尹一佳 楊瑾廷 申建琪 黃凌依 井巖 官秋玥 韓向龍

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 四川大學華西口腔醫(yī)院正畸科 成都 610041；

2.山西醫(yī)科大學汾陽學院 呂梁 032299；

3.美國德克薩斯州農(nóng)工大學貝勒牙科學院 達拉斯 TX 75246；

4.四川省人民醫(yī)院草堂病區(qū)老年病房 成都 610072

Dickkopf 1（DKK1）在1998年被報道，其定義為誘導頭部形成的關鍵分泌蛋白[1-2]。DKK1是DKK家族成員之一，目前對其的研究最為透徹，它是Wnt/β-catenin通路的天然拮抗劑[3]。當DKK1與細胞膜上低密度脂蛋白受體相關蛋白（low density lipoprotein receptor related protein，LRP）5/6結合將干擾Wnt-LRP5/6-Frizzled復合物的形成，進而阻斷Wnt/β-catenin通路。DKK1可與LRP5/6的β-螺旋1結合阻斷Wnt1信號通路，也可與β-螺旋3結合阻斷Wnt3a信號通路[4]。

Wnt/β-catenin通路調(diào)控細胞關鍵功能，包括細胞生長、分化和死亡。Wnt/β-catenin通路是骨量的主要調(diào)控通路，Wnt信號增強通過以下幾種途徑刺激骨形成，包括促進成骨細胞分化，阻止間充質(zhì)干細胞的成軟骨和成脂向分化；提升成骨細胞生長速度，抑制其凋亡；抑制破骨細胞生成。DKK-1作為Wnt信號通路抑制劑，其阻斷可促進骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的表達[5]。

由于DKK1對Wnt信號通路的調(diào)控作用，它已被證實作用于多種骨疾病，如骨關節(jié)炎、股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松等[6-7]。DKK1主要表達于成骨細胞和骨細胞[8]。DKK1敲除小鼠缺乏大部分顱骨結構，出現(xiàn)肢體畸形和出生時死亡。DKK1單倍不足小鼠能夠存活，表現(xiàn)為骨量增加，骨小梁數(shù)目厚度增加、間隙減少，成骨細胞數(shù)目增多，但破骨細胞數(shù)目無明顯差異[9]。成骨細胞系DKK1過表達小鼠表現(xiàn)為前肢畸形、脫毛和骨質(zhì)缺乏。敲除成熟骨細胞中DKK1的表達，小鼠呈現(xiàn)骨量增加的表型[10]。以上研究表明DKK1是生理性骨量調(diào)節(jié)因子，也是導致病變壞死的促進因子。然而DKK1在股骨和牙槽骨中的表達情況及功能尚未明確[11]。

血管不僅具有循環(huán)運輸功能，還提供血管內(nèi)分泌信號調(diào)控周圍器官生長和穩(wěn)態(tài)。在微環(huán)境中，這些發(fā)揮功能的血管內(nèi)皮細胞具有高度特異性，然而其具體調(diào)控尚未明確[12]。近年來，骨和血管偶聯(lián)是熱門研究方向，血管會影響新骨形成[13]。然而，對骨骼血管的組織分布和精確功能理解也不透徹。因此，研究偶聯(lián)骨形成和血管形成的因子非常重要。雖然DKK-1在內(nèi)皮細胞中表達水平較低[14]，研究發(fā)現(xiàn)DKK1在血管形成中也發(fā)揮作用[15]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，DKK1可以促進血管祖細胞的動員，從而導致局部新生血管增加，可能加速腫瘤的發(fā)展[16]。在動脈粥樣硬化中，DKK1可影響血小板介導的內(nèi)皮細胞的激活和動脈粥樣硬化病變[17]。

