朱開彬 賀長軍 陳瀾濤 孔祥龍 趙蘇 徐世東

肺癌是全球癌癥死亡的首要原因，嚴重威脅人類的生命健康。肺癌的防治很大程度上依賴于對腫瘤增殖和侵襲的分子機制的深入研究，其中腫瘤的血管生成是重要的機制之一[1]。肺癌細胞在血管生成過程中發(fā)揮重要作用，它們不僅分泌蛋白酶突破細胞外基質，而且分泌血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，促進腫瘤內(nèi)部和附近的血管異生[2]。

VEGF家族在血管生成和胚胎發(fā)育中起著至關重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)的VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(Placental growth factor，PLGF)[3]。PLGF作為VEGF家族成員對其促進血管生成和腫瘤增殖作用的研究報道較多，但在腫瘤免疫微環(huán)境方面的研究卻較少。血管內(nèi)皮生長因子受體(Flt-1和VEGFR1)是PLGF特異性的受體[4]，主要表達于內(nèi)皮細胞和單核/巨噬細胞的表面，提示PLGF在腫瘤免疫微環(huán)境中也發(fā)揮重要作用。

巨噬細胞(MΦ)常被認為是吞噬和消化體內(nèi)廢棄物、壞死細胞及外來物質的白細胞。然而，近年來不同功能的巨噬細胞亞型相繼被發(fā)現(xiàn)，目前可將巨噬細胞分為2個亞型，包括經(jīng)典表型(M1巨噬細胞)和極化表型(M2巨噬細胞)。M2型巨噬細胞可參與調節(jié)體液免疫和促進組織修復[5]。此外，腫瘤形成區(qū)的某些巨噬細胞具有M2型的特征能促進腫瘤增殖，因此稱為腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAM)[6]。最近的一項研究表明，M2型巨噬細胞可被招募到受傷的胰腺，并產(chǎn)生和分泌高水平的轉化生長因子β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)[7]，促進組織修復，也能促進腫瘤的生長。另有研究表明PLGF對腫瘤細胞和巨噬細胞之間的相互作用也非常重要[8-9]。

本文研究非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)細胞分泌PLGF促進巨噬細胞向TAM極化、以及TAM促進腫瘤生長和血管異生的具體機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、細胞培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購自美國的Invitrogen公司；TGF-β1抑制劑SB431542購自美國的Abcam公司；重組的PLGF、熒光素、膠原酶、胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；可溶性Flt-1(sFlt-1)購自美國R&D Biosystem公司；pAAV-CMV-LUC-2A-RFP載體購自美國Clontech公司；質粒購自美國Applied Viromics公司；CD31、F4/80和CD163抗體購自美國Becton Dickinson Biosciences公司；β-actin、iNOS、和TGF-β1購自德國的Qiagen公司；NSCLC細胞系(A549細胞)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC細胞)購自美國菌種保存中心(ATCC)；NOD/SCID小鼠、C57BL/6小鼠購自上海SLAC實驗動物有限公司。

1.2 NSCLC細胞培養(yǎng)

A549細胞用含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素與100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染

使用含CMV啟動子并攜帶熒光素酶和RFP報告質粒的腺病毒質粒轉染A549細胞。采用流式細胞熒光技術檢測轉染效率。

1.4 建立小鼠肺癌模型及體內(nèi)成像

采用尾靜脈注射法將轉染腺病毒(1×108PFU/mL，100 μL)的A549細胞注入10周齡的雄性NOD/SCID小鼠體內(nèi)，構建小鼠肺癌模型。種植后8周，使用美國Xenogen公司的IVIS成像系統(tǒng)進行動物體內(nèi)瘤體成像，使用Living Image軟件進行圖像分析和生物發(fā)光定量，確認模型構建成功。

1.5 流式細胞技術收集免疫細胞

收集小鼠體內(nèi)的瘤體切成小塊，用40 mg/dL膠原酶和0.05%胰蛋白酶的消化液消化，制成單細胞懸液。流式細胞技術檢測呈紅色熒光的細胞(RFP+細胞)為瘤體內(nèi)轉染腺病毒的A549腫瘤細胞，不顯紅色熒光的細胞(RFP-細胞)為瘤體內(nèi)的非腫瘤細胞，如浸潤的炎癥細胞。

