陳運(yùn)庭，王睿雯，麥明志，楊國通

(三亞市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,三亞 572000)

矽肺病是吸入大量二氧化硅引起的一種臨床常見病，也是患者因工作長期處于粉塵污染下的環(huán)境而導(dǎo)致的一種職業(yè)病，二氧化硅粉塵可使肺部形成廣泛的結(jié)節(jié)，引發(fā)不可逆的肺組織損傷，嚴(yán)重減退肺功能，減弱患者工作能力和生活質(zhì)量[1,2]。矽肺的發(fā)生及病情進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，二氧化硅顆粒觸發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)造成的肺組織惡性炎癥和不可逆的纖維化病變是其中關(guān)鍵的病理機(jī)制，減輕炎性淋巴細(xì)胞浸潤、進(jìn)行肺部抗炎治療是改善矽肺癥狀的有效手段[3,4]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transform-ing growth factor-β1，TGF-β1)/母親DPP同源物(mothers against decapentaplegic homolog，Smad)是調(diào)節(jié)機(jī)體組織炎癥與纖維化的主要信號，抑制其蛋白表達(dá)，可顯著減輕高糖誘導(dǎo)的炎癥和纖維化病變[5]，并減輕二氧化硅誘導(dǎo)的肺部炎癥和氧化應(yīng)激，降低膠原蛋白表達(dá)及沉積，對抗大鼠矽肺的進(jìn)展[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)是診斷矽肺的有效生物標(biāo)志物，在矽肺患者血清中濃度顯著升高[7]。由此可知，TGF-β1/Smad信號及MMP-2蛋白均是防治矽肺的重要作用靶點(diǎn)。白花蛇舌草是一種可抑菌消炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、抗腫瘤的傳統(tǒng)中藥，其醇提物主要含有蒽醌類、黃酮類等化合物，具有明顯的抗炎作用[8]，還是治療甲型H1N1流感病毒性肺炎的中藥方劑中的重要組成成分[9]，因而推測白花蛇舌草是治療矽肺的一種潛在藥物。但白花蛇舌草醇提物對矽肺大鼠TGF-β1、Smad、MMP-2表達(dá)的影響，目前尚不清楚，本文通過構(gòu)建矽肺大鼠模型，對此問題進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠購買于中科產(chǎn)業(yè)控股(深圳)有限公司，許可證號：SYXK(粵)2021-0263，體質(zhì)量190～210 g，雄性。常規(guī)飼養(yǎng)在本院動物中心屏障環(huán)境動物房，房中溫度保持在22～25 ℃之間，相對濕度保持在55%～60%之間，12 h/12 h明暗循環(huán)光照，通風(fēng)換氣9～12次/h。

1.1.2 主要試劑及儀器 白花蛇舌草(貨號XY26133)，購自上海信裕生物科技有限公司；二氧化硅粉塵(80%粒子在1～5 μm，純度達(dá)到99%)于美國Sigma公司購買；吡非尼酮膠囊(規(guī)格100 mg/粒，批準(zhǔn)文號：H20133376)于北京康蒂尼藥業(yè)有限公司購買；天狼星紅染色試劑盒(貨號G3632)、通用SP免疫組織化學(xué)試劑盒(貨號SP0041)、高效RIPA裂解液(貨號R0010)、大鼠環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase，COX-2)ELISA試劑盒(貨號SEKR-0075)、OCT冰凍切片包埋劑(貨號4583)購買于北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)測試盒(H015)、TGF-β1測試盒(H034-2)購于南京建成生物工程研究所有限公司；兔源Anti-GAPDH一抗(貨號ab181602)、兔源Anti-LFA-1一抗(貨號ab186873)、兔源重組Anti-MMP2一抗(貨號ab181286)、兔源Anti-TGF-β1一抗(貨號ab215715)、兔源Anti-p-Smad一抗(貨號ab40854)、兔源Anti-Smad一抗(貨號ab63403)、羊抗兔二抗(貨號A0277)于美國Abcam公司購買；蛋白定量試劑盒(貨號P0012S)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。

