孔令恒，高佳琳，張 景，徐臣年，孫 娜，魏 明，蘇興利*

(1西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,西安 710021；2西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院；3北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心外科；*通訊作者,E-mail:suxingli@xiyi.edu.cn)

阿霉素(doxorubicin, Dox)作為蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，具有抑制RNA和DNA合成的作用，臨床上常用于治療多種惡性腫瘤[1,2]。但Dox具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，尤其是不可忽視的心臟毒性問題，引起患者嚴(yán)重的心肌病和充血性心力衰竭等不良癥狀[3,4]。研究表明Dox引起心臟毒性的機(jī)制與增加氧化應(yīng)激、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶2、擾亂線粒體功能、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及自噬功能障礙等有關(guān)，并且具有時(shí)間和劑量依賴性與不可逆性的特點(diǎn)[5-7]。近來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Dox導(dǎo)致的心臟毒性中可能扮演了關(guān)鍵作用[8]。因此，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激成為防治Dox心臟毒性的潛在靶點(diǎn)。

二甲雙胍(metformin, Met)是治療2型糖尿病的一種一線口服降糖藥，可通過改善患者胰島素抵抗，促進(jìn)胰島素分泌以維持血糖穩(wěn)定[9]。除了降低血糖外，Met在抗炎、抗氧化應(yīng)激和改善線粒體功能方面的作用也逐漸被報(bào)道，并且Met可不依賴于降血糖而在心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[10-12]。已有研究發(fā)現(xiàn)Met可通過調(diào)節(jié)自噬減輕Dox誘導(dǎo)的心臟毒性[13]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的去乙?；福ㄟ^去乙?；喾N蛋白在心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[14-16]。然而，SIRT1在二甲雙胍改善Dox導(dǎo)致的心臟毒性中的作用還不清楚。本研究探討二甲雙胍能否通過調(diào)控SIRT1信號(hào)改善阿霉素心臟毒性，這將為二甲雙胍在阿霉素心臟毒性中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

從西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買60只雄性成年C57/BL6小鼠，體質(zhì)量在25～30 g；Met和Dox購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司；LDH含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。cleaved Caspase-3、Caspase-3、cytochrome C、PERK、p-eIF2α、GRP78、Ac-Foxo1和GAPDH購(gòu)買于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；SIRT1購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；TUNEL染色試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 模型制備和實(shí)驗(yàn)分組

將C57/BL6小鼠隨機(jī)分為4組(n=15)：對(duì)照組(sham組)、模型組(Dox組)、50 mg/kg Met+Dox組(低劑量組)和100 mg/kg Met+Dox組(高劑量組)；各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后再按不同分組處理。其中，sham組一次性腹腔注射生理鹽水0.15 ml，每日灌胃生理鹽水一次，連續(xù)7 d；Dox組一次性腹腔注射Dox(15 mg/kg)0.15 ml，每日灌胃生理鹽水一次，連續(xù)7 d；低劑量組一次性腹腔注射Dox(15 mg/kg)0.15 ml，每日灌胃50 mg/kg Met一次，連續(xù)7 d；高劑量組一次性腹腔注射Dox(15 mg/kg)0.15 ml，每日灌胃100 mg/kg Met一次，連續(xù)7 d。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟功能

2%異氟烷將C57/BL6小鼠快速麻醉，用脫毛膏將麻醉好的小鼠胸前區(qū)被毛脫去，將小鼠四肢固定在恒溫板的電極上，監(jiān)測(cè)心電變化。然后使用Vevo 2100超聲成像系統(tǒng)進(jìn)行經(jīng)胸壁超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。采用M超在心臟短軸乳頭肌水平測(cè)量并記錄心臟功能。用Vevo軟件計(jì)算各組心臟左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)和短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)。

1.4 HE染色觀察心肌纖維結(jié)構(gòu)變化

Dox腹腔注射7 d后，用2%異氟烷將各組小鼠麻醉，固定于小鼠手術(shù)臺(tái)，快速剪開胸腔，暴露心臟，取下心臟后放入4%多聚甲醛中固定24 h。梯度脫水復(fù)蠟，石蠟包埋后將蠟塊切成薄片，采用常規(guī)HE染色方法觀察心肌纖維的變化。

