陸小琴 雷嬌嬌 劉雨欣 趙華清

急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)主要由骨髓和外周血中的T淋巴細胞異常增生所致[1]，好發(fā)于兒童，病情進展迅速，發(fā)病率有逐漸升高的趨勢[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200 bp的RNA，參與機體細胞正常生理過程及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。lncRNA-X失活特異性轉錄本(lncRNA-XIST)在喉鱗狀細胞癌、骨肉瘤和膠質母細胞瘤等疾病中促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]，但lncRNA-XIST在T-ALL中作用的研究鮮有報道。

miR-375是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，在腫瘤的侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用，表達水平與癌癥患者生存率相關[4]。Notch信號激活與腫瘤有密切的聯(lián)系，Notch配體-受體結合或Notch基因突變可激活Notch信號[5]。Notch1與T-ALL的發(fā)生發(fā)展有關，通過調控Notch1的表達能夠影響腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[6]。生物信息分析顯示miR-375是lncRNA-XIST的潛在靶點，miR-375與Notch1可能存在結合位點。基于此，我們推測lncRNA-XIST可能通過miR-375-Notch1軸調控T-ALL細胞增殖與侵襲。因此，本研究探討lncRNA XIST通過miR-375-Notch1軸調控對T-ALL細胞增殖、侵襲的作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選擇2018年6月—2021年3月于重慶大學附屬三峽醫(yī)院確診的T-ALL患者57例為觀察對象(T-ALL組)，其中男35例，女22例，年齡8～35歲，平均(23.32±7.36)歲，患者均依據世界衛(wèi)生組織修訂的急性淋巴細胞白血病的分類和診斷標準進行診斷[7]。另選55例健康體檢者為對照組，其中男34例，女21例，年齡9～34歲，平均(23.83±6.97)歲。納入標準：(1)近3個月無感染；(2)近1個月無出血；(3)近1個月未服用免疫抑制劑。兩組性別和年齡等一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)學倫理委員會同意(倫理編號：LL-2022-02)，所有納入對象入組后，均詳細告知實驗目的、研究性質，并自愿簽署知情同意書。

1.2 試劑和材料

人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞細胞株(CCRF-CEM)(美國ATCC細胞庫)；淋巴細胞分離液(美國GE公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；si-lncRNA XIST及其各自的陰性對照(GenePharma，中國上海)；TRIzol(美國Invitrogen公司)；M-MLV逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)；miR-375、Notch1擴增引物(上海生工)；miR-375 mimic和miR-NC(廣州銳博生物公司)，Lipo8000轉染試劑(碧云天)；β-action單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(碧云天生物科技有限公司)；Notch1、Hes1、ADAMl7多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染

CCRF-CEM細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2飽和濕度。以CCRF-CEM細胞為對照(Control組)，在CCRF-CEM細胞中轉染si-lncRNA XIST(si-lncRNA XIST組)、si-NC(si-NC組)，及miR-375 mimic(miR-375組)和miR-NC(miR-NC組)。具體方法如下：Lipo8000轉染試劑(5 μL)與載體DNA混勻(5 μL)，室溫放置15 min，然后加至處于對數生長期的細胞，培養(yǎng)8 h后更換含血清的完全培養(yǎng)液，48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 逆轉錄和定量實時PCR

取T-ALL組和對照組的外周靜脈血3～5 mL，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，TRIzol法提取總RNA；收集CCRF-CEM細胞，TRIzol法提取總RNA。檢測RNA濃度，逆轉錄cDNA，-20℃保存待測。實時定量PCR反應體系：2.5 μL引物，2.5 μL的cDNA，12.5 μL的qPCRmix(含熒光染料)，dd水補足至25 μL；XIST PCR反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)；miR-375 PCR反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；Notch1 PCR反應條件：94℃ 4 min，94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)。GAPDH和U6作為參考基因，以2-△△Ct計算相對含量。引物設計見表1。T-ALL組和對照組均完成PCR檢測，細胞株進行三次獨立重復實驗。