小動物無創(chuàng)肺功能測量儀(全身體積描記法)購自EMKA公司(法國)；電子天平(型號LT502E)購自常熟市天量儀器有限公司(中國)；多功能自動酶標(biāo)儀(型號2010ELX-808)購自BioTek公司(美國)；冰凍切片機(jī)(型號CM1950)購自Leica公司(德國)；光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)(型號CKX41)購自O(shè)lypums公司(日本)；快速濕轉(zhuǎn)儀(型號eBlot L1)購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司(中國)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號Chemi-Doc XRS)、蛋白電泳儀(型號1659001)購自Bio-Rad公司(美國)等。

1.2 方法

1.2.1 矽肺大鼠模型建立及分組給藥 將二氧化硅粉塵高溫殺菌并干燥后，以蒸餾水配制成100 mg/ml的混懸液，然后向Wistar大鼠氣管內(nèi)滴注1 ml上述混懸液，建立矽肺模型[10]。矽肺大鼠隨機(jī)分為模型組、白花蛇舌草醇提物低(1.5 g/kg)、中(3 g/kg)、高(6 g/kg)劑量組、吡非尼酮(100 mg/kg)組，每組12只，另選取12只大鼠氣管內(nèi)滴注等劑量生理鹽水，設(shè)為對照組。將白花蛇舌草干燥藥材粉碎后加入8倍量80%乙醇浸泡后，加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并2次濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃下減壓蒸發(fā)濃縮，直至生藥濃度為1 g/ml[11]，以生理鹽水稀釋得到濃度分別為0.15，0.3，0.6 g/ml的藥液[12]，吡非尼酮膠囊取出藥物，配制成10 mg/ml的藥液[13]。白花蛇舌草醇提物低、中、高劑量組、吡非尼酮組這4組藥物干預(yù)組大鼠以10 ml/kg的劑量灌胃相應(yīng)藥液，對照組和模型組大鼠以10 ml/kg的劑量灌胃生理鹽水，每日灌胃干預(yù)1次，共干預(yù)21 d。

1.2.2 大鼠肺功能指標(biāo)測定 第21天用藥結(jié)束后24 h，測定各組大鼠肺功能指標(biāo)：呼氣峰流值(peak expiratory flow，PEF)、吸氣阻力(resistance inspiratory，Ri)、每分通氣量(minute ventilation，MV)，具體如下：將大鼠放入底部有生理信號遙測發(fā)射盒的體描箱中，設(shè)置條件：傳感器放大倍數(shù)500、采樣率200 Hz、氣泵流量2 L/min、輸入校準(zhǔn)-50，記錄遙測分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)，以肺功能測量儀自帶的軟件分析后得出上述肺功能指標(biāo)數(shù)值。

1.2.3 標(biāo)本采集及大鼠雙肺質(zhì)量及其臟器系數(shù)檢測 測定肺功能指標(biāo)后，采集大鼠頸動脈血并4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，將上清分組標(biāo)記后保存-80 ℃?zhèn)溆?。以乙醚藥物麻醉大鼠，測量其體質(zhì)量，然后處死、開胸、取出雙肺，測量其質(zhì)量，計(jì)算雙肺臟器系數(shù)=雙肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。以手術(shù)剪取肺組織約0.4 g，冰水浴勻漿后4 ℃ 3 000 r/min離心25 min，將上清吸出，以試劑盒測定其蛋白總濃度后，分組標(biāo)記好保存-80 ℃?zhèn)溆?。剩余肺組織以生理鹽水漂洗、25%蔗糖脫水、OCT包埋、液氮冰凍后切片備用。

1.2.4 免疫組化染色檢測大鼠肺組織淋巴細(xì)胞浸潤情況 取出1.2.3中的肺組織切片，復(fù)溫、冰丙酮固定、LFA-1一抗孵育、洗滌后，以試劑盒做免疫組織化學(xué)染色，具體參照試劑盒說明指導(dǎo)步驟進(jìn)行，鏡下觀察拍照后采用Image J軟件分析圖片，計(jì)算出肺組織LFA-1陽性細(xì)胞比例，公式為：肺組織LFA-1陽性細(xì)胞比例=LFA-1陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 天狼星紅染色檢測大鼠肺組織纖維化變性情況 取出1.2.3中的肺組織切片，以1.2.4中方法復(fù)溫、固定后，以天狼星紅染液進(jìn)行染色，漂洗后鏡下觀察拍照，以Image J軟件分析圖片，計(jì)算出肺組織膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，公式為：CVF=心肌膠原面積/所測視野面積×100%。

