董栩 徐欣

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 四川大學華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 成都 610041

即使經(jīng)過完善的機械和化學預備，根管內(nèi)的微生物仍可能在牙本質(zhì)小管中保持活性。若根尖封閉不嚴密，根管內(nèi)殘留的病原菌及其代謝產(chǎn)物進入根尖，會造成根尖區(qū)持續(xù)性的炎癥反應。由此可見，在根尖外科手術(shù)中進行嚴密的根尖倒充填非常必要，目的是為了獲得良好的根尖封閉性，誘導根尖周組織愈合。根尖微滲漏是導致根尖手術(shù)失敗的重要原因。微滲漏受到眾多因素的影響，如復雜的根管解剖結(jié)構(gòu)、根尖切除和倒預備技術(shù)、倒充填材料的物理和化學性質(zhì)，以及不同的倒充填技術(shù)和倒充填質(zhì)量等。

根尖切除和根尖倒預備是根尖外科手術(shù)的重要步驟，通過根尖3 mm的切除和根管的清理成形可去除根尖大部分殘留的感染組織[1]，但是根管的解剖結(jié)構(gòu)復雜且存在變異，根管峽部清理不全仍是導致手術(shù)失敗的重要原因。根管峽部被定義為2個根管之間狹窄的帶狀、鰭狀或網(wǎng)狀連通。在存在2個根管的牙根中，峽部非常普遍，例如磨牙的近中根、前磨牙以及下頜切牙。Arx等[2]檢查根尖手術(shù)中患牙的根尖切除面，發(fā)現(xiàn)2/3的牙齒根尖存在峽部，59.4%的牙齒存在峽部根管系統(tǒng)充填不完善的情況。下頜第一磨牙近中根是峽部存在的常見位置，發(fā)生率為55.5%~88.5%[3-6]。Yoon等[7]分析了非手術(shù)根管治療失敗的下頜第一磨牙的根管橫斷面，結(jié)論認為其近中根復雜的解剖結(jié)構(gòu)是傳統(tǒng)根管治療失敗的重要原因。現(xiàn)代根尖手術(shù)可在顯微鏡下行根尖切除和倒預備以提高倒充填的質(zhì)量，但是倒充填材料的嚴密封閉仍然是影響根尖手術(shù)預后的重要因素之一。Setzer等[8]對20例根尖手術(shù)失敗病例進行評價，發(fā)現(xiàn)60%的病例存在根尖倒充填不足是導致手術(shù)失敗的重要原因。一項系統(tǒng)評價和Meta分析[9]顯示：倒充填材料是影響顯微根尖外科手術(shù)長期預后的主要因素之一。一項回顧性研究[10]對424顆磨牙根尖手術(shù)的結(jié)果進行了評估，結(jié)論認為：根尖倒充填材料、隨訪時間和基于 錐 形 束CT（one-beam computed tomography，CBCT）的術(shù)前評估是影響根尖周組織愈合的重要因素。另一項回顧性研究[11]結(jié)果顯示：顯微根尖外科手術(shù)中使用的根尖倒充填材料和術(shù)前的非手術(shù)根管再治療可能會影響手術(shù)的長期預后。

根尖手術(shù)后的微滲漏可能發(fā)生在倒充填材料與牙膠之間、倒充填材料與牙本質(zhì)壁之間以及倒充填材料的內(nèi)部。在根尖手術(shù)中獲得良好的根尖封閉性非常重要，因此有必要對倒充填材料的根尖封閉性進行體內(nèi)和體外的評價[12]。根尖封閉性的體外評價一般采用離體人牙或犬牙建立根尖倒充填模型，評價方法主要包括染料滲漏法、三維圖像分析、細菌和內(nèi)毒素滲漏法、流體過濾法和葡萄糖滲漏法等。除了三維圖像分析外，所有方法均采用測量物質(zhì)通過根尖的滲漏量來間接評價封閉性。常用水、小分子化合物或細菌等的滲漏量來進行根尖封閉性的評價。本文對上述方法用于根尖倒充填封閉性體外評價的研究進展、技術(shù)優(yōu)勢與局限性進行綜述。

