.197±0.509 4）vs.（1±0），P= 0.031 3］，而在給予CSE 刺激時，這種上調(diào)消

失。這可能是源于CSE 降低了16HBE 細(xì)胞對WNT激動劑的敏感性。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在敲低WNT5B基因后，WNT5B siRNA 組+CSE 組MUC5AC mRNA較陰性對照+CSE 組上調(diào)2.092 倍［（9.066±3.442）vs.（4.333±1.121），P=0.016 2］，這表明非經(jīng)典信號通路中的WNT5B 參與CSE 誘導(dǎo)的16HBE 細(xì)胞MUC5AC 的上調(diào)。但HELINE 等及其前期的研究證明CSE 上調(diào)COPD 患者的原代細(xì)胞的WNT5B 蛋白及16HBE 細(xì)胞WNT5B 轉(zhuǎn)錄水平［25］。該研究結(jié)果與本研究相反，這種差異可能源自于使用了不同的實驗細(xì)胞，及不同的CSE 刺激條件，觀察到Eline 在實驗中使用的CSE 刺激條件為5%CSE 刺激16HBE 僅6 h。另外，筆者觀察到轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果中提示RAP1 信號通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著異常，推測WNT5B 可能通過非經(jīng)典的WNT/RAP1 信號通路發(fā)生作用，進(jìn)一步驗證有助于明確具體的非經(jīng)典WNT 信號通路。

本研究證明了非經(jīng)典WNT信號通路的WNT5B參與人支氣管上皮細(xì)胞中MUC5AC 的調(diào)節(jié)，為COPD 黏液高分泌分子機(jī)制研究提供了新的數(shù)據(jù)支持，并為尋找新的COPD 藥物作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。