杜 穎，陳 晨，蔡 彤，譚德講，高 華

(中國食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所藥理室，北京 102629)

細(xì)菌內(nèi)毒素是一種能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。注射用藥品中如果含有被污染的外源性內(nèi)毒素，在臨床使用時(shí)，病人會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)出現(xiàn)寒顫、惡心、甚至死亡等熱原反應(yīng)。20世紀(jì)70年代，建立了使用鱟試劑檢測(cè)注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查法——細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。目前《中國藥典》2015年版中共有653個(gè)品種采用此方法檢驗(yàn)，可見細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是保證臨床用藥安全的重要手段之一，也是藥品常規(guī)檢測(cè)中的一項(xiàng)關(guān)鍵安全性指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證是通過實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)來確定實(shí)驗(yàn)室能力的活動(dòng)，包含能力驗(yàn)證計(jì)劃、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)計(jì)劃和測(cè)量審核等所有與能力驗(yàn)證相關(guān)的活動(dòng)。它是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的重要技術(shù)方法之一，是判斷和監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室能力的有效手段，也是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制方法的有效補(bǔ)充。同時(shí)，能力驗(yàn)證也是維持認(rèn)可機(jī)構(gòu)間國際互認(rèn)的基礎(chǔ)之一[1-2]。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的原理和操作[3]雖然簡(jiǎn)單，但是有很多因素會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如鱟試劑靈敏度、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)人員的操作等。為考察全國藥檢系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)能力的基本情況，2020年中國食品藥品檢定研究院(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,NIFDC)按照實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)可的有關(guān)要求，組織實(shí)施了細(xì)菌內(nèi)毒素光度法檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃[4]，編號(hào)為NIFDC-PT-267。希望通過此次能力驗(yàn)證這一外部質(zhì)控手段，在全國范圍內(nèi)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌內(nèi)毒素光度法檢測(cè)能力，并推動(dòng)內(nèi)毒素檢測(cè)能力和技術(shù)水平的進(jìn)一步提高。

本文概述了能力驗(yàn)證項(xiàng)目NIFDC-PT-267的實(shí)施情況，對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行了技術(shù)分析，以幫助各實(shí)驗(yàn)室對(duì)自身的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)能力有更全面的認(rèn)識(shí)并改善提高，同時(shí)也為管理部門利用實(shí)驗(yàn)室資源提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 待測(cè)樣品制備本次能力驗(yàn)證待測(cè)樣品為細(xì)菌內(nèi)毒素白色凍干粉末，2 mL玻璃安瓿裝。每個(gè)參加實(shí)驗(yàn)室發(fā)放1支待測(cè)樣品。

1.2 待測(cè)樣品均勻性和穩(wěn)定性考察隨機(jī)抽取能力驗(yàn)證待測(cè)樣品20支，按照CNAS-GL003：2018《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》[5]規(guī)定，采用《中國藥典》2015年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的光度測(cè)定法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。采用單因素方差分析檢驗(yàn)樣品的均勻性，結(jié)果P>0.05。表明本次能力驗(yàn)證待測(cè)樣品支間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均勻性良好。

細(xì)菌內(nèi)毒素具有良好的穩(wěn)定性，根據(jù)多批細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)數(shù)據(jù)可以得出，穩(wěn)定期均在5年以上。

1.3 待測(cè)樣品檢測(cè)方法與結(jié)果統(tǒng)計(jì)

1.3.1檢測(cè)方法 本次能力驗(yàn)證計(jì)劃要求實(shí)驗(yàn)室按照《中國藥典》2015年版四部(通則1143)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[3]-方法2 光度測(cè)定法中的任意一種方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法 本計(jì)劃參照CNAS-GL002：2018《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》[6]及ISO 13528[7]，采用參加者的公議值，即本次所有參加實(shí)驗(yàn)室的有效檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)健平均值作為該輪次能力驗(yàn)證待測(cè)樣品內(nèi)毒素含量的指定值X。統(tǒng)計(jì)分析使用統(tǒng)計(jì)軟件JMP13，進(jìn)行穩(wěn)健均值及穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算，該計(jì)算是使用Huber M估計(jì)以不受離群值影響的方式計(jì)算的穩(wěn)健均值。