1 染料滲漏法

染料滲漏法是最常用和簡單的評價根尖倒充填封閉性的方法。染料滲漏法的原理是將除根尖外密封的樣本浸泡于染料，經(jīng)過一定時間后測量染料通過根尖的滲漏量。常見的染料有1%~3%的亞甲基藍染料，此外羅丹明B染料等也有報道。

評價染料滲漏量的方法一般有3種。1）經(jīng)典的染料滲漏法。將模型縱向或橫向切開，顯微鏡放大觀察后采集圖像，采用軟件測量其最大線性滲漏深度。Corsentino等[13]使用亞甲基藍染料評價2種根尖倒充填材料在不同的倒預備長度下的封閉性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生物陶瓷材料Biodentine具有比Super-EBA更少的微滲漏。羅丹明B染料也在經(jīng)典的染料滲漏法中有應用。Singh等[14]使用羅丹明B染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡比較了不同根尖倒充填材料的封閉能力，發(fā)現(xiàn)Biodentine根尖封閉能力表現(xiàn)最好，其次是無機三氧化物聚合物（mineral trioxide aggregate，MTA）、金屬陶瓷材料、樹脂改性玻璃離子水門?。╮esin-modified glass ionomer cement，RMGIC）和銀汞合金。2）染料提取法。將樣本浸泡于亞甲基藍染料一段時間后再浸入硝酸溶液中提取染料，采用分光光度分析法等測量染料滲漏量。Nepal等[15]采用這種方法比較了3種不同倒充填材料的根尖封閉性，發(fā)現(xiàn)Biodentine和MTA的微滲漏顯著低于玻璃離子水門?。╣lass ionomer cement，GIC）。Gupta等[16]采用同樣的方法評價了幾種新型生物陶瓷材料根尖倒充填的微滲漏，結(jié)果顯示Biodentin和Bioaggregate的微滲漏明顯低于MTA Plus和MTA。3）透明牙技術(shù)。首先使用印度墨水或亞甲基藍染料對標本進行染色，再采用脫礦技術(shù)使牙齒變透明，最后在顯微鏡下評價根尖染料滲漏的范圍。D?ankovi?等[17]采用該技術(shù)比較幾種材料的封閉性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Biodentine作為倒充填材料較MTA和FujiⅨ具有更好的根尖封閉性能。Yazdizadeh等[18]采用該技術(shù)證明MTA在時間充足且存在水分的情況下凝固能獲得更好的根尖封閉性。

染料滲漏法操作簡單且應用廣泛，但染料的選擇、浸泡時間和樣本中殘留空氣均會影響實驗結(jié)果[19]。橫切或縱切法無法測量染料三維方向的滲漏[20]；染料提取法和透明牙技術(shù)存在染料溶解的問題，影響測量的準確性[21]；染料滲漏邊界的確定易受操作者主觀影響。盡管如此，操作簡單和成本低廉仍然是該方法最大的優(yōu)點，經(jīng)過改進后該方法也越來越趨于客觀，并可獲得定量結(jié)果。在比較各種根尖封閉性評價方法時，染料滲漏法也是最常用的對照方法。

2 三維圖像分析

三維圖像分析一般指采用微型計算機斷層掃描（micro-computed tomography，Micro-CT）或掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）掃描樣本后進行分析的方法。Micro-CT分析一般通過合適的閾值調(diào)整來區(qū)分樣本各部分和空隙，隨后通過軟件進行三維重建和空隙率分析。SEM可以在切片后直接觀察到充填材料進入牙本質(zhì)小管及對其適應的情況。

Micro-CT和SEM在評價根尖倒充填材料空隙率的研究中應用廣泛。Kim等[22]利用Micro-CT評價牙本質(zhì)和根尖倒充填材料之間的空隙率，結(jié)果顯示ProRoot MTA倒充填的空隙率高于MTA Angelus、EndoCem MTA和RetroMTA。Jardine等[23]采用Micro-CT評價3種硅酸鈣基生物陶瓷材料根尖倒充填后的邊緣空隙和內(nèi)部空隙，結(jié)果是MTA Angelus、Biodentine和Neo MTA Plus之間沒有差異。Gülses等[24]使用SEM比較5種根尖倒充填材料的邊緣適應性，結(jié)果表明Diaket是最適合的倒充填材料，其次是AH-Plus和快凝Super-EBA，再次是Super-EBA、ProRoot MTA。Mody等[25]使用SEM評價血液和人工唾液污染對MTA根尖倒充填邊緣適應性的影響，證明血液對MTA封閉性的影響更大。Al-Fouzan等[26]使用Micro-CT和SEM評價根尖牙本質(zhì)預酸蝕對白色和灰色MTA邊緣適應性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預酸蝕只能增加灰色MTA的根尖封閉效果。

