張慧斌，杜 娟，楊 立，宋勝梅

(1山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心藥品檢驗(yàn)技術(shù)研究所，太原 030031；2山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所；*通訊作者,E-mail:smsong@sxu.edu.cn)

秦艽目前是國家三級(jí)保護(hù)藥材[1]，2020年版《中國藥典》中亦收錄了4種可以用做藥物的正品秦艽[2]。近些年來，隨著秦艽藥用價(jià)值的開發(fā)，市場(chǎng)上商品秦艽來源復(fù)雜多樣，質(zhì)量良莠不齊。因此，很有必要開展秦艽的安全性評(píng)價(jià)。

2020年版《中國藥典》中將鉛(Pb)、鎘(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、銅(Cu)納入重金屬行列中，并將這些元素定性為有害元素。這種元素被統(tǒng)稱為“五毒”[3]，對(duì)人體危害非常大[4]。目前有多種分析檢測(cè)方法可用于重金屬及有害元素的檢測(cè)，包括比色法、紫外分光光度法、原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)等[5]。其中，電感耦合等離子體質(zhì)譜法目前是痕量分析領(lǐng)域最先進(jìn)的方法，它結(jié)合了質(zhì)譜高靈敏度、可同時(shí)分析多種元素的優(yōu)點(diǎn)與電感耦合等離子體較高離子化能力的特性[6]，檢出限低，可實(shí)現(xiàn)元素快速、準(zhǔn)確分析。王佳翰等[7]對(duì)比了電感耦合等離子體質(zhì)譜法和石墨爐原子吸收光譜法在用于化探樣品中的金含量測(cè)定時(shí)的差異，結(jié)果證明電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定化探樣品中金含量的結(jié)果可靠性略優(yōu)于石墨爐原子吸收光譜法。

本文利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法開展了秦艽中鉛、鎘、砷、汞、銅5種重金屬含量檢測(cè)方法的研究，并測(cè)定了3批野生品和3批栽培品中重金屬含量。由于在2020年出版的《中國藥典》(一部)“秦艽”[2]項(xiàng)下暫時(shí)沒有5種重金屬及有害元素的限量要求，所以本研究參考藥典根莖類中藥的相關(guān)指標(biāo)來評(píng)價(jià)其安全性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和材料

實(shí)驗(yàn)試劑：65%硝酸為EMSURE?分析級(jí)，購自德國默克生命科學(xué)-默克化工技術(shù)(上海)有限公司；所用水為去離子水(電阻率≥18 MΩ·cm)。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平(型號(hào)：AR224CN)購自美國奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；微波消解儀(型號(hào)：Mars 6)購自美國CEM公司；趕酸儀(型號(hào)：EHD-24)購自北京東方科創(chuàng)公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(型號(hào)：iCAP Qc)購自賽默飛世爾科技公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：共有5種單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為鉛(批號(hào)：196020-5)、鎘(批號(hào)：203006-2)、砷(批號(hào)：198007-7)、汞(批號(hào)：199021-2)、銅(批號(hào)：191039-3)，濃度均為1 000 μg/ml，來源均為國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；銦(In)內(nèi)標(biāo)元素儲(chǔ)備液(名稱：Internal Standard Mix 1-SCP-IS7；批號(hào)：S190802006；濃度為10 μg/ml)購自加拿大SCP SCIENCE公司；錸(Re)內(nèi)標(biāo)元素儲(chǔ)備液(名稱：錸單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液；批號(hào)：216007；濃度為1 000 μg/ml)購自國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

質(zhì)控品：使用的與基體類似的芹菜生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10048(GSB-26)來自于地球物理地球化學(xué)勘查研究所IGGE。

樣品：3批野生品和3批栽培品信息見表1。

表1 3批野生品和3批栽培品信息表Table 1 Information of three batches of wild samples and three batches of cultivated samples

