周燦 曾倩 韋曦

中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院 廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510055

活髓保存治療是一種用于保存受齲源性、創(chuàng)傷性或機(jī)械性損傷的牙髓組織的方法，在牙髓組織受到潛在感染或暴露時(shí)，去除壞死牙髓組織，將具有生物活性的蓋髓劑覆蓋于近髓牙本質(zhì)或暴露的牙髓組織創(chuàng)面，促進(jìn)牙髓恢復(fù)和第三期牙本質(zhì)形成，以達(dá)到保留和維持剩余牙髓組織活力和功能的目的[1-2]。其中蓋髓劑的應(yīng)用與活髓保存治療的成功率密切相關(guān)。理想的蓋髓劑應(yīng)具備持久的抗菌性、良好的密封性和生物相容性、促進(jìn)組織修復(fù)再生能力以及優(yōu)越的臨床可操作性等特點(diǎn)[3-4]。目前臨床上常用的蓋髓材料包括氫氧化鈣、三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）、新型納米生物陶瓷材料如iRoot BP Plus、Biodentine、calcium enriched mixture cement（CEM）等[5]。有研究[6]將生物活性小分子物質(zhì)加載于生物陶瓷類材料用于活髓保存治療，獲得良好的修復(fù)療效；胡玉萍等[7]將富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）與MTA聯(lián)合應(yīng)用于兔直接蓋髓術(shù)發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。這類復(fù)合型材料有望成為活髓保存治療的新型蓋髓材料。濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）是繼富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）與PRF后的新一代血小板濃縮制品，由纖維緊密交織形成復(fù)雜三維（three dimensional，3D）網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，內(nèi)含豐富的纖維蛋白及大量生長因子等生物活性小分子物質(zhì)[8]。目前大部分研究和綜述著重關(guān)注其在促進(jìn)骨組織修復(fù)方面如頜面骨修復(fù)[9]、口腔種植體修復(fù)[10]等的研究進(jìn)展，然而CGF在促進(jìn)其他組織的修復(fù)與再生中仍具有相當(dāng)?shù)臐摿?，Li等[11]總結(jié)了CGF在牙髓再生中的應(yīng)用并指出其在炎癥微環(huán)境可發(fā)揮作用。有研究[12]發(fā)現(xiàn)CGF可降低炎癥牙髓中炎癥因子的表達(dá)，提示CGF聯(lián)合生物陶瓷類材料應(yīng)用于活髓保存治療有可能促進(jìn)炎性牙髓修復(fù)再生。本文就CGF的發(fā)展歷程、制備方法及活性成分進(jìn)行歸納，總結(jié)其在組織修復(fù)再生中的應(yīng)用，并將CGF在活髓保存治療的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，以期為生物陶瓷類材料聯(lián)合CGF應(yīng)用于活髓保存治療的進(jìn)一步研究提供思路。

1 CGF的制備及活性成分

1.1 血小板濃縮物的發(fā)展歷程和制備

血小板濃縮物的發(fā)展經(jīng)歷了PRP、PRF、CGF 3個(gè)階段。1984年，Assoian等[13]報(bào)道了PRP及其制備方法，根據(jù)血液中各組分沉降系數(shù)不同，加入抗凝劑的全血經(jīng)密度梯度離心后分為3層（上清液層、血小板層及紅細(xì)胞層），上清液層及血小板層再次離心并棄除上清后得到含有大量血小板的血漿，最后與10%氯化鈣、牛凝血酶混合即為PRP。該過程可釋放大量生長因子用于組織修復(fù)再生[14]，但外源性凝血酶的應(yīng)用存在伴發(fā)凝血系統(tǒng)紊亂的風(fēng)險(xiǎn)，其安全性受到一定的質(zhì)疑[15]。

PRF是Dohan等[16]提出的第2代血小板濃縮物，即新鮮的靜脈血經(jīng)過1次定速離心（2 700~3 000 r·min-1，10 min），纖維蛋白原發(fā)生緩慢聚合，形成三分子立體網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，主要包括貧血小板血漿層（platelet poor plasma，PPP）、紅細(xì)胞碎片層及兩者之間的富含血小板的纖維蛋白凝膠，分離后取中間層即為PRF[17]。

