史嘉翊 宋旭東 初文竹 邱羽菲 潘 宇 曹志琴 吳 丹

(1 牡丹江醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江 牡丹江 157011 2 牡丹江醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院 黑龍江 牡丹江 157011)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟損傷后進(jìn)行自我修復(fù)過程中的一種反應(yīng)，主要表現(xiàn)為在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)的累積后形成瘢痕。肝纖維化在早期階段是一種對肝損傷的自我愈合和修復(fù)，但長期的肝纖維化最終可能會(huì)演變?yōu)楦斡不?，伴隨著一系列并發(fā)癥的出現(xiàn)，比如腹水，消化道出血，肝性腦病，最嚴(yán)重的將演變成肝癌。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β TGFβ1)是一類重要的細(xì)胞因子，它參與了生命體的分化和調(diào)節(jié)，研究證實(shí)TGFβ1是導(dǎo)致肝纖維化最主要的因子。

潛肽相關(guān)肽LAP(latent assotiated peptide)與TGFβ1以非共價(jià)鍵結(jié)合形成沒有活性的潛態(tài)復(fù)合物，LAP位于復(fù)合物的N端。當(dāng)復(fù)合物被釋放到細(xì)胞外時(shí)，在整合素或者蛋白酶等的作用下，將LAP斷裂，釋放出具有活性的TGF-β1[1]。LAP從而具有競爭抑制TGF-β1活性從而具有抑制肝纖維化的能力。本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了全長和截?cái)嘈蛢煞NLAP，分別命名為LAP-F與LAP-B，并進(jìn)行了表達(dá)純化。對考察其對人肝臟細(xì)胞LX-2增殖的影響，考察其細(xì)胞毒性，是否具有可以成為抗纖維化的新型蛋白藥物的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

LAP-F與LAP-B重組質(zhì)粒， LX-2細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)

1.2 主要試劑與儀器

蛋白胨、酵母提取物(Oxoid); 氯化鈉(Solarbio); 苯甲基磺酰氟(PMSF)(Thermo Scientific); 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(biofroxx);鎳親和層析柱(上海凱杰生物有限公司); 咪唑(Imidazole)(Solarbio) 蛋白分子量Marker (Bio-rad); DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清(HyClone); MTT試劑(Solarbio);恒溫?fù)u床、離心機(jī)(Eppendorf); 倒置生物顯微鏡(Olympus); 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)。

1.3 方法

1.3.1 LAP-F和LAP-B蛋白表達(dá)純化

本課題組前期已經(jīng)構(gòu)建了LAP-F和LAP-B原核表達(dá)載體C43-pET28a/LAP-F和C43-pET28a/LAP-B[2]。選取大腸桿菌C43-pET28a/LAP-F和大腸桿菌C43-pET28a/LAP-B菌落中的一個(gè)在400mL滅菌LB培養(yǎng)基中于37℃劇烈震蕩，至OD600≈0.6的密度下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將菌液按1:200的比例轉(zhuǎn)接入1000mL滅菌LB培養(yǎng)基中，為了高效表達(dá)目的蛋白，在16℃下我們加入終濃度為0.2mM的isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 作用16小時(shí)， 4℃，4500rpm離心15min收集菌體。在冰上超聲處理重懸菌液，并于4℃下12000rpm離心40min分離破碎菌體和上清液，并采用固化金屬親和層析純化上清液中的可溶性LAP-F和LAP-B蛋白。最終的LAP-F和LAP-B產(chǎn)物于4℃下在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行透析，并通過過濾除菌。蛋白質(zhì)的表達(dá)采用SDS-PAGE。

1.3.2 人類肝星狀細(xì)胞(LX-2)的培養(yǎng)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)

1.3.21 細(xì)胞培養(yǎng)

將LX-2細(xì)胞凍存管從液氮中取出并放入水浴鍋中迅速解凍。以下操作皆在生物安全柜中進(jìn)行，將細(xì)胞懸液移至離心管中。800 rpm離心5 min后棄掉凍存液，加入1 mL培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸加入培養(yǎng)瓶，之后加入培養(yǎng)基。CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)LX-2細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底約80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。棄去瓶中的原培養(yǎng)基， PBS緩沖液清洗二次。加入適量胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞。顯微鏡下觀察，當(dāng)貼壁細(xì)胞原有形態(tài)消失且即將脫落則立即加入1 mL培養(yǎng)基終止消化。室溫下800 rpm離心5 min。棄去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。移至新的培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基。放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 MTT法檢測蛋白對細(xì)胞的毒性

細(xì)胞經(jīng)過消化、離心、重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。接種細(xì)胞至96孔板中，每孔100 μL培養(yǎng)基含細(xì)胞約5000個(gè)，空白孔中加入等體積PBS緩沖液。96孔板置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行給藥。分組如下：1)control組：正常培養(yǎng)。2)不同濃度的LAP-F組：不同濃度LAP-F(5μg/mL, 10μg/mL, 20μg/mL, 40μg/mL, 80μg/mL, 160 μg/mL, 320μg/mL)加入細(xì)胞中進(jìn)行干預(yù)。經(jīng)24 h后向每孔中加入20 μL的MTT溶液在避光的條件下，之后繼續(xù)培養(yǎng)4h。將96孔板倒置于濾紙上，棄掉孔中液體。向各孔中加入DMSO溶液150 μL。置于避光的搖床上振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測OD490 nm處的吸光度，記錄結(jié)果并進(jìn)行分析。3)不同濃度的LAP-B組，不同濃度LAP-B(5μg/mL, 10μg/mL, 20μg/mL, 40μg/mL, 80μg/mL, 160 μg/mL, 320μg/mL)加入到細(xì)胞中進(jìn)行干預(yù)。經(jīng)24 h后向每孔中加入20 μL的MTT溶液在避光的條件下，之后繼續(xù)培養(yǎng)4h。將96孔板倒置于濾紙上，棄掉孔中液體。向各孔中加入DMSO溶液150 μL。置于避光的搖床上振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測OD490 nm處的吸光度，記錄結(jié)果并進(jìn)行分析。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 8.0軟件，每組數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用分析方法進(jìn)行單因素方差分析。當(dāng)p值低于0.05時(shí)，數(shù)據(jù)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAP-F和LAP-B蛋白純化

