付 沖,吳 超，張焰平*

(1安慶市立醫(yī)院消化內(nèi)科，安慶 246000；2皖南醫(yī)學(xué)院病理生理教研室；*通訊作者,E-mail:Zyping001@126.com)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病。病變主要位于降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和直腸，可進(jìn)一步擴(kuò)散至整個結(jié)腸并反復(fù)發(fā)作[1]。與健康人相比，UC患者常有腹痛、腹瀉、黏液膿性和血便，如果病情進(jìn)展不及時治療，可導(dǎo)致貧血、消瘦、低蛋白血癥和水電解質(zhì)紊亂。UC的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，與腸道菌群失調(diào)、免疫系統(tǒng)障礙以及遺傳、環(huán)境和心理因素等有關(guān)[2]，現(xiàn)階段，美沙拉嗪和生物制劑等其他治療藥物也常規(guī)用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療，但由于價格昂貴，不僅會增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且存在耐藥及停藥后嚴(yán)重反彈等情況[3]。近年來，我國政府對中藥的發(fā)展給予了積極的支持，中草藥含有多種活性成分，并且價格低廉，具有長期使用的可能性，因此中草藥療法引起了臨床醫(yī)生的極大興趣，所以，尋找具有有效抗炎作用的中草藥，對于改善臨床治療效果，提高病人的生活品質(zhì)至關(guān)重要。

在我國，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎為“休息痢”“久痢”[4]。該病位于大腸，涉及脾、肝、腎、肺臟。以濕熱蘊(yùn)腸、氣滯血瘀為根本病機(jī)，以脾虛為主要病因，以飲食不調(diào)為主。本病是本虛表實(shí)的證候，其病程以表實(shí)為主，以濕熱蘊(yùn)腸、氣血不暢為特征；老鸛草是一種多年生草本，辛、苦、平、入肝、腎、脾經(jīng)，是一種常見的中藥，具有清熱化濕、排毒、止痢的功效。Bastani團(tuán)隊(duì)[5]在之前的一項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)老鸛草提取物可以明顯緩解葡聚糖硫酸鈉導(dǎo)致的大鼠急性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)；劉榮漢[6]報(bào)道了一項(xiàng)納入了67名潰瘍性結(jié)腸炎患者的研究，結(jié)果顯示老鸛草對潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果明顯優(yōu)于柳氮磺嘧啶。以上的研究表明老鸛草是治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在藥物,但目前在老鸛草抗炎機(jī)制的研究上鮮有報(bào)道,因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以探討老鸛草對潰瘍性結(jié)腸炎的可能的作用機(jī)制，最后通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)，從而為其在潰瘍性結(jié)腸炎的臨床應(yīng)用上奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測靶點(diǎn)

1.1.1 中藥老鸛草活性成分的篩選 以“老鸛草”為檢索詞，檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，獲得老鸛草的化學(xué)成分。以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug Likeness，DL)≥0.18為條件，篩選得到中藥老鸛草有效成分。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫中，通過有效成分查找其對應(yīng)靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)輸入蛋白質(zhì)組常用數(shù)據(jù)庫(Unified Protein Database，Uniprot，https//www.uniprot.Org)實(shí)現(xiàn)基因名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.1.2 潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)的預(yù)測 以潰瘍性結(jié)腸炎為關(guān)鍵詞，檢索人類基因綜合分析數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Database,GeneCards,https://www.genecards.org/)和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://mirror.omim.org)獲得潰瘍性結(jié)腸炎潛在相關(guān)基因，最后通過VENNY2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲得潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)與老鸛草化合物間存在重疊靶點(diǎn)。

1.1.3 藥物-化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及蛋白-蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.2軟件建立網(wǎng)絡(luò)圖，以構(gòu)建老鸛草的活性化合物和潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)。將重疊靶點(diǎn)導(dǎo)入String網(wǎng)站(https://string-db.org/)，物種設(shè)定為人類，蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)信息獲得后使用R軟件繪制度值排名前20的的靶點(diǎn)。