因影響細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素有很多，如溶解、稀釋、加樣過程中的容量誤差和操作誤差、使用儀器的儀器偏差等。《中國藥典》通則1143中規(guī)定，光度檢測(cè)法中檢測(cè)結(jié)果回收率在50%～200%之間即為符合要求，該規(guī)定的誤差范圍已考慮涵蓋各種因素導(dǎo)致的誤差范圍。因此本次能力驗(yàn)證對(duì)檢測(cè)結(jié)果×的判定，以樣品指定值X的50%～200%范圍為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3統(tǒng)計(jì)量的能力評(píng)定 將檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)(由于生物測(cè)定的數(shù)據(jù)理論上是其對(duì)數(shù)值呈正態(tài)分布，故本次能力驗(yàn)證先需對(duì)檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)(lg)后，再對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析)，而后將數(shù)值用統(tǒng)計(jì)軟件JMP13處理分析，所得穩(wěn)健均值為1.076 214 3，取反對(duì)數(shù)后數(shù)值為11 918.3 EU·L-1，即1.2×104EU·L-1。故使用1.2×104EU·L-1作為本次能力驗(yàn)證樣品內(nèi)毒素含量指定值X，應(yīng)該在其的50%～200%的范圍內(nèi)，即6.0×103EU·L-1～2.4×104EU·L-1。

1.3.4結(jié)果判定原則 當(dāng)(6.0×103EU·L-1≤x≤2.4×104EU·L-1)時(shí)，結(jié)果為“滿意”；當(dāng)(x<6.0×103EU·L-1或x>2.4×104EU·L-1)時(shí)，結(jié)果為“不滿意”。

2 實(shí)驗(yàn)室參加情況

本次能力驗(yàn)證共有51家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加，其中代碼為417和718的實(shí)驗(yàn)室，在收到待測(cè)樣品后提出退出。本次能力驗(yàn)證發(fā)放樣品51份，收到49個(gè)有效數(shù)據(jù)。參加實(shí)驗(yàn)室分布于全國22個(gè)省(自治區(qū))、直轄市，主要包括藥品化妝品醫(yī)療器械(兩品一械)檢驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室、企業(yè)QC實(shí)驗(yàn)室和其他實(shí)驗(yàn)室。其中江蘇省11家實(shí)驗(yàn)室，廣東省5家實(shí)驗(yàn)室，浙江省和北京市各4家實(shí)驗(yàn)室，山東省3家實(shí)驗(yàn)室，甘肅省、河南省、吉林省、四川省和上海市各2家實(shí)驗(yàn)室，安徽省、福建省、海南省、河北省、黑龍江省、江西省、遼寧省、山西省、陜西省、新疆維吾爾自治區(qū)、天津市和重慶市各1家實(shí)驗(yàn)室。

3 結(jié)果

3.1 能力驗(yàn)證總體統(tǒng)計(jì)量本次能力驗(yàn)證檢測(cè)方法為光度測(cè)定法，將49個(gè)數(shù)據(jù)按作業(yè)指導(dǎo)書規(guī)定先取2位有效數(shù)字后，再取對(duì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果匯總統(tǒng)計(jì)量見Tab 1。

Tab 1 Summary for statistics of test result

3.2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)毒素含量檢測(cè)結(jié)果及評(píng)定參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果及評(píng)定見Tab 2。

Tab 2 Test result and evaluation of laboratories

在49家參加實(shí)驗(yàn)室中，被評(píng)定為“滿意”的共有45家，滿意比率為91.8%；被評(píng)定為“不滿意”的實(shí)驗(yàn)室有4家(實(shí)驗(yàn)室代碼分別為274，604，715和915)，不滿意比率為8.2%。

3.3 參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分布圖見Fig 1。

4 討論[8-9]