LAP-F和LAP-B蛋白使用Ni親和層析柱進(jìn)行純化。含his標(biāo)簽的重組LAP-F和LAP-B蛋白可以穩(wěn)定結(jié)合Ni-NTA瓊脂糖，大部分雜蛋白和非特異性結(jié)合蛋白通過Buffer A-C清洗去除。目的蛋白采用含高濃度咪唑的Buffer D進(jìn)行洗脫。SDS-PAGE結(jié)果表明LAP-B蛋白表達(dá)量明顯高于LAP-F蛋白(圖1)。

圖1 LAP-F和LAP-B蛋白的純化(1，LAP-F破碎菌液；2，LAP-F離心后上清；3，LAP-F離心后沉淀；4，LAP-F洗脫產(chǎn)物；M，蛋白marker；1，LAP-B破碎菌液5-8，；2，LAP-B離心后上清；3，LAP-B離心后沉淀；4，LAP-B洗脫產(chǎn)物)

2.2 LAP-F和LAP-B對 LX-2細(xì)胞增殖的影響

為了探討LAP-F和LAP-B蛋白是否具有細(xì)胞毒性，課題組利用MTT法探討了LAP-F和LAP-B蛋白對LX-2細(xì)胞增值的影響。將LX-2細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組進(jìn)行鋪板，按設(shè)計(jì)分組加入不同濃度的LAP-F和LAP-B蛋白(5μg/mL, 10μg/mL, 20μg/mL, 40μg/mL, 80μg/mL, 160 μg/mL, 320μg/mL)。24 h后用檢測吸光度，并計(jì)算細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，與對照組比較，不同濃度的LAP-F和LAP-B蛋白未對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，表明兩種蛋白在以上濃度內(nèi)均不具有細(xì)胞毒性(圖2，圖3)。

圖2 LAP-F對LX-2細(xì)胞增殖的影響

圖3 LAP-B對LX-2細(xì)胞增殖的影響

3 討論

肝臟在慢性病毒或者自身的免疫炎癥的作用下，如不及時(shí)進(jìn)行治療和控制，將逐漸形成肝纖維化，當(dāng)肝纖維化進(jìn)展到肝硬化的程度，病情將不可逆，同時(shí)干細(xì)胞也失去了其主要的功能。肝纖維化過程中，比較重要的一種因子是TGF-β1。在組織的纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中起到了重要作用，它可以促進(jìn)HSC的活化，通過刺激肌成纖維細(xì)胞合成同時(shí)分泌出ECM，從而導(dǎo)致人肝臟星狀細(xì)胞LX-2的纖維化。前期的研究證實(shí)，前體的狀態(tài)不具有與受體的結(jié)合的能力，它只有在改變離子強(qiáng)度、蛋白酶水解或者pH值的改變使LAP從TGF-β前體上游離下來，才能形成具有功能的TGF-β1，再與靶細(xì)胞表面的特異性激酶受體結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)以激活TGF-β1的生物活性。而LAP同時(shí)也因具有RGD序列，使得整合素可以與其結(jié)合來調(diào)節(jié)TGF-β1的激活[3]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩種LAP蛋白，一個(gè)是全長的LAP-F蛋白，另外一個(gè)是截?cái)嘈偷腖AP-B蛋白。LAP-F和LAP-B兩種蛋白可以通過競爭抑制來調(diào)節(jié)TGF-β1激活，從而探討他們的抑制肝細(xì)胞纖維化的能力。

通過原核表達(dá)載體，我們成功純化出兩種可溶蛋白，LAP-F和LAP-B，同時(shí)LAP-B的表達(dá)量高于LAP-F。為了檢測兩種蛋白的安全性，我們利用MTT實(shí)驗(yàn)分別對兩種蛋白的毒性進(jìn)行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不斷地增加劑量后，兩種蛋白依然無法對LX-2細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，這提示我們LAP-F和LAP-B兩種蛋白不具有細(xì)胞毒性。這提示我們這兩種蛋白，尤其是LAP-B在以后對于蛋白藥物的開發(fā)和利用上具有明顯優(yōu)勢，具有很好的應(yīng)用前景。

綜上所述，通過競爭抑制的思路，我們找到一種LAP是可以調(diào)節(jié)TGF-β1激活的蛋白，期望其具有對肝纖維化進(jìn)行治療的效果。實(shí)驗(yàn)室前期通過構(gòu)建原核表達(dá)的載體，通過不斷地摸索，獲得純化出兩種蛋白的最高產(chǎn)條件。純化出了兩種具有抗纖維化價(jià)值的蛋白類藥物L(fēng)AP-F和LAP-B，本研究結(jié)果顯示截?cái)囿wLAP-B比LAP-F的產(chǎn)量更高，會(huì)有更好的利用前景。接下來將對兩種蛋白進(jìn)行進(jìn)一步更深入的抗纖維化能力研究，以及更明確的機(jī)制研究，為新型的抗纖維化蛋白藥物的開發(fā)提供新的思路。