1.1.4 基因本體富集分析和京都基因與基因組百科全書通路分析 利用R軟件的clusterProfiler包進(jìn)行基因本體富集分析和京都基因與基因組百科全書通路富集分析。以P<0.05作為基因本體富集和京都基因與基因組百科全書通路富集的閾值，并選取部分排名靠前的條目進(jìn)行可視化。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物制備 人髓系白血病單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞取自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。THP-1細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清(美國賽默飛世爾科技公司，貨號A3160802)和0.25%胰酶(美國賽默飛世爾科技公司，貨號BL006A)，放置在恒溫37 ℃且含有5%二氧化碳的加濕空氣的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。老鸛草購自安慶市立醫(yī)院中藥房。用去離子水(1 ∶10～5 ∶1,W/V)煎煮老鸛草，每次30 min。加入Te緩沖液搖勻濃縮后在20～40 ℃保存。

1.2.2 THP1-M0/M1細(xì)胞模型的建立 參照薛婧團(tuán)隊(duì)[7]近期的一項(xiàng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用佛波酯復(fù)蘇THP-1細(xì)胞，誘導(dǎo)其貼壁生長并使其分化為未活化的MO巨噬細(xì)胞，按照隨機(jī)數(shù)字法將細(xì)胞分為對照組、LPS模型組、老鸛草低劑量組(LPS+12.5 g/ml老鸛草)、老鸛草中劑量組(LPS+25 g/ml老鸛草)、老鸛草高劑量組(LPS+50 g/ml老鸛草)。不同劑量老鸛草組以誘導(dǎo)的M0巨噬細(xì)胞為基礎(chǔ)加入不同濃度的老鸛草提取液預(yù)處理6 h，除對照組以外，其余組均加入脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)4 h得到M1巨噬細(xì)胞，加入F4/80+(北京索萊寶科技有限公司，貨號:28463-1-AP)和CD86抗體(北京索萊寶科技有限公司，貨號:13395-1-AP)檢測M1巨噬細(xì)胞比例。

1.2.3 細(xì)胞活力測定 通過CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號CA1210)測定細(xì)胞活力，將誘導(dǎo)成功的MO巨噬細(xì)胞細(xì)胞以4×103/孔的密度置于96孔板中。孵育12 h后，用不同濃度的含藥物的培養(yǎng)基處理24 h。然后將10 μl CCK-8試劑添加到每個孔中，并將板孵育1～4 h。最后，在450 nm波長下測量吸光度。

1.2.4 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6及IL-8的含量 將抗原與固相載體連接，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，加酶標(biāo)抗體進(jìn)行孵育，固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。經(jīng)過再次洗滌后加底物溶液進(jìn)行顯色，待反應(yīng)終止后在450 nm波長下檢測吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β、IL-6、IL-8的水平，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，并按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。

1.2.5 qRT-PCR法檢測細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6及IL-8的mRNA含量 使用TRIZOL試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司，貨號：12183-555)提取總mRNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司，貨號：RR036A)生成gDNA。然后使用TB Green Premix Ex Taq PCR試劑盒(大連TakaRa公司，貨號：RR820A)進(jìn)行定量PCR。人類GAPDH基因被用作內(nèi)標(biāo)基因，并通過2-ΔΔCt方法定量分析數(shù)據(jù)。對照組中的值設(shè)置為1.0，所有數(shù)據(jù)均顯示為相對mRNA表達(dá)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司負(fù)責(zé)合成?；虻囊镄蛄腥缦拢篒L-6上、下游引物序列分別為5′-AATAACCACCCCTGACCC-AACC-3′和5′-TGACCAGAAGAGGAATGCCC-3′；IL-1β上、下游引物序列分別為5′-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3′和5′-GTCGGAGATTCGTAGCTGGA-3′；人GAPDH引物序列分別為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測 在以上處理完畢后，每一組采集106細(xì)胞，然后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次。添加200 μl磷酸緩沖鹽溶液重懸，將CD86抗體5 μl(Proteintech,貨號13395-1-AP)加入后進(jìn)行避光孵育30 min，完成孵化后，用PBS沖洗2次，然后加入200 μl磷酸緩沖鹽溶液重懸后上機(jī)檢測。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組資料比較采用單因素方差分析(ANOVA)分析，若差異有顯著性，進(jìn)一步兩兩比較用LSD法;采用Graphpad7.0對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 活性化合物的篩選 從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫中檢索老鸛草的活性成分，共得到39個相關(guān)化合物。符合OB≥30%，DL≥0.18條件的化合物共7個(見表1)。