然而，DKK1在血管形成中的具體作用仍存在爭議[18]。有研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，人臍靜脈內(nèi)皮細胞分化過程中DKK1表達上調(diào)，DKK-1可增加內(nèi)皮細胞前體細胞成血管活性，沉默DKK1可抑制該細胞成血管能力。另有研究[21]發(fā)現(xiàn)，Tie-2驅(qū)動內(nèi)皮細胞過表達DKK1小鼠有嚴重的血管缺陷，內(nèi)皮細胞敲除DKK1則可造成軟骨缺損。不同的研究結果可能與細胞培養(yǎng)及動物模型不同有關，因此構建更具特異性的內(nèi)皮細胞驅(qū)動的DKK1過表達轉基因小鼠有望闡明DKK1在血管形成中的生物學功能。鈣黏蛋白5（Cadherin 5，Cdh5）為基因表達的鈣依賴性細胞黏附分子。Cdh5特異性在內(nèi)皮細胞和造血細胞中表達，與血管通透和成血管相關，因而Cdh5-Cre小鼠廣泛用于內(nèi)皮細胞相關研究。

本研究擬構建Cdh5驅(qū)動的內(nèi)皮細胞過表達DKK1的轉基因小鼠，檢測DKK1體內(nèi)內(nèi)皮細胞過表達對股骨和牙槽骨骨形成和血管形成的影響。

1 材料和方法

1.1 Cdh5驅(qū)動的內(nèi)皮細胞特異性過表達DKK1轉基因小鼠模型

將Cdh5驅(qū)動的轉基因小鼠（B6.FVB-Tg(Cdh5-Cre)7Mlia/J，簡 稱Cdh5-Cre）和 過 表 達DKK1轉基因小鼠（R26-DKK1）雜交，獲得Cdh5驅(qū)動的內(nèi)皮細胞特異性過表達DKK1轉基因純合子小 鼠（Cdh5-Cre;R26-DKK1/R26-DKK1，簡 稱DKK1 Tg）。DKK1 Tg作為實驗組（n=5），Cdh5-Cre小鼠作為對照組（n=5），8周齡，質(zhì)量（20±5）g，過量麻醉后頸椎脫臼處死收樣。Cdh5-cre與R26-DKK1小鼠由美國德克薩斯州農(nóng)工大學貝勒牙學院馮健全教授饋贈。

1.2 組織準備和組織學分析

將小鼠下頜骨及股骨以甲醛-硫酸鋅溶液（Sigma公司，美國）固定，10%~20%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra acetic acid，EDTA）溶液脫鈣后脫水石蠟包埋。5 μm矢狀面切片后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphate，Trap）染色（Sigma公司，美國）、免疫組織化學染色［DKK1、膠原蛋白collagen（Col）Ⅳ（Abcam公司，英國）］。染色后使用中性樹膠封片后采圖，使用Image J 8.1分析。

1.3 微型CT（Micro-CT）掃描

將小鼠下頜骨和股骨樣本以甲醛-硫酸鋅溶液固定，70%乙醇暫存后行Micro-CT掃描，從股骨生長板開始向下延伸50層（厚0.5 mm）劃分為股骨感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）；第一磨牙根分叉以下80層牙槽骨區(qū)域劃分為下頜骨ROI，使用SCANCO vivaCT 80分析骨體積（bone volume，BV）、組織體積（tissue volume，TV）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨皮質(zhì)厚度（cortical thickness，Ct.Th）、骨礦化密度（bone mineral density，BMD）等指標。

1.4 統(tǒng)計學分析

結果表示為均值±標準差（mean±SD），檢驗水準（α=0.05）。使用Graphpad Prism 8.0行方差分析和作圖。

2 結果

2.1 DKK-1 Tg轉基因鼠在股骨和牙槽骨高表達DKK1

免疫組織化學染色顯示，DKK1 Tg股骨（圖1A）和下頜骨牙周膜（圖1B）DKK1的表達明顯高于對照組，證實Cdh5驅(qū)動的內(nèi)皮細胞細胞過表達DKK1模型構建成功。

圖1 DKK1 Tg小鼠股骨和牙槽骨DKK1表達情況Fig 1 Expression of DKK1 in femur and alveolar bone of DKK1 Tg mice