1.5 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡程度

嚴(yán)格按照Roche公司TUNEL染色試劑盒說明書的步驟，將心肌組織石蠟切片行脫蠟復(fù)水后，PBS洗3次，用0.5% Triton X-100室溫處理15 min，PBS洗3次，將TUNEL反應(yīng)液滴加在組織切片上，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗3次，避光滴加DAPI染色，37 ℃避光孵育10 min，滴加50%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡拍照；細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)100%。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取各組心肌組織蛋白，BCA定量后沸水煮10 min；蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，將條帶放入以下一抗管中：抗cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)、抗Caspase-3(1 ∶1 000)、抗cytochrome C(1 ∶1 000)、抗PERK(1 ∶1 000)、抗p-eIF2α(1 ∶1 000)、抗GRP78(1 ∶1 000)、抗Ac-Foxo1(1 ∶1 000)、抗SIRT1(1 ∶1 000)和抗GAPDH抗體(1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，用HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后用ECL化學(xué)顯影液檢測(cè)蛋白表達(dá)，Image Lab圖像軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Met減輕Dox引起的心肌損傷

HE染色結(jié)果顯示，sham組心肌纖維排列整齊有序，Dox組心肌纖維腫脹并出現(xiàn)明顯空泡化；與Dox組相比，低劑量組心肌纖維腫脹和空泡化減輕，高劑量組心肌纖維腫脹和空泡化改善更加明顯(見圖1)。與sham組比較，Dox組LVEF、LVFS以及HW/TL的比值降低(P<0.01)；與Dox組相比，低劑量組LVEF、LVFS和HW/TL的比值增加(P<0.05),高劑量組LVEF、LVFS和HW/TL的比值進(jìn)一步增加(P<0.01，見圖1)。與sham組比較，Dox組血清中LDH含量增加(P<0.01)，低劑量組血清中LDH含量降低(P<0.05)，高劑量組血清中LDH含量進(jìn)一步降低(P<0.01，見圖1)。

與sham組比較，##P<0.01；與Dox組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 二甲雙胍減輕Dox引起的心肌損傷 (×200)Figure 1 Metformin alleviates Dox-induced myocardial injury (×200)

2.2 二甲雙胍抑制Dox引起的細(xì)胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示，與sham組比較，Dox組cleaved Caspase-3、cytochrome C和Caspase-3蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；與Dox組比，低劑量組cleaved Caspase-3、cytochrome C和Caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，高劑量組cleaved Caspase-3、cytochrome C和Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.01，見圖2)。TUNEL染色結(jié)果顯示，與sham組比較，Dox組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01)；與Dox組相比，低劑量組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，高劑量組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低(P<0.01，見圖3)。

與sham組比較，##P<0.01；與Dox組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)Dox引起的心肌細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of metformin on Dox-induced myocardial apoptosis by Western blot

圖3 TUNEL染色檢測(cè)二甲雙胍對(duì)Dox引起的心肌細(xì)胞凋亡率的影響Figure 3 Effect of metformin on Dox-induced myocardial apoptotic rate by TUNEL staining

2.3 二甲雙胍抑制Dox引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

Western blot結(jié)果顯示，與sham組比較，Dox組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)增加，抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78蛋白表達(dá)減少(P<0.01)；與Dox組比較，低劑量組PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)降低，GRP78表達(dá)增加(P<0.05)，而高劑量組PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，GRP78表達(dá)增加(P<0.01，見圖4)。

與sham組比較，##P<0.01；與Dox組比較，*P<0.05，**P<0.01圖4 二甲雙胍抑制Dox引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激Figure 4 Metformin inhibits Dox-induced endoplasmic reticulum stress

2.4 二甲雙胍上調(diào)Dox引起的SIRT1信號(hào)