表1 各基因引物序列

1.5 免疫印跡

收集T-ALL組和對照組外周血，淋巴細胞分離液分離單個核細胞；收集完成轉染等處理的CCRF-CEM細胞。RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，分離、轉膜，5%脫脂乳封閉3 h，添加兔抗人ADAM-17、Notch1、Hes1及β-action一抗(1∶1 000)，在4℃孵育過夜。TBST沖洗3次，添加HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育2 h。使用PierceTMECL顯影，分析條帶灰度值。進行三次獨立重復實驗。

1.6 細胞增殖

分別收集轉染并培養(yǎng)0、24、48、72和96 h的CCRF-CEM細胞，以每孔2×103個細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板上。每孔添加10 μL CCK-8溶液，37℃孵育2 h。使用酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度OD值。進行三次獨立重復實驗。

1.7 侵襲實驗

分別收集轉染并培養(yǎng)24 h的CCRF-CEM細胞，將完全培養(yǎng)液與基質膠按照1∶9比例配制混合液，以100 μL/孔加入Transwell小室內，每個小室接種5×104個細胞，下室用500 μL培養(yǎng)基(含10%FBS)做誘導趨化因子，置于37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。4 h后取出，棉簽擦拭小室內膜，甲醛固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS沖洗3次，拍照，用顯微鏡計數3個視野的細胞數目。進行三次獨立重復實驗。

1.8 細胞凋亡

收集細胞，制備成每1 mL含106個細胞的細胞懸液，加入細胞培養(yǎng)液1 mL，1 000×g離心10 min，棄去上清，依次加入Binding Buffer 400 μL、Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。進行三次獨立重復實驗。

1.9 熒光素酶試驗

擴增XIST野生型(WT)或突變型(MUT)片段、Notch1 mRNA 3′UTR和突變3′UTR片段，連接到熒光素酶載體對照載體的下游[8]。將lncRNA XIST-WT、lncRNA XIST-MUT與miR-NC(XIST-WT+miR-NC組，XIST-MUT+miR-NC組)或miR-375(XIST-WT+miR-375組，XIST-MUT+miR-375組)共轉染至CCRF-CEM細胞中。轉染后48 h收集細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。進行三次獨立重復實驗。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 lncRNA XIST、miR-375、Notch1 mRNA和Notch1蛋白的表達

T-ALL組患者外周血單核細胞及CCRF-CEM細胞株中l(wèi)ncRNA XIST、Notch1 mRNA水平明顯高于對照組，miR-375水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。T-ALL組患者外周血單個核細胞Notch1蛋白高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖1)。

圖1 lncRNA XIST、miR-375、Notch1 mRNA和Notch1蛋白的表達

2.2 轉染si-lncRNA XIST后CCRF-CEM細胞生物學活性變化

對CCRF-CEM細胞轉染si-lncRNA XIST以沉默lncRNA XIST。與對照組比較，轉染si-lncRNA XIST后細胞增殖率及細胞侵襲數量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，細胞凋亡數量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖2)。

圖2 轉染si-lncRNA XIST對CCRF-CEM細胞增殖、凋亡和侵襲影響

2.3 miR-375的靶標分析

將lncRNA XIST-WT、lncRNA XIST-MUT與miR-NC或miR-375共轉染至CCRF-CEM細胞中。結果顯示，lncRNA XIST-WT+miR-375的熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖3)。表明miR-375是lncRNA XIST靶標。

圖3 熒光素酶報告實驗

2.4 過表達miR-375對CCRF-CEM細胞的增殖、凋亡及侵襲的影響

對CCRF-CEM細胞轉染miR-375 mimic以上調細胞miR-375(圖4A)。細胞增殖實驗結果顯示在轉染miR-375后48、72及96 h三個時間點的OD值低于對照組和miR-NC組(圖4A)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；轉染miR-375后細胞凋亡率高于對照組和miR-NC組(圖4B)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；轉染miR-375后細胞穿過Transwell小室細胞的平均個數較對照組和miR-NC組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖4C)。