表1 中藥老鸛草中7個有效成分基本信息Table 1 The information of 7 active compounds in Geranium wilfordii

2.1.2 老鸛草作用靶點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)重疊靶點(diǎn)篩選 利用小分子藥物靶點(diǎn)預(yù)測在線平臺(Swiss target prediction,STP,http://swisstargetprediction.ch)刪除重復(fù)靶點(diǎn)，從老鸛草的7個活性化合物中篩選出161個化合物靶點(diǎn)，通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選，共獲得2 412個潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)。將161個化合物靶點(diǎn)與2 412個潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)相交，得到122個重疊靶點(diǎn)(見圖1)。我們還利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)(見圖2)，進(jìn)一步闡明老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制。

2.1.3 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 122個重疊靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)包含121個節(jié)點(diǎn)，2 256條邊,平均度值為37.3，平均局部聚類系數(shù)為0.685，PPI富集P<1.0×10-16(見圖3)。根據(jù)拓?fù)浞治龅玫降拇笥谄骄戎档陌悬c(diǎn)作為重要靶點(diǎn)(見圖4)，再進(jìn)一步選擇10個核心靶點(diǎn)，包括JUN、IL-6、PTGS2、FOS、EGF、MMP9、IL-8、MAPK1、CASP3、IL-1β。

圖1 中藥老鸛草作用靶點(diǎn)和潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

圓圈之間的連線代表兩個基因之間的相互關(guān)系，線條越粗，相關(guān)性越強(qiáng)圖3 中藥老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎重疊靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of the overlapping targets of Geranium wilfordii against ulcerative colitis

相互作用的蛋白數(shù)條形圖越長代表度值越高，為核心靶點(diǎn)的可能性越大圖4 中藥老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎重疊靶點(diǎn)度值條形圖Figure 4 The degree values of overlapping targets for Geranium wilfordii in the treatment of ulcerative colitis

2.1.4 基因本體功能富集分析和京都基因與基因組百科全書通路分析 對122個重疊靶點(diǎn)進(jìn)行了基因本體富集分析，其中P<0.05的基因本體項(xiàng)共2 077個，其中生物過程(BP)1 900個，細(xì)胞成分(CC)40個，分子功能(MF)137個。生物過程類別中排名前5位的分別為:對脂多糖的免疫反應(yīng)、對細(xì)菌的免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。這些生物學(xué)過程與以下分子功能密切相關(guān):轉(zhuǎn)錄因子直接與DNA結(jié)合、受RNA聚合酶調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、核受體活性。此外，這些過程主要發(fā)生在膜筏、膜微域、細(xì)胞表面的穴樣內(nèi)陷、囊泡腔、質(zhì)膜筏?；虮倔w分析排名前10的條目被可視化，結(jié)果見圖5。京都基因與基因組百科全書通路富集分析結(jié)果顯示，122個重疊靶點(diǎn)在157個信號通路中富集，主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力、動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路，京都基因與基因組百科全書分析排名前20的條目被可視化，結(jié)果見圖6。

基因富集數(shù)目圖5 中藥老鸛草與潰瘍性結(jié)腸炎的重疊靶點(diǎn)基因本體功能富集Figure 5 GO enrichment analyses for the overlapping targets between Geranium wilfordii and ulcerative colitis

基因富集數(shù)目圖6 中藥老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎重疊靶點(diǎn)京都基因與基因組百科全書通路富集條形圖Figure 6 KEGG pathway enrichment analyses for the overlapping targets for Geranium wilfordii in the treatment of ulcerative colitis