通過對靜脈血的差速離心獲得了第3代血小板濃縮物CGF[8]。與PRF相比，CGF的制備過程亦無需添加任何化學(xué)制劑，采用的2 400~3 000 r·min-1變速離心技術(shù)可增加血小板間的碰撞率，從而提取出體積更大、強(qiáng)度更高、黏性更強(qiáng)、生長因子濃度更高的纖維蛋白凝塊[18]。經(jīng)特定的變速離心程序后，血液樣本由下至上分別為紅細(xì)胞層、纖維蛋白凝膠層及血清3層。其中纖維蛋白凝膠層即CGF[19]。相較于PRP，CGF和PRF無需添加抗凝劑或其他生物添加劑。PRP在提取后第1小時(shí)內(nèi)釋放近95%的生長因子，需在4 h內(nèi)新鮮制備和使用[20]。CGF及PRF存在立體網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，能持續(xù)釋放生長因子。經(jīng)變速離心獲得的CGF較PRF形成的纖維結(jié)構(gòu)更密集，釋放生長因子濃度更高且時(shí)間更長[21]。因此，CGF作為第3代血小板濃縮物具有制備安全、作用時(shí)間長、能釋放大量生長因子等優(yōu)勢。

1.2 CGF的活性成分及其作用

CGF主要通過其纖維蛋白網(wǎng)狀支架及高濃度的各類生長因子在組織修復(fù)再生中發(fā)揮作用。CGF中通過差速離心聚合形成的3D纖維蛋白立體網(wǎng)架孔隙大、彈性好，有利于細(xì)胞因子的嵌入和細(xì)胞遷移。進(jìn)入體內(nèi)環(huán)境后，纖維蛋白網(wǎng)架被膠原酶等逐漸降解，可實(shí)現(xiàn)生長因子的持續(xù)緩釋，延長有效作用時(shí)間，有利于受損組織的修復(fù)[22-23]。掃描電鏡下CGF中可見纖維緊密交織形成的3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及網(wǎng)內(nèi)彌散分布的血小板和白細(xì)胞[24]。CGF上還存在一定量的CD34陽性細(xì)胞，可增強(qiáng)其促進(jìn)新血管生成、膠原合成、上皮和表皮再生的作用，以及提高對損傷止血的反應(yīng)能力[19,25]。

此外，經(jīng)差速離心激活后，血小板的α顆粒可以釋放各種生長因子，主要包括以下幾類：血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等[23,26]。這些生長因子能促進(jìn)血管生成（VEGF、PDGF等）以及成骨/成牙本質(zhì)向分化（PDGF、BMP、EGF、FGF等）。Zhang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，PDGF可增強(qiáng)人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的遷移、增殖和成牙本質(zhì)向分化能力，且促進(jìn)hDPSCs分泌VEGF，提高牙髓血管修復(fù)再生潛能。人PDGF與MTA聯(lián)合進(jìn)行蓋髓治療后可形成較MTA組更厚且均勻的成牙本質(zhì)樣組織[28]。Matsushita等[29]觀察VEGF對人牙髓細(xì)胞趨化性、增殖及分化能力的影響，結(jié)果顯示：小劑量的VEGF能誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞遷移及成牙本質(zhì)向分化，同時(shí)調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和分化。CGF中的生長因子之間可能存在相互協(xié)同作用，促進(jìn)組織再生和損傷修復(fù)，然而相關(guān)的作用及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2 CGF在組織修復(fù)再生中的應(yīng)用研究

