牛依琳，肖含先之，王碧瑤，汪子鈴，王亞平，王 璐

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，干細(xì)胞與組織工程研究室，重慶 400016)

骨髓抑制是化療常見的副作用。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)可能引起造血干祖細(xì)胞受損，進(jìn)一步發(fā)展為長(zhǎng)期骨髓抑制，嚴(yán)重影響造血功能[1]。造血干細(xì)胞龕是維持造血干細(xì)胞自我更新、增殖分化的必要造血微環(huán)境，骨內(nèi)膜龕(endosteal niche)和血管龕(vascular niche)曾是公認(rèn)的兩大最重要的“龕”[2]。近年來，文獻(xiàn)報(bào)道由于骨內(nèi)膜附近有大量骨髓內(nèi)小動(dòng)脈及血竇分布，骨內(nèi)膜龕和血管龕之間存在功能上的交聯(lián)[3]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)分布在骨內(nèi)膜附近血管周圍具有成骨成脂雙向分化潛能的間充質(zhì)祖細(xì)胞群可分化形成成骨細(xì)胞系，是真正維持造血干細(xì)胞干性的“龕”——血管周龕(perivasular niche)的重要組成成分，血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞群通過分泌細(xì)胞生物活性因子如造血因子、信號(hào)分子、黏附分子等調(diào)控造血[4]。

5-FU廣泛應(yīng)用于固體腫瘤的治療，尤其是結(jié)腸癌和乳腺癌[5-6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，5-FU對(duì)骨髓有毒副作用，可導(dǎo)致骨髓基質(zhì)細(xì)胞氧化損傷[7]，但是否損傷血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞及其對(duì)造血細(xì)胞的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過Ⅱ型膠原酶消化小鼠股骨脛骨，分離出表達(dá)血管周造血龕關(guān)鍵基因Lepr、Cxcl12、Nestin，以及具有雙向分化潛能的間充質(zhì)祖細(xì)胞，旨在探究5-FU對(duì)血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞的損傷作用及其對(duì)造血支持功能的影響，為尋求減輕5-FU化療后骨髓抑制的精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)8周齡C57BL/6J小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20～25) g，重慶市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買，合格證號(hào)為SCXK (渝) 2012-0001。

1.2 主要藥品與試劑當(dāng)歸多糖(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，CYC81105)；5-FU(美國(guó)Sigma公司，F(xiàn)6627-1G)；DMEM-F12(美國(guó)Gibco公司，C11330500BT)；胎牛血清(澳大利亞MRC公司，F(xiàn)SP500)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，ab228554)；MDA試劑盒(S0131S)、SOD試劑盒(S0103)、BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)、衰老相關(guān)β-半乳糖甘酶試劑盒(C0602)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(MUBMX-90031)與成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(MUBMX-90021)購(gòu)自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司；RNAiso試劑(9109)、SYBR green I(RR420L)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)購(gòu)自日本TaKaRa生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 無菌條件下取小鼠股骨、脛骨并剪碎，用1 g·L-1Ⅱ型膠原酶于37 ℃消化骨碎片30 min，1 500 r·min-1離心消化液得到血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×108個(gè)·L-1接種于35 mm2培養(yǎng)皿中，以含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。細(xì)胞融合率達(dá)90%后，用0.25%胰酶消化傳代，取第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為兩組：對(duì)照組，即常規(guī)培養(yǎng)；5-FU組，加入0.25 g·L-15-FU作用48 h[7]。

建立共培養(yǎng)體系：無菌條件下沖取小鼠雙側(cè)股骨、脛骨骨髓，F(xiàn)icoll密度梯度離心法制備骨髓單核細(xì)胞懸液，貼壁培養(yǎng)12 h后，收集懸浮造血細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×109個(gè)·L-1與血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞飼養(yǎng)層共培養(yǎng)24 h。

1.3.2血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞鑒定 經(jīng)上述方法得到血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞，體外培養(yǎng)至第3代，提取DNA，配制2%瓊脂糖溶液進(jìn)行凝膠電泳分析。

1.3.3臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù) 分別收集兩組造血細(xì)胞和血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)(1 ∶10)染色2 min，在3 min內(nèi)完成活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.4CCK-8法檢測(cè)血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞增殖 取第3代血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞，以3×103/孔的細(xì)胞密度接種在96孔板中，待融合率達(dá)90%后，加入0.25 g·L-15-FU分別作用24，48，72和96 h，再加入20 μL/孔 CCK-8工作液，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率(VR)/%=[(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/ (OD對(duì)照組-OD空白組)]×100%。