1.2.6 ELISA法檢測大鼠血清IL-18、COX-2、TGF-β1水平 取出1.2.3中的大鼠血清，以冰水浴緩慢解凍，參照各自試劑盒說明指導(dǎo)步驟，采用ELISA法測定其中IL-18、COX-2、TGF-β1含量。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測大鼠肺組織TGF-β1、Smad、MMP-2蛋白表達(dá) 取出1.2.3中的大鼠肺組織蛋白樣品液，以冰水浴緩慢解凍，取出含有20 μg總蛋白的樣品液煮沸、上樣、電泳、濕轉(zhuǎn)，使用5%脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯膜上蛋白非特異位點(diǎn)，剪下目的蛋白GAPDH、MMP-2、TGF-β1、p-Smad、Smad，分別以兔源Anti-GAPDH一抗(稀釋2 000倍)、兔源重組Anti-MMP2一抗(稀釋3 000倍)、兔源Anti-TGF-β1一抗(稀釋2 500倍)、兔源Anti-p-Smad一抗(稀釋1 000倍)、兔源Anti-Smad一抗(稀釋2 000倍)孵育后洗膜，再以羊抗兔二抗(稀釋2 000倍)孵育后洗膜，以化學(xué)發(fā)光劑顯色后拍照，以Image J軟件分析圖片，定量各蛋白條帶灰度值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最終得到各蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草醇提物對大鼠肺功能指標(biāo)的影響

與對照組相比，模型組大鼠MV、PEF顯著降低，Ri顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，白花蛇舌草醇提物低、中、高劑量組與吡非尼酮組大鼠MV、PEF均升高，Ri均降低，且各指標(biāo)變化呈劑量依賴性(P<0.05)。白花蛇舌草醇提物高劑量組與吡非尼酮組相比，大鼠MV、PEF、Ri無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。表明白花蛇舌草醇提物可改善矽肺大鼠肺功能。

表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較Table 1 Comparison of lung function indexes of rats between

2.2 白花蛇舌草醇提物對大鼠雙肺質(zhì)量及其臟器系數(shù)的影響

與對照組相比，模型組大鼠雙肺質(zhì)量及其臟器系數(shù)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，白花蛇舌草醇提物低、中、高劑量組與吡非尼酮組大鼠雙肺質(zhì)量及其臟器系數(shù)均降低，且呈白花蛇舌草醇提物劑量依賴性(P<0.05)。白花蛇舌草醇提物高劑量組與吡非尼酮組相比，大鼠雙肺質(zhì)量及其臟器系數(shù)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。表明白花蛇舌草醇提物可降低矽肺大鼠雙肺質(zhì)量及其臟器系數(shù)。

表2 各組大鼠雙肺質(zhì)量及其臟器系數(shù)比較Table 2 Comparison of lung weights and organ coefficients of rats between

2.3 白花蛇舌草醇提物對大鼠肺組織淋巴細(xì)胞浸潤的影響

與對照組相比，模型組大鼠肺組織LFA-1陽性細(xì)胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，白花蛇舌草醇提物低、中、高劑量組與吡非尼酮組大鼠肺組織LFA-1陽性細(xì)胞比例降低，且呈白花蛇舌草醇提物劑量依賴性(P<0.05)。白花蛇舌草醇提物高劑量組與吡非尼酮組相比，大鼠肺組織LFA-1陽性細(xì)胞比例無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3、圖1)。表明白花蛇舌草醇提物可減輕矽肺大鼠肺組織淋巴細(xì)胞浸潤。