三維圖像分析是評價根尖倒充填封閉性直觀、簡單的方法，主要局限性在于：Micro-CT分析結(jié)果與掃描參數(shù)及閾值選擇等相關(guān)，充填材料也可能造成偽影[27]；SEM只能得到個別平面的空隙情況。盡管如此，該方法與臨床影像學檢查關(guān)系密切，且三維定量測量具有可靠性，具有一定的臨床價值。

3 細菌和內(nèi)毒素滲漏法

細菌和內(nèi)毒素滲漏法一般采用雙室滲漏模型。雙室滲漏模型的原理是構(gòu)建上下兩個封閉且無菌的腔室，兩者僅僅通過樣本的根尖部分相聯(lián)通。上腔室中放入細菌懸浮液，細菌通過根尖進入下腔室，通過檢測下腔室中的細菌或內(nèi)毒素來評價根尖的封閉性。

糞腸球菌是難治性根尖周炎中的主要細菌，因此常常用于細菌滲漏模型。一般來講，下腔室中細菌滲漏只能采用定性的分析方法。具體方法是觀察一定的時間或直到所有樣本發(fā)生滲漏后進行生存分析，比較一定時間內(nèi)發(fā)生細菌滲漏的樣本數(shù)或所有樣本發(fā)生滲漏所需的時間。目前已有很多研究[28-32]采用糞腸球菌雙室滲漏模型對根尖倒充填材料的平均滲漏時間進行定性比較。細菌滲漏法無法對滲漏的細菌進行準確的定量分析，因為下腔室中檢測到的細菌量與培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間等關(guān)系密切。盡管如此，仍有一些研究在這方面進行了嘗試。常見的方法有菌落形成單位計數(shù)（colony-forming units，CFUs）、SEM觀察、分光光度法測定細菌濁度等。Antunes等[33]和Nair等[34]使用糞腸球菌滲漏模型比較MTA和Endosequence BC RRM的根尖封閉能力，CFUs結(jié)果顯示2種材料的根尖封閉性相似。Lertmalapong等[35]利用糞腸球菌滲漏模型的定性和SEM分析比較了5種生物活性陶瓷材料的根尖封閉性，結(jié)果表明Biodentine、膏狀TotalFill BC RRM和ProRoot MTA比TotalFill BC RRM糊劑和RetroMTA發(fā)生根尖滲漏更少。Espir等[36]通過分光光度法測定下腔室的細菌濁度，MTA和氧化鋯硅酸鈣基材料（calcium silicate cement with zirconium oxide，CSC/ZrO2）表現(xiàn)出 比氧化鋅/丁香酚（zinc oxide/eugenol，ZOE）更低的細菌滲漏率。表皮葡萄球菌在細菌滲漏模型中的應用也可見報道。Asnaashari等[37]使用表皮葡萄球菌滲漏模型研究根尖倒充填材料的封閉性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ProRoot MTA、Root MTA和Portland cement的根尖封閉性相似。與細菌滲漏實驗不同，內(nèi)毒素滲漏實驗中上腔室一般是混合的細菌懸浮液。Tang等[38]使用內(nèi)毒素滲漏法評價了MTA根尖倒充填的滲漏性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該材料具有出色的根尖密封能力。

細菌及其產(chǎn)物是牙髓病和根尖周病的主要致病因素，因此使用細菌和內(nèi)毒素滲漏法作為評價根尖倒充填封閉性的指標是十分合理的；但所有細菌滲漏模型都有一定的局限性，主要來自充填材料本身抗菌性的影響和與其他根尖封閉性評價技術(shù)結(jié)果的不一致[39]。從另一個角度考慮，該方法同時評價了材料在實際應用中的抗菌性和封閉性效果，實驗結(jié)果的差異也可見于其他方法。因此，作為評價根尖封閉性的方法之一，細菌和內(nèi)毒素滲漏實驗仍是一種有價值的選擇。