2.2 Cdh5驅(qū)動內(nèi)皮細胞特異性過表達DKK1可增加骨量

Micro-CT掃描分析結果顯示，DKK1 Tg股骨生長板下方骨小梁BV、TV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th值增大；BMD、Ct.Th值差異無統(tǒng)計學意義，提示骨小梁及骨量增加，但礦化程度無明顯變化（圖2A）；牙槽骨BV、TV、BV/TV較對照組增大，骨量增加，而BMD差異無統(tǒng)計學意義，提示牙槽骨骨礦化程度未發(fā)生明顯變化（圖2A）。HE染色顯示，DKK1 Tg股骨遠心端生長板下方骨小梁密度增加，中央骨髓腔縮窄；生長板上方、關節(jié)軟骨下方的骨髓腔也明顯縮窄；生長板寬度較對照組明顯增寬，生長板中成串縱列并行排列的同源細胞群核小，呈橢圓形，肥大軟骨細胞層明顯增厚（圖2B）。

DKK1 Tg牙槽骨骨量有所增多，松質(zhì)骨間可見髓腔縮窄（圖2C），HE染色進一步驗證了Micro-CT結果。

圖2 DKK1 Tg小鼠股骨及牙槽骨形態(tài)學和骨量改變Fig 2 Morphology and bone volume changes in DKK1 Tg mice

2.3 DKK1 Tg轉基因鼠在股骨中高表達DKK1，破骨活性減少

DKK1 Tg股骨遠心端軟骨-骨界面，破骨陽性細胞染色陽性細胞個數(shù)減少，提示在DKK1 Tg股骨遠心端破骨活性降低，對軟骨基質(zhì)的吸收降低（圖3）。

圖3 DKK1 Tg小鼠股骨破骨活性Fig 3 Osteoclast activity in DKK1 Tg mice

2.4 DKK1 Tg轉基因鼠在股骨和牙槽骨中高表達DKK1，ColⅣ表達水平升高

DKK1 Tg股骨ColⅣ表達量在生長板中軟骨-骨界面和肥大軟骨細胞的表達較對照組明顯增高（圖4A）。DKK1 Tg下頜骨牙周膜中ColⅣ表達也明顯高于對照組（圖4B）。但股骨和牙槽骨中均未發(fā)現(xiàn)血管形成有明顯變化（圖4）。

圖4 DKK1 Tg小鼠Col IV表達情況Fig 4 Expression of Col IV in DKK1 Tg mice

3 討論

DKK1在骨形成中的作用研究較為深入，可通過調(diào)控Wnt信號通路從而調(diào)控軟骨和骨的發(fā)育[22]。DKK1的突變與骨密度和骨折風險相關[23-24]，是多種骨疾病的潛在靶點[25]。由于DKK1主要在成骨細胞和骨細胞中表達，因此骨生物學的研究往往聚焦于DKK1在成骨細胞和骨細胞的功能。血管系統(tǒng)是體循環(huán)系統(tǒng)和不同器官環(huán)境之間的關鍵界面，血管形成也是促使骨形成和牙周組織改建的重要基礎，因此血管形成和骨形成的偶聯(lián)機制是骨生物學基礎之一。

軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞和血管內(nèi)皮細胞等關鍵細胞在細胞命運決定、增殖和成熟過程中的協(xié)同作用參與軟骨和骨的發(fā)育及維持骨穩(wěn)態(tài)。前期研究已經(jīng)明確DKK1在血管形成中可發(fā)揮作用。因此，DKK1作為骨形成和血管形成的偶聯(lián)蛋白，其在血管內(nèi)皮細胞中的精確功能，以及在骨-血管微環(huán)境中的生物學功能亟待研究。

本文構建的Cdh5驅(qū)動的內(nèi)皮細胞特異性DKK1過表達轉基因小鼠，主要探究內(nèi)皮細胞過表達DKK1對股骨及牙槽骨骨形成和血管形成的影響。研究[26]發(fā)現(xiàn)，8周齡小鼠股骨遠心端生長板較對照組小鼠明顯增寬，軟骨細胞肥大區(qū)也明顯增寬，但股骨長度未出現(xiàn)明顯縮短；牙槽骨骨量也有一定程度增加。以往研究也發(fā)現(xiàn)外源性的DKK1可通過阻斷Wnt/β-catenin通路阻礙軟骨細胞進展到前肥大階段，并刺激軟骨生理發(fā)育的相關因子從而獲得健康的軟骨表型。因此，該結果進一步印證了DKK1通過內(nèi)皮細胞調(diào)控骨和軟骨發(fā)育的假說[27]。