圖4 轉染miR-375 mimic對CCRF-CEM細胞增殖、凋亡和侵襲影響

2.5 lncRNA XIST對miR-375、Notch1表達的調控

通過轉染si-lncRNA XIST以沉默lncRNA XIST，分析lncRNA XIST對下游miR-375、Notch1的調控作用。轉染si-lncRNA XIST后，miR-375升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而Notch1 mRNA水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5A)。此外，沉默lncRNA XIST后Notch1、ADAM-17及Hes1蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5B)。

圖5 沉默lncRNA XIST對miR-375、Notch1表達的影響

3 討論

lncRNA XIST是一種致癌lncRNA，在骨肉瘤、甲狀腺癌、食管癌等惡性腫瘤中高表達[9-11]，通過對多種腫瘤的細胞增殖、細胞周期、細胞侵襲的影響，起到促癌作用，但在T-ALL患者中表達是否異常，目前尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)T-ALL患者lncRNA XIST較健康對照人群顯著升高，并且T-ALL細胞株CCRF-CEMC細胞的lncRNA XIST水平也顯著升高，提示高水平lncRNA XIST可能在T-ALL發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過沉默RNA(si RNA)沉默lncRNA XIST，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞增殖能力、侵襲能力明顯下降，而細胞凋亡明顯增加，表明lncRNA XIST參與T-ALL發(fā)病，起促癌作用。

lncRNA通常不直接作用于靶基因，而是通過另一種非編碼RNA(miRNA)靶向調控終端蛋白表達發(fā)揮功能。miR-375是lncRNA XIST下游靶點之一，通過miR-375可調控Wnt1、p53、TET1等信號通路，影響腫瘤細胞生長、侵襲和轉移[12-13]。本研究結果顯示，在T-ALL患者和T-ALL細胞株CCRF-CEMC中miR-375水平均顯著下降，與lncRNA XIST表達趨勢相反。為了證實在T-ALL中miR-375是否是lncRNA XIST的作用靶點，我們首先通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST與miR-375存在結合位點，進而通過熒光素酶報告實驗證實miR-375是lncRNA XIST下游靶點。進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉染miR-375模擬物上調腫瘤細胞miR-375水平后，腫瘤細胞增殖能力、侵襲能力明顯下降，細胞凋亡明顯增加。表明lncRNA XIST通過抑制miR-375參與T-ALL發(fā)生進展。

Notch1信號通路在T-ALL的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[14]。Notch1的異常與T細胞前體的分化與發(fā)展關系密切，Notch1是miR-375下游的調控靶點，該信號軸在口腔鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中得到證實[15]。本研究結果顯示，Notch1的mRNA、蛋白水平在T-ALL患者中都明顯升高，與Mansur等[16]的研究結果相符。在沉默lncRNA XIST后，miR-375水平明顯增加，而Notch1的mRNA和蛋白水平明顯下降，此外Notch1軸相關蛋白ADAM-17、Hes1水平也明顯下降，表明lncRNA XIST對下游miR-375、Notch1具有調控作用：lncRNA XIST可能通過下調miR-375水平以增加Notch1表達，從而促進T-ALL腫瘤細胞的生物學活性，導致T-ALL發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST調控miR-375-Notch1信號軸，在T-ALL細胞增殖、侵襲和凋亡等細胞生物學行為中發(fā)揮重要作用，為探索T-ALL潛在治療靶點提供了新思路。但是本研究存在樣本量小的不足，同時，lncRNA調控通路復雜，其可能存在有多個靶向miRNA。因此，后續(xù)研究中我們將進一步擴大樣本量，并驗證lncRNA XIST更多的調控途徑。