4.1 不同實(shí)驗(yàn)室類型的比較參加本次能力驗(yàn)證的49家實(shí)驗(yàn)室中，兩品一械檢驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室34家，占總參加實(shí)驗(yàn)室的70%，主要是各省、市及地方的食品藥品檢定機(jī)構(gòu)。其中32家結(jié)果為滿意，2家結(jié)果為不滿意；企業(yè)QC實(shí)驗(yàn)室9家，占總參加實(shí)驗(yàn)室的18%，結(jié)果全部為滿意；其他實(shí)驗(yàn)室6家，占總參加實(shí)驗(yàn)室的12%，其中4家結(jié)果為滿意，2家結(jié)果為不滿意。見Tab 3。

本次能力驗(yàn)證，與2017年細(xì)菌內(nèi)毒素能力驗(yàn)證參加實(shí)驗(yàn)室數(shù)量相比較，雖然總實(shí)驗(yàn)室數(shù)量下降了64%(2018年參加實(shí)驗(yàn)室共136家，其中凝膠法113家，定量法23家)，但定量法實(shí)驗(yàn)室數(shù)量卻增加了53%。表明隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展與提升，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室已逐步提升自身的檢測(cè)水平，在日常檢測(cè)樣品時(shí)，除了使用操作方便、快捷，成本低的凝膠法以外，也開始使用可以定量，且準(zhǔn)確性高的定量法。此外，采用定量法檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，多數(shù)還是兩品一械檢驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室，在企業(yè)及其他實(shí)驗(yàn)室使用則較少。

4.2 檢測(cè)方法的選擇[10-12]細(xì)菌內(nèi)毒素光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。根據(jù)檢測(cè)原理不同，濁度法和顯色基質(zhì)法還可分為動(dòng)態(tài)濁度法、終點(diǎn)濁度法、動(dòng)態(tài)顯色法和終點(diǎn)顯色法。本次能力驗(yàn)證49個(gè)參加實(shí)驗(yàn)室，有36家使用的是濁度法(全部是動(dòng)態(tài)濁度法)，占總數(shù)的73.5%；13家使用顯色法(12家是動(dòng)態(tài)顯色法，1家是終點(diǎn)顯色法)，占總數(shù)的26.5%。濁度法檢測(cè)的數(shù)據(jù)中，35家實(shí)驗(yàn)室為“滿意”結(jié)果，1家實(shí)驗(yàn)室為“不滿意”結(jié)果。顯色法檢測(cè)的數(shù)據(jù)中，10家實(shí)驗(yàn)室為“滿意”結(jié)果，3家為“不滿意”結(jié)果。

對(duì)濁度法(36家)和顯色基質(zhì)法(13家)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。首先進(jìn)行異常值檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)室代碼為274、604、715和915,4個(gè)檢測(cè)結(jié)果為異常值，見Fig 2。剔除該4個(gè)異常值后，將二者檢測(cè)結(jié)果再進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為差異無顯著性(P>0.05)，表明兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果差異無顯著性。

4.3 不滿意結(jié)果實(shí)驗(yàn)室分析[10-11]本次能力驗(yàn)證有4家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果被評(píng)為“不滿意”，對(duì)這4家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析：(1)代碼274：是本次能力驗(yàn)證中唯一一家使用終點(diǎn)顯色法的實(shí)驗(yàn)室。其標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度選擇為1 000、500、250和100 EU·L-14個(gè)點(diǎn)，所對(duì)應(yīng)的吸光度值分別為1.586、1.051、0.742、0.412。其能力驗(yàn)證樣品采用的是2倍稀釋液，所得吸光度值為3.032，該值已經(jīng)高于標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的吸光度值。表明樣品內(nèi)毒素含量未落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，故使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線外推法計(jì)算出來的數(shù)值，是不準(zhǔn)確的。從而導(dǎo)致該實(shí)驗(yàn)室提供的檢測(cè)結(jié)果4.2×103EU·L-1低于本次能力驗(yàn)證的判定下限(<6.0×103EU·L-1)，因此，評(píng)定其為“不滿意”；建議實(shí)驗(yàn)室應(yīng)調(diào)整樣品稀釋倍數(shù)或者標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，使樣品吸光度值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。(2)代碼為604、715和915：此3家實(shí)驗(yàn)室提供的《細(xì)菌內(nèi)毒素光度法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄》中，實(shí)驗(yàn)操作符合《中國藥典》通則1143中的規(guī)定，但其檢測(cè)的結(jié)果未在本次能力驗(yàn)證指定值X的50%～200%范圍內(nèi)，故評(píng)定為“不滿意”。建議實(shí)驗(yàn)室查找內(nèi)部原因，以保證日后樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