近年來，CGF以凝膠、半凝膠、浸提液或薄膜等形式逐漸應(yīng)用于不同的臨床領(lǐng)域如創(chuàng)面修復(fù)、美容治療及口腔醫(yī)學(xué)等。靜脈血經(jīng)變速離心后，使用剪刀將纖維蛋白凝膠層（即CGF）與紅細(xì)胞層分離，可直接以固體凝膠形態(tài)[30]或壓縮成薄膜形態(tài)使用。Kao[31]對18例慢性創(chuàng)面采用CGF凝膠/膜治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16名患者創(chuàng)面處觀察到明顯的肉芽組織和再生表皮修復(fù)，另外2名小腿靜脈潰瘍患者由于合并靜脈血栓導(dǎo)致治療失敗。在美容治療中，Zhou等[32]將CGF凝膠應(yīng)用于裸鼠皮膚光老化模型，1個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，CGF可顯著改善光老化小鼠的皮膚外觀和結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，對皮膚衰老有治療作用。此外，有學(xué)者[33]對CGF在口腔組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行5年回顧性分析，證實(shí)CGF具有良好的生物相容性，并可減輕疼痛，促進(jìn)組織愈合。在牙周組織再生中，Akcan等[34]將CGF放置于牙周翻瓣后暴露的牙根表面用以治療牙齦退縮，結(jié)果表明：CGF可減輕翻瓣術(shù)后疼痛，并促進(jìn)牙齦組織修復(fù)。Pirpir等[35]在上頜前牙種植術(shù)中使用CGF可促進(jìn)種植體穩(wěn)定性，并加速骨組織愈合。但有研究顯示，CGF有限的穩(wěn)定性和一定的溶解性還不足以持續(xù)支持組織修復(fù)再生。Akcan等[34]指出自體結(jié)締組織移植治療牙齦退縮在改進(jìn)角化齦寬度、厚度及根面覆蓋率的遠(yuǎn)期臨床療效優(yōu)于CGF膜。在種植體周圍炎的手術(shù)治療中，術(shù)后12個(gè)月植骨材料聯(lián)用膠原膜在治療牙齦愈合及骨再生方面的臨床效果比CGF膜顯著[36]。因此，目前有研究將CGF與各種細(xì)胞、固體支架或膠原膜等聯(lián)合應(yīng)用。Honda等[22]將CGF與大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合應(yīng)用于大鼠顱骨缺損修復(fù)，早期組織病理學(xué)結(jié)果顯示在缺損部位的外圍和中心均發(fā)現(xiàn)骨形成及豐富的新生血管形成。12周后骨缺損幾乎完全閉合，新骨組織中證實(shí)存在骨髓，形成與正常顱骨組織相似的結(jié)構(gòu)。在Chen等[37]的研究中，CGF和膠原分別與大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合，并植入大鼠顱骨缺損處，3個(gè)月后micro-CT結(jié)果顯示：CGF組較膠原組可促進(jìn)更多新生骨形成。此外，Yu等[38]將CGF與脫蛋白牛骨礦物質(zhì)或纖維內(nèi)礦化膠原支架聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)CGF與纖維內(nèi)礦化膠原支架結(jié)合可在14~28 d內(nèi)釋放更多生長因子且持續(xù)時(shí)間更長。Bonazza等[39]的研究結(jié)果顯示，CGF與β-磷酸三鈣混合使用能夠增加BMP-2和BMP-7的釋放，誘導(dǎo)成骨并增強(qiáng)骨活性。

由此可見，CGF可有效促進(jìn)組織缺損的修復(fù)，并且減輕患者術(shù)后反應(yīng)，但由于CGF遠(yuǎn)期療效的不穩(wěn)定性，其與細(xì)胞或支架材料聯(lián)合使用可能促進(jìn)其中生長因子的持續(xù)釋放，誘導(dǎo)組織修復(fù)再生，在組織修復(fù)再生領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

3 CGF應(yīng)用于活髓保存治療的研究

CGF凝膠中含有白細(xì)胞及大量生長因子，不僅能減輕炎癥反應(yīng)，還可有效促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)再生，因此逐漸在活髓保存術(shù)治療牙髓損傷的應(yīng)用研究領(lǐng)域獲得關(guān)注。體外研究顯示，CGF能提高牙髓細(xì)胞、hDPSCs等的增殖、遷移及成骨/牙本質(zhì)向分化能力。Dou等[40]評估了CGF、PRF與傳統(tǒng)蓋髓材料Ca(OH)2及鈣硅基類蓋髓材料MTA、iRoot BP等對牙髓細(xì)胞毒性、增殖、凋亡及礦化能力的影響，發(fā)現(xiàn)除Ca(OH)2外，包括CGF以內(nèi)的其余材料均具有良好的生物相容性。在刺激第3天和第7天，CGF組的牙髓細(xì)胞相較于MTA/iRoot BP組表現(xiàn)出更高的增殖率。Jun等[41]證實(shí)，在體外條件下，CGF促進(jìn)牙髓細(xì)胞的VEGF、PDGF和趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）表達(dá)，同時(shí)提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力，促進(jìn)血管結(jié)構(gòu)的形成。Jin等[24]檢測添加CGF的條件培養(yǎng)基對hDPSCs增殖、遷移及成骨向分化的作用，結(jié)果顯示，添加CGF的培養(yǎng)基可促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，且能更有效地形成礦化結(jié)節(jié)；第5天和第9天堿性磷酸酶活性升高，第14天時(shí)成牙本質(zhì)相關(guān)基因牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（dentin matrix protein，DMP）-1和牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin saliva phosphoprotein，DSPP）等明顯上調(diào)，表明CGF能促進(jìn)hDPSCs成牙本質(zhì)向分化。Xu等[12]利用脂多糖模擬炎癥環(huán)境，發(fā)現(xiàn)CGF可促進(jìn)炎癥狀態(tài)下牙髓細(xì)胞的增殖及遷移，并顯著下調(diào)脂多糖刺激下白細(xì)胞介素-8及腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，提示CGF可能減輕牙髓炎癥并促進(jìn)牙髓組織修復(fù)，為CGF應(yīng)用于牙髓損傷的活髓保存治療提供研究依據(jù)。

