楊志城，孫彩虹，葉 冠

（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院，上海 201203）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid Arthritis，RA）［1］是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要特征的自身免疫病，其病理基礎(chǔ)是滑膜炎，初期患者表現(xiàn)為關(guān)節(jié)晨僵、腫脹、疼痛等，控制不當(dāng)后期可發(fā)生關(guān)節(jié)畸形，并喪失關(guān)節(jié)正常的功能，《金匱要略》中將類似病癥命名為“厲節(jié)風(fēng)”［2］?，F(xiàn)有研究成果如圖1所示，目前因RA所致疼痛治療方法多以臨床護(hù)理為主而缺乏確切藥物［3］。中醫(yī)藥［4-6］在長(zhǎng)期RA治療實(shí)踐中已積累了豐富臨床經(jīng)驗(yàn)，藥物以療效確切、毒副作用低、應(yīng)用方便和價(jià)格適宜等因素受到臨床醫(yī)生和患者青睞。然中醫(yī)藥抗RA、緩解疼痛的作用機(jī)制尚未得到很好揭示，故而亟待療效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的挖掘，為贏得患者信任及市場(chǎng)推廣提供支持。

瘀血痹膠囊由當(dāng)歸、丹參、乳香（炙）、沒藥（炙）、威靈仙、紅花、川牛膝、川芎、姜黃、香附（炙）、黃芪（炙）11味中藥組成，具有活血化瘀，通絡(luò)止痛的功效，臨床上用于RA，并可有效改善RA患者疼痛情況。截至目前，鮮有直接針對(duì)瘀血痹膠囊治療RA及鎮(zhèn)痛的活性成分研究報(bào)道［4，7-8］，故本研究基于已有瘀血痹膠囊組方中藥物成分研究報(bào)道，探究其抗RA、鎮(zhèn)痛活性成分和作用機(jī)理，對(duì)于該藥物后續(xù)研究及臨床推廣應(yīng)用有重要的參考價(jià)值。VOSviewer關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類視圖見圖1。

圖1 VOSviewer關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類視圖

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)軟件庫(kù)及分析TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genecards.org）；UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）；Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.bioconductor.org）；Enrich數(shù)據(jù)庫(kù)（https://maayanlab.cloud/Enrichr/enrich）；DAVID數(shù) 據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）；R3.6.3、Cytospase 3.7.2、Discovery studio 2019。

1.2 化學(xué)成分的收集與篩選 采用中藥系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）分析平臺(tái)，以瘀血痹膠囊組方每味藥物中文名進(jìn)行檢索，對(duì)中藥成分進(jìn)行收集整理。以口服生物利用度（OB）≥30%、藥物類藥性（DL）≥0.18的活性成分納入后續(xù)研究。

1.3 靶點(diǎn)收集和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過TCMSP平臺(tái)收集活性成分的作用靶點(diǎn)，靶點(diǎn)名稱輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以“Rheumatoid arthritis”“Pain”為檢索關(guān)鍵詞在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲得與RA、疼痛（Pain）相關(guān)的靶點(diǎn)，取兩者共有靶點(diǎn)為疾病靶點(diǎn)。將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)整合繪制韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)和復(fù)方藥物-活性成分-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析 將得到的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”進(jìn)行檢索，分析靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用（combined_score）；將交互作用的最小閾值設(shè)置為“medium confidence=0.4”，網(wǎng)絡(luò)類型選擇“full string network”，隱藏不連接的點(diǎn)，核心靶點(diǎn)用于繪制PPI圖。將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的靶點(diǎn)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，獲得蛋白相互作用關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)（基因）。根據(jù)節(jié)點(diǎn)獲得每個(gè)靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)互相作用，得到藥物作用排名前10的關(guān)鍵基因。

1.5 GO分析 將根據(jù)degree值篩選到的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析。GO可分為分子功能、生物過程和細(xì)胞組成三個(gè)部分。本研究對(duì)分子功能、生物過程和細(xì)胞組成三部分進(jìn)行可視化分析，得到瘀血痹膠囊潛在抗RA靶點(diǎn)、緩解疼痛與其對(duì)應(yīng)的GO條目之間的相互關(guān)系。

1.6 KEGG分析 將篩選到的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG（Gene and Genomics Encyclopedia）分析。KEGG是較常用且資料全面的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)。為研究瘀血痹膠囊治療RA、緩解疼痛的機(jī)理，本研究對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集，獲取瘀血痹膠囊發(fā)揮作用的相關(guān)信號(hào)通路，分析其可能起效機(jī)制。