加入2 mL紅細胞裂解液，經(jīng)多次離心沉淀獲取瘤體內(nèi)的免疫細胞。調配細胞濃度至5×106/mL，取100 μL細胞懸液用于熒光染色，分別加入內(nèi)皮細胞標記物CD31、巨噬細胞標記物F4/80和TAM相關標記物CD163熒光標記的抗體。4℃避光孵育30 min，450 g離心5 min，用含2% BSA的PBS清洗兩次，將細胞重懸于100 μL的PBS中，采用BD FACS Melody TM系統(tǒng)分析各細胞表面分子的表達情況。

1.6 骨髓源性巨噬細胞的分離

取12周齡雄性C57BL/6小鼠的腿骨骨髓，用巨噬細胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、10% L929條件培養(yǎng)基、2% MEM非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、1% HEPES、1%青霉素-鏈霉素混合溶液和0.1% 2-巰基乙醇的高糖DMEM)沖洗。收集的骨髓在4℃下1 200 rpm離心5 min。將細胞沉淀重新懸浮以1×106/孔的濃度接種在24孔板中，并在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 Transwell共培養(yǎng)

將分離的1×105個骨髓源性巨噬細胞與等量的A549細胞在Transwell小室中共同培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)條件不同，分為單純A549組，單純MΦ組，A549+MΦ組，A549+MΦ+sFlt-1組(加入10 μg/L sFlt-1)，PLGF+MΦ組(加入100 ng PLGF)，PLGF+MΦ+sFlt-1組(加入100 ng PLGF和10 μg/L sFlt-1)，SB431542+MΦ組(加入10 μmol/L SB431542)和A549+MΦ+SB431542組(加入10 μmol/L SB431542)。流式細胞儀檢測CD163巨噬細胞亞型。共培養(yǎng)的培養(yǎng)基作為HUVEC細胞的條件培養(yǎng)基(Conditioned media，CM)。

1.8 MTT法

取共培養(yǎng)2天后的A549細胞，按照每孔3 000個細胞接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。連續(xù)5天每孔中加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入100 μL的DMSO震蕩10 min，酶標儀490 nm處測量OD值。

1.9 RT-qPCR檢測TGF-β1 mRNA表達

利用Genrunner及參考文獻設計引物，上游引物序列：5′-TTGACTTCCGCAAGGA CCTCGG-3′，下游引物序列：5′-GCGCC CG GGTTATGCTGCTGGT-3。采用TaKaRa生產(chǎn)的SYBR試劑盒，羅氏定量PCR儀進行擴增。分析方法：根據(jù)循環(huán)數(shù)Ct值，采用2-△△Ct法分析TGF-β1 mRNA表達情況。PLGF和Flt-1 mRNA檢測如上方法。

1.10 HUVEC細胞膠原凝膠測定法

在6孔組織培養(yǎng)板上涂覆1.5 mg/mL鼠尾膠原和3 μg/mL纖維連接蛋白，然后在每個膠原涂層孔中接種1×105個HUVEC細胞并使其附著1 h。將第二層膠原層添加到孔中并使其聚合。然后用共培養(yǎng)后的CM培養(yǎng)HUVEC細胞。根據(jù)培養(yǎng)條件不同，分為對照組(Control media，CTL)、CM組、CM+SB431542組、TGF-β1組和TGF-β1+SB431542組。5天后，用NIH-ImageJ軟件拍攝并分析圖像。

1.11 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 8.1軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有實驗均重復三次。兩組間比較采用t檢驗，三組及以上比較使用方差分析，采用Tukey檢驗進行兩兩比較，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠NSCLC模型的建立

首先制備含CMV啟動子并攜帶熒光素酶和RFP報告基因的AAV(圖1A)。用AAV轉染A549細胞系?；赗FP表達，通過流式細胞技術檢測A549細胞的轉染效率為63.7±5.3%(圖1B)。純化的轉染細胞在培養(yǎng)基中呈紅色熒光(圖1C)。將轉染的A549細胞通過尾靜脈注射到NOD/SCID小鼠體內(nèi)建立肺癌模型。生物發(fā)光法檢測小鼠體內(nèi)的瘤體(圖1D)。