1.2 各種溶液的配制

1.2.1 Pb、Cd、As、Cu四種元素測(cè)定用供試品溶液制備 供試品四分法，粉碎，過三號(hào)篩。取0.3 g，精密稱定，置于微波消解罐中，再通過瓶口分離器精密加入7 ml硝酸，放置過夜進(jìn)行預(yù)消解，然后在微波消解儀上進(jìn)行消解(0 ℃→120 ℃保持5 min，120 ℃→150 ℃保持15 min，150 ℃→180 ℃保持5 min，180 ℃→185 ℃保持20 min)，消解完全后，待消解液冷卻至60 ℃以下，從微波消解儀中小心取出消解罐，放冷，而后緩慢打開罐蓋排氣，并用少量去離子水沖洗消解罐內(nèi)蓋，之后將微波消解罐放在趕酸儀內(nèi)125 ℃趕酸至近干。趕酸結(jié)束，待消解罐放冷后，將罐內(nèi)消化液轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，并用少量去離子水洗滌消解罐2次，將洗滌液轉(zhuǎn)移至容量瓶中并用去離子水定容至刻度，混勻備用。

任務(wù)結(jié)束后，由于他的表現(xiàn)突出，獲得到航空部門、師農(nóng)業(yè)科領(lǐng)導(dǎo)的認(rèn)可?；貑挝晃逄旌?，他接到上級(jí)通知，擔(dān)任六連連長(zhǎng)一職。從此又開始了新的歷史征程。

取質(zhì)控樣品0.3 g，精密稱定，與供試品溶液同法制備即得質(zhì)控樣品溶液。

除不添加樣品外，與供試品溶液同法制備即得空白對(duì)照溶液。

1.2.2 Hg元素測(cè)定用供試品溶液制備 供試品四分法，粉碎，過三號(hào)篩。取0.3 g，精密稱定，置于微波消解罐中，再通過瓶口分離器精密加入7 ml硝酸，放置過夜進(jìn)行預(yù)消解，然后在微波消解儀上進(jìn)行消解(0 ℃→120 ℃保持5 min，120 ℃→150 ℃保持15 min，150 ℃→180 ℃保持5 min，180 ℃→185 ℃保持20 min)，消解完全后，待消解液冷卻至60 ℃以下，同1.2.1的方法將消解罐放在趕酸儀內(nèi)，于100 ℃加熱30 min，放冷，用少量去離子水洗滌消解罐2次，然后轉(zhuǎn)移洗滌液，通過去離子水將其定容到50 ml，定容完成之后將其搖勻便得到Hg元素供試品溶液。

取質(zhì)控樣品0.3 g，精密稱定，與供試品溶液同法制備即得質(zhì)控樣品溶液。

除不添加樣品外，與供試品溶液同法制備即得空白對(duì)照溶液。

1.2.3 配制內(nèi)標(biāo)和對(duì)照品溶液 精密吸取適量Pb、Cd、As、Cu 4種單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成4種元素混合對(duì)照工作液，其中4種元素濃度均為500 ng/ml。

分別精密吸取上述4種元素混合對(duì)照工作液0.1，0.5，1，3，5 ml，用2%硝酸溶液稀釋至50 ml，得到1，5，10，30，50 ng/ml的4種元素混合對(duì)照工作系列溶液。

精密吸取適量汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成20 ng/ml的Hg元素對(duì)照工作液。再精密吸取5個(gè)體積的汞元素溶液，分別為0.25，1.25，2.5，3.75，5 ml，之后再用2%硝酸溶液將其稀釋至50 ml，得到0.1，0.5，1，1.5，2 ng/ml的Hg元素對(duì)照工作系列溶液。

1.3 等離子體、質(zhì)譜條件及測(cè)定方法

本研究利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀來檢測(cè)待測(cè)溶液中5種重金屬元素的含量，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀啟動(dòng)時(shí)的相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。

表2 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀工作參數(shù)Table 2 Parameters for ICP-MS