1.7 分子對(duì)接 將排名前十的核心化合物與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。受體前處理：去原配體、去除溶劑、補(bǔ)充氨基酸殘基等。配體前處理：加氫及合適的電荷。選擇晶體結(jié)構(gòu)中配體所在的位置作為結(jié)合位點(diǎn)（無(wú)原配體的晶體則采用預(yù)測(cè)位點(diǎn)），選擇距離該位點(diǎn)一定半徑內(nèi)的球集為活性結(jié)合位點(diǎn)。采用LibDockScore評(píng)價(jià)小分子化合物與蛋白靶點(diǎn)的親和力大小，其得分值越高，則親和力越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘀血痹膠囊潛在活性成分篩選 共檢索瘀血痹膠囊有效成分1 449個(gè)，以O(shè)B≥30%及DL≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，去除無(wú)相關(guān)作用靶點(diǎn)以及重復(fù)化合物，最終獲得潛在活性成分128個(gè)。

2.2 瘀血痹膠囊抗RA、鎮(zhèn)痛靶點(diǎn) 共檢索瘀血痹潛在作用靶點(diǎn)11 504個(gè)，與潛在活性化合物進(jìn)行交集檢索、去重，獲得124個(gè)不重復(fù)靶點(diǎn)。共檢索得RA靶點(diǎn)4 465個(gè)、疼痛靶點(diǎn)12 423個(gè)，兩者共有靶點(diǎn)2 985個(gè)。將瘀血痹膠囊124個(gè)成分作用靶點(diǎn)與共有靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析，得到85個(gè)化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，初步預(yù)測(cè)交集靶點(diǎn)為瘀血痹膠囊抗RA、鎮(zhèn)痛的靶點(diǎn)（見圖2）。

圖2 瘀血痹膠囊活性成分、抗RA、鎮(zhèn)痛交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 活性成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytospase 3.7.2軟件構(gòu)建“瘀血痹膠囊活性成分-共有靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”后，通過network analyzer功能對(duì)該互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，以成分作用靶點(diǎn)個(gè)數(shù)為指標(biāo)排序，結(jié)果見表1，共有成分可能為瘀血痹膠囊復(fù)方藥物抗RA及鎮(zhèn)痛的主要活性成分。

表1 活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)及歸屬藥味（前10）

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及潛在靶點(diǎn)篩選 基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得瘀血痹膠囊抗RA及鎮(zhèn)痛85個(gè)共有靶點(diǎn)蛋白的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，圖3為該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)圖中相互作用前30的靶點(diǎn)圖。導(dǎo)出該網(wǎng)絡(luò)圖的tsv文件至Cytoscape軟件，根據(jù)degree＞中位數(shù)篩選出潛在核心靶點(diǎn)，構(gòu)建潛在核心靶點(diǎn)PPI圖，見圖4，其中前10位靶點(diǎn)依次為：IL6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC、CCND1、ESR1、FOS。分析可得核心靶點(diǎn)與炎癥（IL6）、表皮、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)（VEGFA、EGFR、ESR1）、白蛋白（ALB）、細(xì)胞增殖、凋亡、分化（CASP3、MAPK8、MYC、CCND1、ESR1、FOS）等領(lǐng)域相關(guān)。

圖3 瘀血痹膠囊抗RA、鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)PPI強(qiáng)度排序

圖4 瘀血痹膠囊抗RA、鎮(zhèn)痛潛在核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 生物功能（GO）分析 通過R語(yǔ)言軟件“ClusterProfiler”軟件包將前46個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析，并繪制濃縮圖（Enrichment Map，見圖5）及有向無(wú)環(huán)圖（Directed Acyclic Graph，見圖6），瘀血痹膠囊主要通過調(diào)節(jié)頂端過程為受體活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、分子功能、DNA結(jié)合調(diào)控區(qū)、核心啟動(dòng)子近端區(qū)DNA結(jié)合，底端過程為類固醇結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)異二聚化活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核酸結(jié)合、細(xì)胞核受體活性等生物過程從而發(fā)揮抗RA、鎮(zhèn)痛作用，由濃縮圖結(jié)果可看出GO term主要集中于受體活性以及信號(hào)傳遞過程。