圖1 小鼠非小細胞肺癌模型的建立

2.2 PLGF和Flt-1在小鼠瘤體內(nèi)的表達情況

流式細胞技術檢測發(fā)現(xiàn)65.5±6.3%的小鼠瘤體內(nèi)為呈紅色熒光的轉染腺病毒的A549腫瘤細胞(RFP+細胞)(圖2A)，RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)PLGF在RFP+細胞中的表達顯著高于不顯紅色熒光的非腫瘤細胞(RFP-細胞)(31.72±4.69vs.2.31±0.46，t=14.237，P<0.001)(圖2B)。而Flt-1主要由RFP-非腫瘤細胞表達(圖2C)。F4/80+和CD31+在高表達Flt-1的RFP-非腫瘤細胞中的表達比分別為72.4±5.6%和21.8±3.4%(圖2C-D)。利用CD163+進一步檢測高表達F4/80和Flt-1的RFP-非腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)CD163+細胞(即TAM或M2表型)在高表達F4/80和Flt-1的RFP-細胞中占75.2±6.8%，顯著高于CD163-細胞(20.1±2.5%，t=29.001，P<0.001)(圖2C，E)，提示NSCLC高表達PLGF，而TAM高表達Flt-1。

圖2 PLGF和Flt-1在小鼠瘤體內(nèi)的表達情況

2.3 NSCLC細胞與巨噬細胞的相互作用

使用Transwell系統(tǒng)在不同條件下共培養(yǎng)A549細胞和骨髓來源的巨噬細胞(圖3A)。MTT結果顯示，A549+MΦ組A549細胞增殖能力顯著強于單純A549組和A549+MΦ+sFlt-1組(OD值：3.62±0.23vs.4.53±0.34vs.3.71±0.37，P<0.05)(圖3B)，提示sFlt-1可抑制巨噬細胞對A549細胞的增殖促進作用。流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，A549+MΦ組中CD163+的巨噬細胞比例明顯高于單純MΦ組和A549+MΦ+sFlt-1組(74.5%vs.2.43%vs.23.8%，P<0.05)(圖3C-D)，提示A549細胞促進巨噬細胞向TAM/M2極化。同樣，PLGF+MΦ組中CD163+的巨噬細胞比例明顯高于單純MΦ組和PLGF+MΦ+sFlt-1組(62.1%vs.2.43%vs.19.6%，P<0.05)(圖3C-D)，提示PLGF也可促進巨噬細胞向TAM/M2極化。

2.4 TGF-β1在TAM活化和NSCLC細胞生長中的作用

RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，CD163+的TAM/M2巨噬細胞中TGF-β1的表達量高于CD163+的M1巨噬細胞(0.99±0.23vs.0.07±0.02，t=10.410，P=0.002)(圖4A)。流式細胞結果顯示，SB431542+MΦ組和單純MΦ組以及A549+MΦ組和A549+MΦ+SB431542兩組間CD163+的巨噬細胞比例均相近(2.43%vs.2.58%，74.5%vs.70.2%，P>0.05)，提示SB431542的存在并不影響巨噬細胞的極化(圖4B-D)。同樣，M1標記物iNOS的表達也呈現(xiàn)相似的結果(圖4E)，提示TGF-β1在巨噬細胞極化過程中無重要作用。但A549+MΦ組中A549細胞生長能力強于A549+MΦ+SB431542組(OD值：4.71±0.63vs.3.27±0.57，t=6.795，P=0.028)(圖4F)，提示TGF-β1可促進NSCLC細胞的增殖。

圖4 TGF-β1在TAM活化和NSCLC細胞生長中的作用

2.5 極化的TAM對腫瘤血管異生的影響

利用HUVEC細胞膠原凝膠試驗檢測極化后的巨噬細胞是否影響腫瘤血管的異生(圖5A)。結果顯示，CM組和TGF-β1組中HUVEC細胞管狀結構的形成最多(P<0.001)，而CM+SB431542組和TGF-β1+SB431542組中HUVEC細胞管狀結構的形成受抑制(P<0.001)(圖5B-C)，提示極化的TAM可能通過TGF-β1信號通路促進腫瘤血管的異生。