在牙周膜中，血管基底膜標記物ColⅣ主要表達在Malassez上皮剩余內(nèi)皮細胞團周圍[28]，張力可刺激牙周膜ColⅣ降解，從而促進血管生成[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜內(nèi)ColⅣ表達廣泛上調(diào)升高，但其血管形成未有明顯差異。此外，ColⅣ在正常關節(jié)軟骨細胞周圍表達，在鈣化軟骨中表達量低[30]，但本研究意外發(fā)現(xiàn)DKK1在內(nèi)皮細胞內(nèi)的特異性過表達引起了軟骨細胞內(nèi)ColⅣ表達水平上調(diào)。因此，內(nèi)皮細胞內(nèi)DKK1上調(diào)介導的ColⅣ表達的機制需要進一步研究。

本研究選用Cdh5構建內(nèi)皮細胞特異性的Cre重組酶表達。Cdh5又名CD-144和VE-Cadherin，是一種跨膜蛋白，參與內(nèi)皮細胞間的黏附。Cdh5啟動子元件在成年內(nèi)皮和靜息狀態(tài)的內(nèi)皮中均有活性[31-32]。其他常用的內(nèi)皮細胞特異性Cre重組酶表達品系，包括Tie-1-Cre、Tie-2-Cre、PECAM-Cre和Flk-1-Cre。它們各自有其優(yōu)勢和不足。Tie-1-Cre在早期內(nèi)皮中表達，但Tie-1在造血細胞、皮質(zhì)和海馬體的一些神經(jīng)元中也表達。Tie-2-Cre，是內(nèi)皮中應用最多的刪除酶系，但在中胚層中也有表達。Flk-1-Cre在肌肉系細胞中也有表達，盡管用限制性片段消除了肌肉表達的影響，但在靜息狀態(tài)的內(nèi)皮中不能完全滲透。此外，這些啟動子的活性大部分在成年鼠靜息狀態(tài)的內(nèi)皮中不表達[33]。相對于其他內(nèi)皮細胞特異性表達的系統(tǒng)來說，Cdh5-Cre模型具有一致的血管滲透性，在胚胎和成年后分化的內(nèi)皮中均具有特異性的基因表達。這一明顯的優(yōu)勢，使其在探究成年內(nèi)皮的生理和病理狀態(tài)下的功能變化具有重要意義。

以往研究多聚焦于DKK1在內(nèi)皮細胞系中表達改變對胚胎發(fā)育時期的影響[21]，構建的Tie2-DKK1轉基因小鼠出現(xiàn)E18.5骨小梁面積和厚度的減小，軟骨細胞肥大區(qū)域的明顯增寬，但骨量無明顯變化的表型。本研究聚焦于成年鼠的骨形成變化，發(fā)現(xiàn)成年小鼠呈現(xiàn)了與E18.5小鼠的表型相似性。然而，Tie2-DKK1轉基因小鼠表現(xiàn)出E18.5和4周的上下肢骨長度變短，而在Cdh5-Cre;R26-DKK1/R26-DKK1小鼠中未發(fā)現(xiàn)相似表型，因此具體機制的作用有待進一步研究。

綜上，本研究為探究DKK1偶聯(lián)血管形成和骨形成的作用，構建Cdh5驅(qū)動的內(nèi)皮細胞特異性DKK1過表達轉基因小鼠。該小鼠股骨和牙槽骨DKK1高表達，骨量增加，骨髓腔縮窄，股骨破骨細胞減少，股骨和牙槽骨ColⅣ高表達。因此，內(nèi)皮細胞中DKK1可能對骨形成起調(diào)控作用，Cdh5驅(qū)動內(nèi)皮細胞中DKK1表達增加與骨組織中軟骨細胞的分化及骨小梁的形成、牙周組織骨量的增加密切相關，DKK1作為骨量和調(diào)節(jié)因子和血管形成的調(diào)控因素，深入研究DKK1具體機制有望闡明在應力刺激下Wnt信號通路對牙槽骨中骨和血管形成的調(diào)控作用。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。