上機(jī)測(cè)定時(shí)，選取5種元素的同位素以及In和Re元素的內(nèi)標(biāo)同位素，分別是63Cu、75As、111Cd、202Hg、208Pb、115In、185Re。其中，選擇115In當(dāng)做63Cu、75As、111Cd、202Hg的內(nèi)標(biāo)，選擇185Re當(dāng)做208Pb的內(nèi)標(biāo)。在分析的過程中，進(jìn)樣管要一直放置在內(nèi)標(biāo)工作溶液中，按照濃度由低到高的順序，把樣品管依次放置到各個(gè)對(duì)照組中，開始測(cè)定濃度，并以測(cè)量值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后將樣品管依次插入空白對(duì)照溶液和供試品溶液中進(jìn)行測(cè)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察 按上述4種元素混合對(duì)照工作系列溶液、Hg元素對(duì)照工作系列溶液、內(nèi)標(biāo)工作溶液制備法制備相應(yīng)對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)工作溶液，上機(jī)測(cè)定，考察其線性。以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(Y)，樣品濃度為橫坐標(biāo)(ρ)，進(jìn)行線性回歸，5種元素回歸方程分別為：Y=159 121.550 8ρ+31 395.012 6(Pb，n=5，r=0.999 4)，Y=7 510.837 7ρ+39.641 9(Cd，n=5，r=0.999 3)，Y=1 394.125 7ρ+2 043.298 6(As，n=5，r=0.999 4)，Y=21 865.059 5ρ+12 282.982 1(Cu，n=5，r=0.999 2)，Y=129 451.447 0ρ+169.958 5(Hg，n=5，r=0.995 7)。結(jié)果表明，5種元素的線性相關(guān)系數(shù)r遠(yuǎn)超0.99，具備較好的線性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 分別取50 ng/ml 4種元素混合對(duì)照工作溶液與2 ng/ml的Hg元素對(duì)照工作溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，上機(jī)測(cè)定。結(jié)果顯示，5種元素同一份對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD小于10%(見表3)，表明本方法精密度良好。

表3 五種元素對(duì)照工作溶液精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The precision test results of five elements in the control working solution

2.1.3 加樣回收率試驗(yàn) 采用加標(biāo)回收的方式，選取同一供試品(栽培粗莖秦艽Z1)，在0.3 g秦艽樣品中加入不同體積的對(duì)照品溶液，按照供試品溶液制備方法進(jìn)行樣品的消解及趕酸，制備低、中、高三水平的加標(biāo)回收樣品，計(jì)算得到相應(yīng)的回收率，考察準(zhǔn)確性。結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)低濃度水平平均回收率最小值為81.40%，最大值為104.67%；中濃度水平平均回收率最小值為86.60%，最大值為121.78%；高濃度水平平均回收率最小值為87.53%，最大值為124.40%(見表4)。低、中、高三水平(n=3)各自的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為：1.28%～8.77%，0.75%～6.55%，0.80%～10.31%。各個(gè)濃度的數(shù)據(jù)表明，實(shí)驗(yàn)回收率良好，準(zhǔn)確性較高。5種元素中，Hg元素各個(gè)水平回收率相對(duì)較低，且高濃度水平回收率波動(dòng)最大，可能是由于未使用金元素作為溶液中汞離子穩(wěn)定劑，可能存在Hg析出的情況。

表4 三水平加標(biāo)樣品中5種元素回收率結(jié)果Table 4 Recovery test results of five elements in three-level spiked samples

(續(xù)表4)

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照上述供試品溶液制備及測(cè)定方法，對(duì)同一供試品(栽培粗莖秦艽Z1)6份樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，供試品中5種元素含量的RSD值均小于8%(見表5)，表明該方法重復(fù)性良好。

表5 五種元素重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The repeatability test results of five elements

2.1.5 檢出限試驗(yàn) 連續(xù)11次進(jìn)樣空白對(duì)照組開展檢出限試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表6。Pb,Cd,As,Cu,Hg 5種重金屬的檢出限分別為0.011 2，0.418×10-3，0.032 5，0.021 2，0.065 9×10-3mg/kg。參照2020年版《中國藥典》(一部)甘草、葛根等根莖類藥材的相關(guān)規(guī)定，5種重金屬及有害元素的限量分別為：鉛不得過5 mg/kg；鎘不得過1 mg/kg；砷不得過2 mg/kg；汞不得過0.2 mg/kg；銅不得過20 mg/kg[2]。由此可知，該方法檢出限達(dá)到靈敏度要求，可用于5種重金屬及有害元素的檢測(cè)。

表6 五種元素檢出限試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The detection limits test results of five elements

2.2 秦艽樣品中重金屬及有害元素污染物的測(cè)定

對(duì)3份野生品和3份栽培品及質(zhì)控樣品進(jìn)行重金屬及有害元素污染物檢測(cè)，最終測(cè)定結(jié)果見表7。在2020年出版的《中國藥典》(一部)“秦艽”[2]項(xiàng)下暫時(shí)沒有5種重金屬及有害元素的限量要求，參考藥典“甘草”[2]、“葛根”[2]項(xiàng)下的相關(guān)指標(biāo)，對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行初步評(píng)價(jià)：野生品和栽培品鉛、鎘、砷、汞、銅的含量均在限量以下，品質(zhì)良好。