2.2 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 老鸛草對巨噬細(xì)胞活性的影響 THP-1經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)分化的M0巨噬細(xì)胞加入不同劑量的老鸛草處理24 h后，與對照組相比，12.5 mg/L老鸛草組、25 mg/L老鸛草組及50 mg/L老鸛草組中巨噬細(xì)胞活力沒有明顯降低(見圖7)。

圖7 不同劑量老鸛草水煎液對巨噬細(xì)胞活力的影響Figure 7 Influence of Geranium wilfordii on the activity of macrophages

2.2.2 M1巨噬細(xì)胞模型的鑒定 光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，THP-1細(xì)胞狀態(tài)良好時細(xì)胞形態(tài)呈圓形，大小均一，為單個懸浮細(xì)胞；經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后，對照組中部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有些細(xì)胞帶偽足；經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后加入LPS繼續(xù)誘導(dǎo)4 h，LPS模型組中不規(guī)則細(xì)胞較前更多，有些細(xì)胞出現(xiàn)多邊形，此時誘導(dǎo)分化成的細(xì)胞為M1型巨噬細(xì)胞(見圖8)。與LPS模型組相比，LPS+12.5 mg/L老鸛草組、LPS+25 mg/L老鸛草組及LPS+50 mg/L老鸛草組不規(guī)則細(xì)胞的比例較前明顯減少。從流式檢測結(jié)果中可以看出，與對照組相比，LPS模型組M1型巨噬細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01，見圖9)。

2.2.3 ELISA及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測老鸛草對細(xì)胞因子的影響 ELISA結(jié)果顯示，相比于對照組，LPS模型組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和IL-1β含量顯著升高(P<0.01，見圖10)；與LPS模型組相比，不同劑量老鸛草組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和IL-1β的含量顯著降低(P<0.01)。qRT-PCR結(jié)果顯示，相比于對照組，LPS模型組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)豐度顯著升高(P<0.01)。與LPS模型組相比，不同劑量老鸛草組(LPS+12.5 mg/L、LPS+25 mg/L、LPS+50 mg/L)細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和IL-1β的mRNA表達(dá)豐度顯著降低(P<0.01)。

圖8 不同劑量老鸛草水煎液對巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響 (×20)Figure 8 Influence of Geranium wilfordii on the shape of macrophages (×20)

圖9 流式細(xì)胞檢測脂多糖誘導(dǎo)的M0細(xì)胞中M1細(xì)胞比例Figure 9 Analysis of lipopolysaccharide-induced M1 cells by flow cytometry

2.2.4 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測老鸛草對M1巨噬細(xì)胞比例的影響 從M1型巨噬細(xì)胞流式檢測結(jié)果中可以看出，與對照組相比，LPS模型組中M1型巨噬細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)；與LPS模型組相比，不同劑量老鸛草組中M1型巨噬細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01，見圖11)。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種以胃腸道慢性炎癥為主要特征的復(fù)雜性疾病，病理生理基礎(chǔ)是腸黏膜上皮細(xì)胞破壞以及免疫失調(diào)導(dǎo)致過度激活[8]，大量炎癥因子的產(chǎn)生導(dǎo)致了一種不受控制的炎癥反應(yīng)。盡管在慢性炎癥的機(jī)制方面進(jìn)行了深入的研究并取得了重大進(jìn)展[9]，但潰瘍性結(jié)腸炎的確切病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡以及炎癥反應(yīng)和黏膜愈合的基本要素，巨噬細(xì)胞根據(jù)微環(huán)境刺激的不同被極化成兩種不同的表型：經(jīng)典激活途徑的(M1)巨噬細(xì)胞，它通過分泌促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致組織損傷而參與疾病的發(fā)展；另一種是替代性激活途徑的(M2)巨噬細(xì)胞，它分泌參與抗炎的抑炎因子[10]。由于腸道巨噬細(xì)胞數(shù)量的失衡可以改變炎癥過程，調(diào)節(jié)M1/M2平衡最近被認(rèn)為是潰瘍性結(jié)腸炎的潛在治療策略[11]。M1激活的巨噬細(xì)胞的特征是促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)增加，如腫瘤壞死因子-α、IL-6和IL-1β，這些被認(rèn)為是典型的M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物[12]。IL-8是一種趨化因子，通過促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞聚集到炎癥部位而在炎癥過程中發(fā)揮重要作用，與其他促炎細(xì)胞因子一樣，在炎癥性腸病患者中的含量也顯著增加。所以抑制M1巨噬細(xì)胞的極化是治療潰瘍性結(jié)腸炎的一種方法。