Western blot結(jié)果顯示，與sham組比較，Dox組SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低，Ac-Foxo1蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；與Dox組比較，低劑量組SIRT1蛋白表達(dá)增加，Ac-Foxo1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，而高劑量組SIRT1蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，Ac-Foxo1蛋白表達(dá)降低(P<0.01，見圖5)。

與sham組比較，##P<0.01；與Dox組比較，*P<0.05，**P<0.01圖5 二甲雙胍上調(diào)Dox導(dǎo)致的SIRT1抑制Figure 5 Metformin upregulates Dox-induced SIRT1 inhibition

3 討論

阿霉素是蒽環(huán)類化療藥物，具有很強(qiáng)的廣譜抗癌活性，是各類癌癥化療方案中常用的抗癌藥，由于具有較強(qiáng)的心臟毒性副作用，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，盡管存在誘發(fā)心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，阿霉素在癌癥治療方案中的使用量仍有所增加，然而當(dāng)累計(jì)劑量達(dá)到550 mg/m2時(shí)，患者心力衰竭的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加到26%[4]。因，為了增加阿霉素在癌癥治療中的應(yīng)用，如何降低其心臟毒性成為研究的重點(diǎn)。

阿霉素引起心臟毒性的一個(gè)重要表現(xiàn)是心臟功能降低和心肌組織病理學(xué)改變，如出現(xiàn)心肌纖維紊亂和空泡化，以及左心室收縮功能障礙，并逐步演變?yōu)樾牧λソ遊17]。心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的心肌細(xì)胞數(shù)量減少是其重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素導(dǎo)致心臟功能障礙和心肌損傷，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEF和LVFS值明顯降低，心肌纖維排列紊亂、腫脹、空泡化，HW/TL比值降低，LDH含量增加；同時(shí)，cleaved Caspase-3和cytochrome C蛋白表達(dá)增加，TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯增加。這些結(jié)果說明了阿霉素能夠引起心臟損傷。

二甲雙胍是廣泛用于治療2型糖尿病的一線降糖藥，可有效降低血糖，還可以降低2型糖尿病患者的全因死亡率和心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)以及糖尿病心力衰竭患者的死亡率[18]。已有研究表明，二甲雙胍能夠調(diào)節(jié)MAPK和AMPK信號(hào)通過自噬減輕阿霉素引起的心臟毒性[19]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)Met改善Dox引起的心臟功能障礙，降低MDA和LDH含量，并增加SOD活性[20]；此外，Met通過抑制ROS生成，改善線粒體能量代謝減少細(xì)胞凋亡[21]。但二甲雙胍能否通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕阿霉素導(dǎo)致的心臟毒性還不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲雙胍干預(yù)阿霉素組LVEF和LVFS值增加，心肌纖維排列改善、腫脹和空泡化減輕，HW/TL比值增加，LDH含量降低；另外，二甲雙胍還能降低cleaved Caspase-3和cytochrome C蛋白表達(dá)以及TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)二甲雙胍能夠改善阿霉素導(dǎo)致的心臟功能障礙和心肌損傷。

當(dāng)心肌細(xì)胞受刺激后，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白會(huì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，蛋白合成和分泌失調(diào)，激活未折疊蛋白反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15,16]。SIRT1是胞內(nèi)重要的去乙?；福罅垦芯勘砻鱏IRT1可通過減少細(xì)胞凋亡、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、改善線粒體功能等在心血管疾病中發(fā)揮重要保護(hù)作用[14-16,22]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素能明顯增加心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，降低SIRT1的表達(dá)，并上調(diào)乙?；疐oxo1的表達(dá)；而二甲雙胍能明顯抑制阿霉素引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，更為重要的是，二甲雙胍可以增加SIRT1的表達(dá)，并抑制乙酰化Foxo1的表達(dá)。這些結(jié)果提示，二甲雙胍通過激活SIRT1信號(hào)抑制阿霉素引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

綜述所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了二甲雙胍具有改善阿霉素心臟毒性的作用，并發(fā)現(xiàn)其作用與激活SIRT1信號(hào)、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究完善了二甲雙胍改善阿霉素心臟毒性的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。