表7 秦艽樣品和質(zhì)控樣品中5種元素含量測(cè)定結(jié)果Table 7 Contents of five elements in Gentianae macrophyllae Radix samples and quality control sample

本次實(shí)驗(yàn)選擇了與秦艽樣品基體類似的芹菜作為質(zhì)控樣品，并檢測(cè)其中鉛、鎘、砷、汞、銅5種元素的含量，質(zhì)控品5種元素含量的參考值為：Pb(2.7±0.7)mg/kg；Cd(0.092±0.006)mg/kg；As(0.39±0.08)mg/kg；Cu(8.2±0.4)mg/kg；Hg(14.6±2.4)μg/kg。由表7測(cè)定結(jié)果可知，質(zhì)控品5種元素的檢測(cè)結(jié)果均在參考值范圍內(nèi)，表明該方法實(shí)驗(yàn)過程科學(xué)，檢測(cè)結(jié)果可靠。

3 討論

首先，本研究利用微波消解法進(jìn)行秦艽樣品的消解，簡(jiǎn)單、便捷、安全性相對(duì)較高。微波消解法既降低了使用濕法消解等傳統(tǒng)消解手段的時(shí)間成本，又避免了濕法消解等傳統(tǒng)消解過程中開放式環(huán)境導(dǎo)致的試劑人為污染，還杜絕了排氣過程造成的元素泄露和損失[8]。

其次，趕酸溫度與時(shí)間也需要結(jié)合消解所用酸的沸點(diǎn)、待測(cè)元素?fù)]發(fā)性質(zhì)和后續(xù)測(cè)定來加以選擇。趕酸主要是為了降低消解液中的酸濃度，使其酸濃度達(dá)到與標(biāo)準(zhǔn)溶液酸度接近，一方面在上機(jī)分析時(shí)達(dá)到一個(gè)較理想的環(huán)境，另一方面也是為了增加儀器的使用壽命。比如電感耦合等離子體質(zhì)譜儀適宜的進(jìn)樣酸濃度最好不要超過10%，但也要盡可能減少待測(cè)元素的損失。本方法選用氧化性強(qiáng)、安全性相對(duì)較高的硝酸對(duì)根莖類秦艽樣品進(jìn)行消解處理，對(duì)于不易揮發(fā)的鉛、鎘、砷、銅元素，后續(xù)趕酸采用125 ℃趕至近干；對(duì)于易揮發(fā)的汞元素，選擇100 ℃加熱30 min的趕酸方式。

影響秦艽質(zhì)量的因素有很多，主要包括基原、種植栽培方式與生長(zhǎng)年限等主要因素和儲(chǔ)藏運(yùn)輸、加工炮制等次要因素。本研究選取了來自甘肅、內(nèi)蒙古的秦艽野生品和來自云南、內(nèi)蒙古的秦艽栽培品，利用微波消解結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測(cè)秦艽飲片中的5種重金屬元素含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3批野生品和3批栽培品中5種重金屬元素含量呈現(xiàn)的趨勢(shì)為Cu>Pb>Hg，野生品中As>Cd，栽培品中Cd>As。由于品種不同、產(chǎn)地生長(zhǎng)環(huán)境重金屬污染情況不同以及生長(zhǎng)年限不同，因而不同樣品5種重金屬元素含量差異較大。另外，本研究采集的樣量少，覆蓋面小，對(duì)于不同秦艽品種中5種重金屬元素含量的變化趨勢(shì)不同及含量差異較大的具體原因仍需進(jìn)一步探究。

從以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果中可以看出，本方法的專屬性、線性、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、檢出限試驗(yàn)結(jié)果都符合中國藥典(2020年版)四部9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[9]的相關(guān)要求，表明微波消解法結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜法簡(jiǎn)單、快捷，檢測(cè)結(jié)果可靠，適用于秦艽中鉛、鎘、砷、汞、銅5種重金屬及有害元素的檢測(cè)，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可以為秦艽資源的開發(fā)利用和安全評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。