2.4 白花蛇舌草醇提物對大鼠肺組織纖維化的影響

對照組大鼠肺組織幾乎沒有膠原沉積，未發(fā)生明顯纖維化變性。模型組大鼠肺組織膠原沉積明顯，發(fā)生顯著纖維化變性;與對照組相比，模型組大鼠肺組織CVF顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2、表4)。與模型組相比，白花蛇舌草醇提物低、中、高劑量組與吡非尼酮組大鼠肺組織膠原沉積及纖維化變性均減輕，大鼠肺組織CVF降低，且呈白花蛇舌草醇提物劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。白花蛇舌草醇提物高劑量組與吡非尼酮組相比，大鼠肺組織CVF無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2、表4)。表明白花蛇舌草醇提物可減輕矽肺大鼠肺組織纖維化。

表3 各組大鼠肺組織LFA-1陽性細(xì)胞比例比較Table 3 Comparison of LFA-1 positive cell percentage in lung tissue of rats between

A.對照組；B.模型組；C.白花蛇舌草醇提物低劑量(1.5 g/kg)組；D.白花蛇舌草醇提物中劑量(3 g/kg)組；E.白花蛇舌草醇提物高劑量(6 g/kg)組；F.吡非尼酮(100 mg/kg)組圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測各組大鼠肺組織LFA-1表達(dá)的結(jié)果 (×400)Figure 1 Immunohistochemical staining results of LFA-1 expression in lung tissue of rats in each group (×400)

A.對照組；B.模型組；C.白花蛇舌草醇提物低劑量(1.5 g/kg)組；D.白花蛇舌草醇提物中劑量(3 g/kg)組；E.白花蛇舌草醇提物高劑量(6 g/kg)組；F.吡非尼酮(100 mg/kg)組圖2 天狼星紅染色檢測各組大鼠肺組織膠原沉積及纖維化變性 (×200)Figure 2 Collagen deposition and fibrosis in lung tissue of rats in each group by Sirius red staining (×200)

表4 各組大鼠肺組織CVF比較Table 4 Comparison of CVF in lung tissue of rats between

2.5 白花蛇舌草醇提物對大鼠血清IL-18、COX-2、TGF-β1水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清IL-18、COX-2、TGF-β1水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，白花蛇舌草醇提物低、中、高劑量組與吡非尼酮組大鼠血清IL-18、COX-2、TGF-β1水平降低，且呈白花蛇舌草醇提物劑量依賴性(P<0.05)。白花蛇舌草醇提物高劑量組與吡非尼酮組相比，大鼠血清IL-18、COX-2、TGF-β1水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表5)。表明白花蛇舌草醇提物可減輕矽肺大鼠炎癥。

表5 各組大鼠血清IL-18、COX-2、TGF-β1水平比較Table 5 Comparison of serum IL-18, COX-2 and TGF-β1 levels in rats between

2.6 白花蛇舌草醇提物對大鼠肺組織TGF-β1、Smad、p-Smad、MMP-2表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad/Smad、MMP-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，見表6、圖3)。與模型組相比，白花蛇舌草醇提物低、中、高劑量組與吡非尼酮組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad/Smad、MMP-2表達(dá)水平降低，且呈白花蛇舌草醇提物劑量依賴性(P<0.05)。白花蛇舌草醇提物高劑量組與吡非尼酮組相比，大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad/Smad、MMP-2表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明白花蛇舌草醇提物可降低矽肺大鼠肺組織TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)及Smad磷酸化。

表6 各組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad/Smad、MMP-2相對表達(dá)水平Table 6 Relative expression levels of TGF-β1, MMP-2 and p-Smad/Smad in lung tissue of rats between

1.對照組；2.模型組；3.白花蛇舌草醇提物低劑量(1.5 g/kg)組；4.白花蛇舌草醇提物中劑量(3 g/kg)組；5.白花蛇舌草醇提物高劑量(6 g/kg)組；6.吡非尼酮(100 mg/kg)組圖3 免疫印跡檢測各組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad、Smad、MMP-2表達(dá)Figure 3 The expression of TGF-β1, p-smad, Smad and MMP-2 in lung tissue of rats in each group by Western blot