與對照組相比，**P<0.01，與LPS模型組相比，##P<0.01圖10 ELISA和qRT-PCR檢測老鸛草對細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子表達(dá)的影響Figure 10 The influence of Geranium wilfordii on the expression of cytokines by ELISA and qRT-PCR

與對照組相比,**P<0.01;與LPS模型組相比,##P<0.01圖11 老鸛草對M1巨噬細(xì)胞比例的影響Figure 11 The influence of Geranium wilfordii on the proportion of M1 macrophages

現(xiàn)代很多研究證實(shí)老鸛草具有抗菌、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗腹瀉等藥理作用[13-18]，其中槲皮素、木樨草素以及老鸛草素均被發(fā)現(xiàn)有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的作用；槲皮素具有活化M2型巨噬細(xì)胞的作用，有報(bào)道將槲皮素與能抑制M1型巨噬細(xì)胞的納米二氧化鈰連接后，其化合物顯著降低巨噬細(xì)胞M1和M2的比例[19]；鄭瑩團(tuán)隊(duì)[20]近期的的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)木犀草素通過上調(diào)hsa_circ_0001326的表達(dá)來促進(jìn)M2極化并抑制M1極化，從而介導(dǎo)了has-miR-136-5p和USP4的表達(dá)。有研究稱老鸛草素可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α和IL-6，以及ROS和NO。此外，老鸛草素可以上調(diào)SOCS1的表達(dá)，由于SOCS1是NF-κB活化的上游調(diào)節(jié)劑，可以直接與NF-κB-p65結(jié)合并下調(diào)其表達(dá)，從而抑制NF-κB活化[21]。大部分的實(shí)驗(yàn)均集中在老鸛草的提取物上，對于老鸛草水煎液調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的研究幾乎沒有。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，JUN、IL-6、PTGS2、FOS、EGF、MMP9、IL-8、MAPK1、CASP3、IL-1β的度值排名靠前，通路富集結(jié)果顯示治療靶點(diǎn)集中在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力、動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路。其中，腫瘤壞死因子信號通路在潰瘍性結(jié)腸炎的疾病發(fā)展中起著重要的作用，且與M1巨噬細(xì)胞極化有關(guān)，最近該通路中IL-6、IL-1β、IL-8及其上游信號調(diào)節(jié)蛋白NF-κB已成為治療炎癥性腸病的新的有希望的抗炎目標(biāo)[22]，且通路富集結(jié)果提示IL-6、IL-1β、IL-8富集在腫瘤壞死因子信號通路，因此選擇IL-1β、IL-6和IL-8進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，我們通過體外實(shí)驗(yàn)建立M1巨噬細(xì)胞極化模型，加入不同濃度的水煎液，利用ELISA及qRT-PCR測量IL-6、IL-8和IL-1β的濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明老鸛草的水煎液可以下調(diào)上述促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，最后我們通過流式細(xì)胞技術(shù)測量了不同分組M1巨噬細(xì)胞的比例，結(jié)果證實(shí)老鸛草水煎液可以顯著抑制M1型巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換；但本實(shí)驗(yàn)也有不足之處，我們未能對該通路的上游信號調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，所以老鸛草水煎液通過抑制M1細(xì)胞極化治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)中我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論分析，預(yù)測了中藥老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，最后通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了中藥老鸛草是通過抑制M1巨噬細(xì)胞極化進(jìn)一步下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)而達(dá)到治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的，為后續(xù)的試驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)。