圖5 極化的TAM對腫瘤血管異生的影響

3 討論

闡明NSCLC生長和侵襲的分子機制可以從根本上改善其預后并研發(fā)新的治療方法。既往的研究表明腫瘤相關血管的生成對腫瘤的生長和轉移至關重要，腫瘤細胞可以產(chǎn)生和分泌血管生成因子，如VEGF和PLGF，可以增加腫瘤毛細血管通透性，促進腫瘤內(nèi)皮細胞增殖和存活[10-11]。然而，血管的生成是由腫瘤細胞、炎癥細胞、間充質細胞、內(nèi)皮細胞和其他細胞類型組成的復雜信號網(wǎng)絡所調控，具體的分子機制目前仍不清楚[10，12]。最近研究認為TAM在調節(jié)腫瘤血管生成中發(fā)揮著重要的作用[13-14]。

PLGF主要由NSCLC細胞分泌產(chǎn)生，其特異性受體Flt-1主要分布于內(nèi)皮細胞和瘤體內(nèi)的巨噬細胞表面，PLGF/Flt-1信號通路本身在促進腫瘤血管異生中起到很重要作用[15]。而且在腫瘤瘤體內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量往往高于內(nèi)皮細胞的數(shù)量，腫瘤相關巨噬細胞TAM又能促進血管的生成[9]，因此本研究猜想PLGF/Flt-1信號通路可能也可通過對巨噬細胞的影響促進腫瘤血管的生成。

在Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中，關于A549細胞生長和骨髓來源巨噬細胞極化的結果表明，PLGF/Flt-1信號可調節(jié)巨噬細胞的極化，進而抑制A549細胞的生長。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，加入TGF-β1受體特異性抑制劑SB431542，巨噬細胞極化沒有改變，但A549細胞的生長受到抑制。這些數(shù)據(jù)表明極化的巨噬細胞可能通過TGF-β1信號通路促進NSCLC細胞的生長。最后，在HUVEC細胞膠原凝膠實驗中發(fā)現(xiàn)，加入SB431542后顯著降低巨噬細胞或TGF-β1對血管發(fā)芽的形成，表明TGF-β1信號通路不僅介導TAM對NSCLC細胞生長的影響，還介導TAM對腫瘤血管生成的影響。

最近的一項研究表明，受傷的胰腺可招募M2型巨噬細胞，并產(chǎn)生和分泌高水平的TGF-β1，促進胰島β細胞增殖[7]。另一項研究表明，移植到受傷心臟的間充質干細胞不僅可以招募巨噬細胞促進血管生成和心肌再生，而且還可分泌BMP7對抗巨噬細胞TGF-β1的纖維化作用[16]。這兩項研究都表明M2型巨噬細胞可以分泌TGF-β1，這在本研究中也得到證實。因此，M2型巨噬細胞似乎對細胞生長具有營養(yǎng)作用，可以使受損的組織再生修復，也能促進腫瘤細胞的生長。

Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)在喉癌中PLGF信號通路可調控TAM極化，喉癌細胞分泌的PLGF可誘導巨噬細胞向TAM極化，并產(chǎn)生MMP9。但此研究并未進一步檢測極化的巨噬細胞對腫瘤細胞生長和血管異生的后續(xù)影響。本文解釋了這個問題，并闡述了NSCLC細胞和TAM之間的相互作用。

綜上所述，NSCLC細胞分泌的PLGF可與巨噬細胞表面Flt-1受體結合，誘導巨噬細胞向TAM亞型極化。極化的TAM分泌TGF-β1既促進NSCLC細胞的生長，又促進腫瘤血管的異生。PLGF/Flt-1和TGF-β1信號通路分別介導調控這兩個過程。進一步闡明調控過程的分子機制可以提高我們對肺癌形成的理解，在理論上可以為肺癌的治療以及預后提供一個潛在的治療靶標。