4 流體過濾法

1986年，Derkson等[40]開發(fā)了流體過濾法用于測量牙科修復材料的微滲漏。Wu等[41]在1993年對其進行改良并將其用于測量根管微滲漏，結(jié)論認為該方法是一種比染料滲漏法更靈敏的檢測根管充填物空隙的方法。流體過濾法一般是以蒸餾水作為示蹤劑，將牙齒模型安裝在流體輸送裝置中。牙根冠部與壓力下充滿水的管相連接，根尖部與含一個氣泡的毛細管相連接。通過檢測毛細管中移動的氣泡，可以定量測量液體經(jīng)過根尖部的輸送情況。

流體過濾法在根尖倒充填封閉性的評價中應用廣泛。Shetty等[42]使用流體過濾法比較4種根尖倒充填材料封閉能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTA Angelus的密封能力表現(xiàn)最佳，其次是Biodentine、MTA Plus和GIC。Ayatollahi等[43]使用該方法評價了不同粉液比的富含鈣混合物（calcium-enriched mixture，CEM）根尖倒充填的微滲漏，發(fā)現(xiàn)3∶40的粉液質(zhì)量比可以達到最好的根尖封閉能力。Garip等[44]則用此方法評價了不同根尖切除角度對根尖封閉性的影響，發(fā)現(xiàn)根尖切除角度的變化并不一定會導致微滲漏的差異。Amoroso-Silva等[45]用該方法比較了樹脂基根管封閉劑和硅酸鈣基倒充填材料的根尖封閉性，結(jié)論是兩者的界面適應性相似。Bani等[46]通過該方法比較了2種根尖倒充填材料，結(jié)論是任何厚度的Biodentine都有與MTA相媲美的根尖封閉能力。

流體過濾法相比染料滲漏法的優(yōu)點在于能自動記錄并提供敏感、精確的測量數(shù)據(jù)[47]，然而該方法仍具有一定的局限性：實驗實施必須有特殊的儀器；目前沒有統(tǒng)一的標準，毛細管直徑、壓力大小和測量時間都可能改變實驗結(jié)果[48]。未來需要進行更多研究并制定統(tǒng)一的標準。

5 葡萄糖滲漏法

葡萄糖滲漏模型同樣采用雙室滲漏模型。葡萄糖是該方法的示蹤劑，其分子尺寸小且是細菌的營養(yǎng)物質(zhì)，具有很好的臨床相關(guān)性。葡萄糖滲漏模型一般包括無加壓裝置和有加壓裝置2種：前者往往依賴大氣壓力使葡萄糖從上腔室滲漏到下腔室，后者通過與加壓裝置相連可以在短時間內(nèi)加速葡萄糖的滲漏。

加壓裝置的存在極大地縮短了實驗時間，降低了細菌生長和水分蒸發(fā)的風險，同時能保持檢測滲漏樣本的能力。Leal等[49]通過與壓力裝置相連的葡萄糖滲漏模型比較了3種材料的根尖封閉能力，結(jié)論是Ceramicrete的葡萄糖滲漏率明顯低于BioAggregate，但二者與白色MTA無明顯差異。Nikhil等[50]分別使用有加壓裝置的葡萄糖滲漏法、液體過濾法和染料滲漏法評價了MTA的根尖封閉性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種方法的結(jié)果之間沒有相關(guān)性。

葡萄糖滲漏法的優(yōu)點包括無創(chuàng)和臨床相關(guān)性強，在檢測滲漏方面敏感性強[51-52]。它的主要局限性在于葡萄糖與實驗材料的相互反應。有研究[53]顯示：多種根管充填材料能與葡萄糖溶液發(fā)生反應，因此不應使用葡萄糖滲漏模型評價這些材料的封閉能力。此外，實驗周期長、難以維持無菌系統(tǒng)、葡萄糖消耗以及水分蒸發(fā)的風險也是該方法的缺點[12]。加壓裝置的使用在很大程度上解決了這方面的問題，但更完善的實驗方法仍需要進一步探索。