1.3.5細(xì)胞衰老相關(guān)SA-β-Gal染色 按照試劑盒說明，分別對(duì)兩組造血細(xì)胞和血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞進(jìn)行衰老染色：PBS清洗細(xì)胞后，加入染色固定液固定15 min，去除固定液，再次PBS清洗細(xì)胞，按說明書配制染色工作液，于37 ℃水浴箱中孵育8 h。光鏡下每組隨機(jī)觀察不同視野中至少1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染色陽性率。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞凋亡 0.25%胰酶分別消化兩組血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞，PBS清洗并離心收集于1.5 mL EP管中，每管加入0.5 mL PBS 重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC,4 ℃避光孵育10 min,用PI復(fù)染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.7氧化指標(biāo)檢測(cè) 分別收集血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞和共培養(yǎng)的造血細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后收集上清液，按照試劑盒說明，分別檢測(cè)兩組細(xì)胞中脂質(zhì)氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD水平。

1.3.8血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞成骨潛能檢測(cè) 血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞以2×105/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，5-FU作用48 h后，PBS清洗培養(yǎng)基，加入2 mL成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2 d避光換液，14 d后用4%多聚甲醛固定并進(jìn)行茜素紅染色。觀察拍照后，以100 μL/孔異丙醇溶解茜素紅染液，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度值以便定量分析。

1.3.9血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞成脂潛能檢測(cè) 血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞以2×105/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，5-FU作用48 h后，PBS清洗培養(yǎng)基，加入2 mL成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液，48 h后更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液培養(yǎng)24 h，A、B液交替培養(yǎng)20 d后，用4%多聚甲醛固定并進(jìn)行油紅O染色。觀察拍照后，以100 μL/孔異丙醇溶解油紅O染液，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度值以便定量分析。

1.3.10qRT-PCR檢測(cè) 用TRIzol試劑分別提取兩組血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞和造血細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明制備cDNA，SYBR II染料法進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCT方法定量計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化基因。引物序列見Tab 1。

Tab 1 A detailed list of primer sequences,species,genebank numbers and PCR product lengths used in Realtime RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，體外分離培養(yǎng)細(xì)胞Lepr、CXCL12、Nestin基因和成骨相關(guān)基因OPN、RUNX2均有高表達(dá)，成脂相關(guān)基因PPARγ表達(dá)較弱，符合血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞特征，見Fig 1。

Fig 1 Perivascular hematopoietic niche-related gene expression of perivascular mesenchymal progenitor cells identified by agarose gel electrophoresis

2.2 5-FU抑制血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞增殖臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，結(jié)果顯示，5-FU組活細(xì)胞數(shù)為(0.73±0.06)×106,明顯低于對(duì)照組(1.36±0.08)×106，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(Fig 2A)。以0.25 g·L-15-FU作用血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞24、48、72、96 h 后，采用CCK-8法檢測(cè)5-FU對(duì)血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，作用48 h后，5-FU明顯抑制細(xì)胞增殖(P<0.01)(Fig 2B)。特異性β-半乳糖苷酶染色后觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)算衰老細(xì)胞陽性率，結(jié)果顯示，5-FU組細(xì)胞變圓體積變大，衰老陽性率明顯增加(Fig 2C,D)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，LR代表早期凋亡細(xì)胞，UR代表晚期凋亡細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5-FU作用后細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)(Fig 2E，F(xiàn))。以上結(jié)果提示，5-FU對(duì)血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞有毒性作用，抑制細(xì)胞增殖。

2.3 5-FU抑制血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞成骨分化潛能MDA和SOD檢測(cè)結(jié)果顯示(Tab 2)，5-FU組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物MDA水平明顯升高(P<0.05)，而抗氧化酶SOD水平明顯降低(P<0.01)，提示5-FU損傷血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞抗氧化能力。進(jìn)一步分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，檢測(cè)受損血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞雙向分化潛能的變化。茜素紅染色和油紅O染色結(jié)果顯示，5-FU組血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞成骨結(jié)節(jié)明顯減少，脂滴數(shù)量明顯上升；酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值定量分析結(jié)果與其趨勢(shì)一致(Fig 3A-3D)。進(jìn)一步檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果表明，5-FU處理明顯降低血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞中Osterix、RUNX2和OPN成骨基因mRNA合成(Fig 4)。以上結(jié)果提示，5-FU誘發(fā)的氧化損傷可抑制血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞成骨分化潛能。

Fig 2 Perivascular mesenchymal progenitor cells apoptosis and premature senescence induced by 5-FU n=3)