有研究將CGF應(yīng)用于牙髓再生治療以促進(jìn)牙根繼續(xù)發(fā)育。Xu等[12]將CGF膜植入Beagle犬根尖未閉合的前牙，8周可見根管內(nèi)形成含有血管、神經(jīng)、呈柵欄狀排列的成牙本質(zhì)細(xì)胞的牙髓樣組織，同時(shí)根管管壁增厚且出現(xiàn)根尖閉合。張?jiān)婍嵉萚42]將CGF或血凝塊植入裸鼠體內(nèi)，CGF較血凝塊誘導(dǎo)更多神經(jīng)纖維及血管形成。Nivedhitha等[43]對2例根尖發(fā)育不全的恒牙行CGF聯(lián)合牙髓再生技術(shù)治療，在1年的隨訪中，錐形束CT評估證實(shí)患牙根尖明顯閉合且根部牙本質(zhì)厚度增加，根尖周圍病變范圍變小。此外，臨床研究結(jié)果顯示，CGF聯(lián)合牙髓再生技術(shù)治療恒牙根尖發(fā)育不全合并牙髓病的成功率為71.4%。

基于CGF對牙髓組織的修復(fù)再生及減輕炎癥等作用，學(xué)者們開始將CGF作為蓋髓材料以封閉暴露牙髓及促進(jìn)牙髓組織修復(fù)再生。Tian等[44]使用CGF、MTA及Ca(OH)2對Beagle犬牙進(jìn)行直接蓋髓，3個(gè)月后X線片顯示：CGF組可形成較少牙本質(zhì)橋，甚少出現(xiàn)髓腔或根管縮窄，且均無根尖病變；組織病理學(xué)顯示：CGF組形成薄的鈣化屏障，且牙髓成牙本質(zhì)細(xì)胞排列整齊，而Ca(OH)2和MTA組形成厚的鈣化屏障，部分成牙本質(zhì)細(xì)胞消失。在血小板濃縮物與生物陶瓷材料聯(lián)合應(yīng)用方面，已有研究[7]將PRF聯(lián)合MTA作用于兔直接蓋髓，錐形束CT結(jié)果顯示：術(shù)后1周及4周穿髓孔下方可形成斑塊狀鈣化物，且相較于單獨(dú)蓋髓組鈣化物體積更大，此外根管內(nèi)未見明顯鈣化。然而，尚未有CGF與生物陶瓷材料聯(lián)合應(yīng)用修復(fù)牙髓損傷的體內(nèi)報(bào)道。因此，體外實(shí)驗(yàn)顯示：CGF在一定程度上可減輕牙髓炎癥，并能有效促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖、遷移、成骨/牙本質(zhì)向分化及血管形成。同時(shí)，體內(nèi)研究表明，CGF直接蓋髓可有效促進(jìn)牙本質(zhì)橋形成，CGF作為第3代血小板濃縮物，單獨(dú)或聯(lián)合生物陶瓷類材料等應(yīng)用于牙髓損傷的治療具有一定的潛力，在活髓保存治療中具有良好的應(yīng)用前景。

綜上，CGF來源于自體，使用方式多樣，臨床應(yīng)用較安全廣泛。此外，CGF具備獨(dú)特的纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)及大量生長因子，單獨(dú)應(yīng)用時(shí)能顯著促進(jìn)組織愈合、減輕炎癥反應(yīng)，作為支架與細(xì)胞、其他材料結(jié)合使用可增強(qiáng)其效能。CGF可與生物陶瓷蓋髓材料聯(lián)合應(yīng)用于活髓保存治療，除了作為纖維支架穩(wěn)定負(fù)載蓋髓材料，二者結(jié)合能更好地減輕炎癥及促進(jìn)組織修復(fù)再生。但就目前的研究結(jié)果而言，CGF作用于牙髓組織修復(fù)的機(jī)制尚未闡明，大多數(shù)研究集中在其中某個(gè)生長因子的作用。此外，如何提高CGF的穩(wěn)定性，促進(jìn)其內(nèi)生長因子的持續(xù)釋放也是CGF應(yīng)用于活髓保存治療的研究方向。因此，未來對于CGF在活髓保存治療中的研究一方面需要進(jìn)一步探索CGF中多種生長因子協(xié)同作用的機(jī)制，另一方面需要展開更多體內(nèi)外研究、臨床試驗(yàn)及隨訪觀察，以期為活髓保存治療提供新的思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。