圖5 瘀血痹膠囊抗RA、鎮(zhèn)痛GO富集濃縮圖

圖6 瘀血痹膠囊抗RA、鎮(zhèn)痛GO富集有向無(wú)環(huán)圖

2.6 瘀血痹膠囊抗RA、鎮(zhèn)痛核心通路篩選 生物功能富集結(jié)果顯示瘀血痹膠囊活性成分可參與機(jī)體生物過程，然具體通路還不明確。繪制通路-靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)圖，結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示瘀血痹膠囊發(fā)揮抗RA、鎮(zhèn)痛與炎癥、血管、免疫等通路相關(guān)，如PI3K-Akt通路、TNF信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化皰疹病毒感染、巨細(xì)胞病毒感染、神經(jīng)退行性疾病-多種疾病、MAPK信號(hào)通路等，通路-靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)分析顯示體現(xiàn)出多靶點(diǎn)的協(xié)同作用抑或同一個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)多條通路，同時(shí)調(diào)節(jié)多種酶蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，起到多通路共同參與疾病治療 作 用，其 中IL6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、CASP9、MAPK8、MYC、CCND1、ESR1、CTNNB1、FOS等靶點(diǎn)對(duì)前5條目標(biāo)作用通路貢獻(xiàn)最大，見圖8。

圖7 瘀血痹膠囊抗RA、鎮(zhèn)痛通路中靶點(diǎn)分布圖

圖8 瘀血痹膠囊抗RA、鎮(zhèn)痛KEGG通路分析弦圖

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 選取排名前10的核心基因進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，分別為IL6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC、CCND1、ESR1、FOS。分子對(duì)接結(jié)果如下表2所示，由表2可知核心化合物與IL6對(duì)接活性最好，其次為ALB、VEGFA、CASP3、EGFR、MAPK8等靶點(diǎn)；β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、7-O-甲基異鼠李糖醇、木犀草素、異鼠李素、鞣花酸等核心化合物與各核心靶點(diǎn)對(duì)接分?jǐn)?shù)較高（對(duì)接平均值均＞100）。圖9為部分化合物與差異基因?qū)幽Ｊ綀D舉例。

圖9 部分對(duì)接模式圖

表2 瘀血痹膠囊核心化合物與核心靶點(diǎn)結(jié)合得分值（已按照平均得分值排序）

3 討論

現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，槲皮素在治療RA過程中，具有抗炎［9-10］、抑制血管翳生成［9，11］、滑膜增生［12-13］、中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)產(chǎn)生［14-16］、調(diào)節(jié)破骨/成骨Th17/Treg平衡［17-19］等作用，臨 床 研究［20］顯示其抗RA、鎮(zhèn)痛效果顯著。木犀草素［21-22］參與調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中JNK與p38蛋白及激活蛋白-1（AP-1）與NF-κB，減少M(fèi)MP-1、MMP-3的分泌和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（TGF-α）與IL-6的表達(dá)，抑制RASF增殖，干擾RA滑膜基質(zhì)降解及炎癥過程。山柰酚［23-25］可抑制原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)移、入侵、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組及MMP表達(dá)，從而發(fā)揮關(guān)節(jié)保護(hù)作用，且可抑制炎癥過程中TLR4/NF-κB通路，減弱Caspase-8、Caspase-3和NLRP1/NLRP3炎癥小體的活性，降低或阻止炎性因子的產(chǎn)生，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。β-谷甾醇［26-27］可平衡M1/M2減緩類風(fēng)濕性炎癥以及抑制炎癥小體NLRP3的激活，進(jìn)而抑制CAS1的產(chǎn)生及參與MAPK信號(hào)通路的活化，導(dǎo)致細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8生成顯著減少，從而起到抗炎鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，瘀血痹膠囊通過多成分-多靶點(diǎn)、多生物過程-多途徑發(fā)揮抗RA以及緩解RA所致疼痛的功效，成分-靶點(diǎn)-GO、KEGG分析結(jié)果顯示，瘀血痹膠囊主要通過抗炎、調(diào)節(jié)激素分泌、受體活性、信號(hào)傳遞等途徑實(shí)現(xiàn)抗RA、緩解疼痛的治療作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析瘀血痹膠囊在治療RA、緩解疼痛的作用機(jī)制，為瘀血痹膠囊治療RA、緩解疼痛提供一定的理論依據(jù)。

2張濤.治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的幾點(diǎn)體會(huì)［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)雜志，2005，3（6）：371-371.