Tab 2 Effect of 5-FU on MDA and SOD of perivascular

2.4 5-FU抑制血管周造血龕功能干細(xì)胞因子(SCF)、趨化配體12(CXCL12)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是重要的造血因子，具有促進(jìn)造血干細(xì)胞自我更新以及正向調(diào)控造血功能。如Fig 5，5-FU作用后，SCF、CXCL12和G-CSF基因表達(dá)明顯降低。血管生成素1/酪氨酸激酶2(Ang-1/tie 2)，血小板生成素及其受體(TPO/MPL)和Jagged-1/Notch參與維持造血干細(xì)胞靜止，是造血干細(xì)胞龕重要的信號(hào)調(diào)控分子。黏附分子血管細(xì)胞黏附分子/晚期抗原4(VCAM-1/VLA-4)和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)蛋白/細(xì)胞間黏附分子1(LFA-1/ICAM-1)促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞與造血干/祖細(xì)胞相互作用，協(xié)助造血干/祖細(xì)胞黏附于有利的造血微環(huán)境，參與調(diào)控造血干/祖細(xì)胞增殖分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了Jagged-1/Notch信號(hào)分子表達(dá)無明顯改變，5-FU可明顯降低血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞和共培養(yǎng)的造血細(xì)胞之間信號(hào)分子對(duì)和黏附分子對(duì)基因轉(zhuǎn)錄(Fig 6，7)。上述結(jié)果提示，5-FU損傷血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞，削減骨髓血管周龕支持造血的功能。

2.5 血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞損傷誘發(fā)造血細(xì)胞應(yīng)激性衰老在血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞飼養(yǎng)層與造血細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與5-FU組飼養(yǎng)層共培養(yǎng)的造血細(xì)胞數(shù)明顯減少(Fig 8A)。衰老特異性SA-β-Gal染色結(jié)果顯示，5-FU共培養(yǎng)組造血細(xì)胞衰老陽性率升高(Fig 8B，C)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步檢測(cè)造血細(xì)胞胞內(nèi)抗氧化酶SOD和脂質(zhì)氧化物MDA水平，結(jié)果提示，5-FU飼養(yǎng)層削弱共培養(yǎng)造血細(xì)胞抗氧化能力(Tab 3)。綜上所述，5-FU損傷間充質(zhì)祖細(xì)胞構(gòu)成的血管周造血龕，受損的造血微環(huán)境可能導(dǎo)致造血細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，發(fā)生應(yīng)激性衰老。

Fig 3 Osteogenic/adipogenic differentiation balance of perivascular mesenchymal progenitor cells destroyed by n=3)

Tab 3 Effect of 5-FU on MDA and SOD of

Fig 4 Analysis of mRNA expression of osteogenic related factors in perivascular mesenchymal progenitors n=3)

Fig 5 Analysis of mRNA expression of hematopoietic related factors in perivascular mesenchymal progenitors n=3)

Fig 6 Analysis of mRNA expression of signal factors between perivascular mesenchymal progenitor cells and hematopoietic cells n=3)

Fig 7 Analysis of mRNA expression of adhesion molecules between perivascular mesenchymal progenitor cells and

Fig 8 Injuryed hematopoietic microenvironment caused cytopenia and senescence of co-cultured hematopoietic n=3)

3 討論

化療藥物的細(xì)胞毒性、干細(xì)胞移植的骨髓排斥反應(yīng)、細(xì)胞黏附介導(dǎo)的耐藥是化療后造血功能障礙的研究熱點(diǎn)。造血干細(xì)胞儲(chǔ)備減少和自我更新缺陷是導(dǎo)致化療后長(zhǎng)期骨髓抑制的主要原因，通常與造血微環(huán)境損傷密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，除了內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的血管龕外，骨髓血竇和小動(dòng)脈周圍的血管周間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的血管周龕起到促進(jìn)造血干細(xì)胞維持，支持造血干/祖細(xì)胞活性的主要作用。血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞靠近干骺端骨小梁的骨表面，具有成骨和成脂分化潛能，其中成骨分化產(chǎn)生的成骨細(xì)胞系可遷移到骨內(nèi)膜，和新形成的小梁骨一起形成造血干細(xì)胞生存的主要微環(huán)境[8]。