3 討論

矽肺是一種進(jìn)行性的慢性肺病，不僅可損害患者肺功能，造成呼吸困難，還會導(dǎo)致患者產(chǎn)生右心室壓力升高、肺動脈高壓、肺癌等并發(fā)癥，極大損害患者身體健康，因而探索安全有效的矽肺治療策略具有至關(guān)重要的臨床與社會意義[1,2,14]。本文以氣管內(nèi)滴注二氧化硅混懸液的方法構(gòu)建矽肺大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模大鼠雙肺質(zhì)量及其臟器系數(shù)、血清炎性細(xì)胞因子IL-18、COX-2及TGF-β1水平明顯升高，引發(fā)嚴(yán)重的肺內(nèi)炎癥，使肺組織LFA-1陽性細(xì)胞比例升高，炎性淋巴細(xì)胞大量浸潤肺組織，造成肺損傷，并導(dǎo)致膠原大量合成沉積，引起肺纖維化，最終損害肺功能，降低大鼠MV、PEF，同時(shí)升高Ri，揭示矽肺模型建立成功。

二氧化硅被大量吸入肺部可引起細(xì)胞毒性，并誘導(dǎo)炎性介質(zhì)過量表達(dá)釋放，引發(fā)劇烈的肺部持續(xù)性炎癥及氧化應(yīng)激損傷，造成肺部纖維化病變，最終導(dǎo)致矽肺，通過逆轉(zhuǎn)二氧化硅誘導(dǎo)的炎性級聯(lián)反應(yīng)及細(xì)胞毒性可有效減輕肺成纖維細(xì)胞的活化，延緩矽肺的進(jìn)展[15,16]。白花蛇舌草是一種具有抗炎殺菌功效的良藥，是多種中藥方劑中的重要組成藥物，在中醫(yī)藥治療甲型H1N1流感病毒性肺炎過程中起到重要作用[8,9]，并且作為軟肝化纖湯的重要組方藥物，在延緩乙型肝炎后肝纖維化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵效用[17]，其提取物能有效降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)，改善膿毒癥小鼠肝臟炎癥損傷[18]。本文以白花蛇舌草醇提物干預(yù)矽肺大鼠，可明顯降低大鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-18、COX-2、TGF-β1水平及肺組織LFA-1陽性細(xì)胞比例，減輕肺部炎癥，降低膠原合成沉積，減小CVF，進(jìn)而抑制肺組織纖維化病變，減輕雙肺質(zhì)量及其臟器系數(shù)，修復(fù)肺功能，升高大鼠MV、PEF，降低Ri，表明白花蛇舌草可有效抑制二氧化硅引發(fā)的肺組織炎性級聯(lián)反應(yīng)，緩解肺部纖維化病變，改善肺功能，起到拮抗矽肺進(jìn)展的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、Smad、MMP-2是調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)表達(dá)、介導(dǎo)組織細(xì)胞炎性級聯(lián)反應(yīng)及纖維化病理過程的重要蛋白因子，在矽肺的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，降低TGF-β1、MMP-2表達(dá)可減少膠原合成[19,20]，干擾TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)可抑制二氧化硅引發(fā)的炎性級聯(lián)反應(yīng)，減輕肺組織纖維化病變，延緩矽肺病情進(jìn)展[6]。本研究結(jié)果顯示，白花蛇舌草醇提物可降低矽肺大鼠肺組織TGF-β1、Smad及MMP-2蛋白表達(dá)水平，延緩肺組織炎癥及纖維化病變，表明白花蛇舌草醇提物可能通過抑制TGF-β1、Smad及MMP-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而延緩矽肺病情進(jìn)展。

綜上所述，白花蛇舌草醇提物可減少炎性細(xì)胞因子合成釋放，減輕矽肺大鼠肺部炎癥，抑制膠原合成沉積，延緩肺組織纖維化變性，修復(fù)大鼠肺功能，為矽肺的臨床治療提供了新的治療思路，找到了一種有前景的藥物。但本文只對白花蛇舌草防治矽肺的藥理機(jī)制進(jìn)行了初步探索，還未通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)做對照驗(yàn)證，后續(xù)會進(jìn)行深入詳細(xì)的探究。