6 其他方法

其他一些方法，如電化學法、蛋白質(zhì)滲漏法、放射性同位素滲漏法、銅離子滲漏法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和實時流量測量法等也可用于評價根尖封閉性，但在根尖倒充填模型中的應用較少。電化學法依賴于離子通過狹窄空間的擴散，離子擴散在2個電極之間產(chǎn)生的電流大小與滲漏量成正比。Martell等[54]通過電化學法評價3種根尖倒充填材料，發(fā)現(xiàn)MTA的滲漏明顯少于IRM和Super EBA，但其結(jié)果與染料滲漏法不完全一致。電化學法的優(yōu)點是可持續(xù)監(jiān)測和定量分析根尖微滲漏情況，缺點在于電解液和電極的存在可能使充填材料的某些成分電解，干擾離子的流動從而導致錯誤的結(jié)果[55]。蛋白質(zhì)滲漏模型一般是在雙室模型中進行，多采用大小介于染料和細菌之間的白蛋白。Malcic等[56]通過牛血清白蛋白滲漏法來比較SuperEBA和IRM根尖倒充填的封閉性，結(jié)果顯示聯(lián)合使用正向充填和SuperEBA根尖倒充填的樣品發(fā)生的根尖滲漏更少。蛋白質(zhì)滲漏法的缺點和葡萄糖滲漏法相似。放射性同位素滲漏法是使用放射性同位素作為示蹤劑對樣本進行放射自顯影分析。Ha?kel等[57]使用125I放射性標記溶菌酶定量分析滲漏的方法比較了不同根管封閉劑的根尖封閉性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AH Plus和Sealapex表現(xiàn)出比Sealite更好的根尖封閉性。放射性同位素滲漏法的不足主要在于：二維放射自顯影圖像不能代表微滲漏的三維情況；某些同位素（例如45Ca）對牙齒結(jié)構(gòu)或修復材料具有親和力，可導致測量誤差增加；某些體積小的同位素可以穿過牙齒結(jié)構(gòu)或修復材料，可被誤認為是滲漏；放射污染和損害等[12,58]。銅離子滲漏法通過原子吸收光譜儀測量從冠部擴散到根部的銅離子。Modaresi等[59]使用硫酸銅溶液滲漏法和染料滲漏法來評價根管治療的根尖封閉性，發(fā)現(xiàn)2種方法之間沒有相關(guān)性。該方法的優(yōu)點在于牙齒結(jié)構(gòu)中不含銅離子，不會干擾其他元素的吸收光譜；缺點在于應用很少且與其他方法相關(guān)性差。Michelotto等[60]使用咖啡因作為示蹤劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對根管封閉劑的微滲漏進行定量測量，結(jié)果顯示AH Plus的根尖封閉性較Sealapex更好。Park等[61]使用實時流量測量設(shè)備在靜水壓力下精確追蹤通過根管充填材料的液體流動，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牙膠結(jié)合AH 26、牙膠結(jié)合EndoSeal MTA和Biodentine三者的根尖封閉性沒有明顯差異。目前上述方法主要應用于根管充填和根管封閉劑的根尖封閉性評價，對于根尖倒充填封閉性的評價有待更多的研究驗證和進一步優(yōu)化。

7 結(jié)論

根尖倒充填封閉性的體外評價存在局限性，但它可以作為新材料和技術(shù)的初步篩選方法，仍然具有重要的研究價值[62-63]。染料滲漏法和三維圖像分析是簡單、常用的方法，但影響因素多且受主觀因素影響較大；細菌和內(nèi)毒素滲漏法、流體過濾法、葡萄糖滲漏法能較客觀地分析根尖微滲漏情況，但缺乏統(tǒng)一標準且結(jié)果易受多種因素影響；其他方法也有報道，但目前研究較少且質(zhì)量較低。通過擴大樣本量和設(shè)置適當對照等途徑可有效減少各種因素的干擾。對這些評價方法來說，如何更加客觀準確地評價根尖倒充填封閉性，如何統(tǒng)一各種評價參數(shù)和標準，是未來亟待解決的問題。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。