Tab 3 Evaluation of laboratory type and test results

Fig 1 Diagram of proficiency testing results of photometric method of bacterial endotoxin test

Fig 2 Outlier detection for test results

4.4 本次能力驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)的問題及建議

4.4.1未在檢驗(yàn)樣品時(shí)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線[13-15]《中國藥典》通則1143中明確規(guī)定，光度檢查法需按“光度測(cè)定法的干擾試驗(yàn)”中的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，使用系列溶液C(用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算溶液A(稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液)的每一個(gè)平行管的內(nèi)毒素濃度。即檢測(cè)樣品時(shí)，要同時(shí)制備一條不少于3個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用該標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算所測(cè)樣品的內(nèi)毒素含量。

本次能力驗(yàn)證中，有個(gè)別實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品時(shí)，僅做了陰性對(duì)照、樣品溶液和樣品陽性對(duì)照溶液，而標(biāo)準(zhǔn)曲線則是使用保存在軟件中的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算樣品內(nèi)毒素含量。由于光度測(cè)定法測(cè)定的靈敏性高，與凝膠法相比，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性更易受到實(shí)驗(yàn)環(huán)境、操作、儀器等因素的影響，故為避免系統(tǒng)誤差，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品應(yīng)在相同的實(shí)驗(yàn)條件下一起進(jìn)行制備和檢測(cè)。因此，建議實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照《中國藥典》通則1143中的規(guī)定，在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)均需要制備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，才能保證樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

4.4.2未做標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證[14]《中國藥典》通則1143中明確規(guī)定：當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)室條件有任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證是保證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提條件。

本次能力驗(yàn)證中，有個(gè)別實(shí)驗(yàn)室未做標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證。因此，建議實(shí)驗(yàn)室在使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)室條件有任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)按《中國藥典》通則1143要求先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)符合要求后，再使用該批鱟試劑進(jìn)行樣品的內(nèi)毒素檢測(cè)。

4.4.3樣品反應(yīng)時(shí)間未落到標(biāo)準(zhǔn)曲線上時(shí)的情況處理 在本次能力驗(yàn)證中，發(fā)現(xiàn)有個(gè)別實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣品的反應(yīng)時(shí)間或吸光度值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線外(樣品反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間和樣品反應(yīng)時(shí)間小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間)，實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果為儀器軟件使用標(biāo)準(zhǔn)曲線外推法計(jì)算出來的數(shù)值，不夠精確。

《中國藥典》通則1143中，雖未明確規(guī)定樣品檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間大于或小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低或最高濃度點(diǎn)時(shí)，樣品內(nèi)毒素含量應(yīng)如何計(jì)算。但從科學(xué)角度出發(fā)，當(dāng)樣品反應(yīng)時(shí)間未落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)時(shí)，結(jié)果應(yīng)按如下方式表示：(1)當(dāng)樣品反應(yīng)時(shí)間小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間或樣品的吸光度大于最高濃度點(diǎn)的吸光度時(shí)，內(nèi)毒素含量應(yīng)為樣品稀釋倍數(shù)乘以標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)所得的數(shù)值，結(jié)果表述為樣品內(nèi)毒素含量大于XX EU·L-1；(2)當(dāng)樣品反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間或樣品的吸光度小于最低點(diǎn)的吸光度時(shí)，表明樣品內(nèi)毒素含量低于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)，其內(nèi)毒素含量應(yīng)為樣品稀釋倍數(shù)乘以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)所得的數(shù)值，結(jié)果為樣品內(nèi)毒素含量小于XX EU·L-1。

若希望準(zhǔn)確測(cè)得樣品中的內(nèi)毒素含量，應(yīng)調(diào)整樣品稀釋倍數(shù)或標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，重新檢測(cè)，使樣品的反應(yīng)時(shí)間或吸光度值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。這樣操作，所檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，才會(huì)更加準(zhǔn)確與可靠。