長(zhǎng)期化療可能損害造血微環(huán)境導(dǎo)致骨髓脂肪化。大量研究表明,在小鼠骨髓不同區(qū)域，脂肪細(xì)胞數(shù)量與造血干細(xì)胞數(shù)量、活性呈反比；隨年齡增長(zhǎng)脂肪在人骨髓中堆積，引起骨質(zhì)疏松、造血微環(huán)境功能受損，其機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)[9]。課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，5-FU導(dǎo)致骨髓基質(zhì)細(xì)胞偏向成脂分化，其機(jī)制可能與氧化損傷有關(guān)[10]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，5-FU削弱骨髓血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞抗氧化能力，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡和衰老，造血龕成骨/成脂分化潛能失衡。文獻(xiàn)表明，成骨分化離不開RUNX2及其下游基因Osterix的表達(dá)[11]；Stier等[12]通過結(jié)合外源性O(shè)PN和OPN缺陷小鼠的研究證實(shí)OPN對(duì)于維持造血干/祖細(xì)胞數(shù)量和功能的重要性。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)5-FU處理后血管周圍間充質(zhì)祖細(xì)胞形成骨結(jié)節(jié)減少，并且成骨相關(guān)因子RUNX2、osterix和OPN的表達(dá)明顯降低；相反誘導(dǎo)分化的脂滴形成增加，提示造血龕的骨分化潛能受損。

血管周龕中，血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞分泌多種可溶性因子，并通過各種信號(hào)分子和黏附分子與造血細(xì)胞相互作用，共同調(diào)控造血。SCF和CXCL12是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞自我更新和增殖定居的重要細(xì)胞因子，主要由血管周圍間充質(zhì)祖細(xì)胞，即Nestin+、Lepr+或Prx-1+的CAR細(xì)胞(高表達(dá)CXCL12的網(wǎng)狀細(xì)胞)表達(dá)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細(xì)胞與造血干細(xì)胞間信號(hào)分子Ang-1/tie 2,TPO/MPL 和 Jagged-1/Notch 參與造血調(diào)控：Ang-1/Tie2信號(hào)通路可以使造血干細(xì)胞黏附于骨內(nèi)膜附近，維持造血干細(xì)胞的功能[13]，造血干細(xì)胞表達(dá)的Tie2維持造血干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)[14]；TPO及其受體MPL是造血干細(xì)胞和巨核細(xì)胞的主要調(diào)控因子，造血干細(xì)胞中MPL的表達(dá)有利于保持造血干細(xì)胞長(zhǎng)期自我更新的能力[15]；Notch途徑是維持長(zhǎng)期造血干細(xì)胞(LT-HSCs)自我更新的重要分子，強(qiáng)化Notch1以及Notch4能夠增強(qiáng)造血干細(xì)胞的自我更新能力，并抑制分化[16]。有報(bào)道表明骨內(nèi)膜基質(zhì)成骨細(xì)胞系表達(dá)黏附分子與造血干細(xì)胞表面的對(duì)應(yīng)分子結(jié)合調(diào)控造血干細(xì)胞：ICAM-1和VCAM-1調(diào)控造血干細(xì)胞增殖；此外，條件性敲除造血細(xì)胞的黏附分子VLA-4或VCAM-1,可以有效地抑制造血干細(xì)胞的遷移以及在骨髓腔內(nèi)的定居[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，5-FU誘導(dǎo)血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞氧化損傷，削弱其成骨分化潛能，從而下調(diào)了重要的造血因子、細(xì)胞間信號(hào)分子及黏附分子轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)重?fù)p傷血管周龕功能。

高氧造血微環(huán)境無疑對(duì)造血細(xì)胞有損傷作用。為了闡明功能失調(diào)的血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞對(duì)造血細(xì)胞的直接調(diào)控作用，本研究進(jìn)一步以血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞為飼養(yǎng)層，建立共培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)證實(shí)血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞的損傷導(dǎo)致造血細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除能力降低，造血細(xì)胞中脂氧化物水平升高，并且出現(xiàn)衰老征象。這與課題組前期研究結(jié)果一致，5-FU處理后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HS-5細(xì)胞Cx43縫隙連接蛋白的表達(dá)水平降低[6]。

綜上所述，5-FU可導(dǎo)致骨髓血管周龕間充質(zhì)祖細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，成骨/成脂分化失衡，進(jìn)一步減少造血細(xì)胞因子分泌、下調(diào)與造血細(xì)胞間黏附作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響血管周龕的造血支持功能，間接引起造血細(xì)胞應(yīng)激性早衰。但造血微環(huán)境損傷誘導(dǎo)造血細(xì)胞應(yīng)激性衰老的確切機(jī)制尚不清楚，本課題組將在后續(xù)工作中進(jìn)一步探究。