張曉雨，原 博，李亞楠

(山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)教研室，太原 030001；#共同第一作者；*通訊作者，E-mail：liyanan0213@163.com)

癌癥已成為全球范圍內(nèi)的主要健康威脅，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，亟需精準(zhǔn)的早期診斷和有效治療策略來(lái)改善這一現(xiàn)狀[1]?；熓桥R床抗癌的主流手段之一，但大多數(shù)化療藥存在溶解性和選擇性不佳問(wèn)題，極大削弱其療效，并導(dǎo)致嚴(yán)重副作用，如胃腸道反應(yīng)、肝損傷、骨髓抑制和免疫抑制等[2]。蓬勃發(fā)展的納米技術(shù)使得基于納米顆粒(nanoparticles, NPs)的藥物遞送系統(tǒng)(drug delivery system, DDS)為解決上述問(wèn)題提供了新思路[3-7]。傳統(tǒng)溶液法制備過(guò)程所得納米藥物濃度較低，且缺乏對(duì)產(chǎn)物形貌、尺寸及分布、組分比例的精確控制[8-10]。針對(duì)這一問(wèn)題，本研究采用模板輔助法制備新型無(wú)載體且可臨床轉(zhuǎn)化的純藥納米系統(tǒng)，以臨床常用的廣譜抗癌藥物吉非替尼(gefitinib,GET)[11]和羥基喜樹(shù)堿(hydroxycamptothecin,HCPT)[12]為模型，制備多藥NPs核心并對(duì)其進(jìn)行表面功能化，評(píng)價(jià)該體系的腫瘤靶向性藥物釋放和協(xié)同抗癌效果，明確該可控制備策略的技術(shù)普適性，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

1 材料

1.1 儀器

掃描電子顯微鏡(SEM，S-4300冷場(chǎng)發(fā)射，加速電壓為5 kV，日本Hitachi公司)，透射電子顯微鏡(TEM，HF5000，加速電壓為200 kV，日本Hitachi公司)，共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM，德國(guó)徠卡公司)，UV-vis分光光度計(jì)(Perkin-Elmer Lambda 750 UV/Vis/NIR，PerkinElmer公司)，酶標(biāo)儀(SUNRISE，奧地利Tecan公司)，超純水系統(tǒng)(Millipore Milli-Q water purification system，美國(guó)Millipore公司)，納米粒度電位儀(Zetasizer Nano ZS，英國(guó)Malvern儀器公司)。

1.2 主要試劑

GET(純度>98%)和HCPT(純度>99%)購(gòu)自Knowshine(上海)藥物化學(xué)有限公司。PMHC18、氨基聚乙二醇單甲醚(PEG-NH2)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma-Aldrich，真空干燥24 h后使用。2-叔丁基-4-(二氰基亞甲基)-6-[2-(1,1,7,7-四甲基久洛尼定-9-基)乙烯基]-4H-吡喃(DCJTB)購(gòu)自J&K Scientific Ltd。N-羥基琥珀酰亞胺、二甲亞砜、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶-EDTA(0.5%胰蛋白酶、5.3 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)四鈉)和抗生素青霉素-鏈霉素(100 U/ml)購(gòu)自Invitrogen。超純?nèi)ルx子水來(lái)自美國(guó)Millipore公司Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)(電阻率為18.2 MΩ·cm)。陽(yáng)極氧化鋁(anodic aluminum oxide, AAO)模板購(gòu)自合肥普源納米科技有限公司。人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549來(lái)源于美國(guó)菌種保存中心。

1.3 GET+HCPT納米顆粒的制備和表面功能化

采用AAO模板輔助法制備納米藥物，并對(duì)其表面功能化[13]。將直徑1 cm、厚度約40 μm的AAO模板放在裝有燒結(jié)圓盤(pán)的Buchner漏斗上，將漏斗放在與真空泵相連的過(guò)濾瓶上，真空泵用來(lái)維持AAO模板上的壓差。將GET和HCPT按1:1摩爾比混合溶液(DMF，1 ml，20 mmol/L)滴加到AAO模板中，所得NPs按模板孔徑大小生長(zhǎng)。重復(fù)上述配置藥物、滴加藥物、真空處理步驟，以制得高濃度納米藥物。本研究中提到的其他納米藥物體系也按上述步驟制得。PMHC18-PEG參照文獻(xiàn)方法[14]合成。將200 μl PMHC18-PEG水溶液快速加入1 ml NPs分散液中超聲15 min，PMHC18-PEG通過(guò)非共價(jià)疏水相互作用固定在NPs表面，對(duì)其進(jìn)行表面功能化，得到穩(wěn)定的核-殼型多組分協(xié)同體系。用SEM和TEM觀察多功能納米顆粒(MNPs)形貌和尺寸。

1.4 考察GET+HCPT MNPs的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將多功能納米顆粒(multifunctional nanoparticles, MNPs)懸浮液置于PBS中，室溫保存。分別于0，6個(gè)月取樣本，用TEM和動(dòng)態(tài)光掃描(dynamic light scanning,DLS)觀察測(cè)量NP大小。每次掃描10次，以5次測(cè)量的平均值作為報(bào)告數(shù)據(jù)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)A549細(xì)胞，采用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化細(xì)胞并傳代。選擇指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。

1.6 GET+HCPT MNPs的細(xì)胞內(nèi)吞

將A549細(xì)胞以50 000個(gè)/孔接種于24孔板中培養(yǎng)24 h(37 ℃，5%CO2)，加入高量子產(chǎn)率紅色熒光染料DCJTB摻雜的雙藥NPs。分別孵育30 min，1 h，2 h，3 h(37 ℃，5%CO2)，30 min，2 h(4 ℃，5%CO2)。PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛固定。用CLSM在514 nm激光激發(fā)下對(duì)腫瘤細(xì)胞掃描成像，采集發(fā)射波長(zhǎng)在550～650 nm范圍內(nèi)的熒光信號(hào)，以不含MNPs的空白體系作對(duì)照，以評(píng)價(jià)納米藥物被A549細(xì)胞內(nèi)吞效果、明確內(nèi)吞機(jī)制。

1.7 GET+HCPT MNPs的抗腫瘤活性

將A549細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，5組藥物分別為：游離GET、游離HCPT、GET NPs、HCPT NPs和GET+HCPT NPs，每組藥物濃度梯度均為0.001，0.01，0.1，1，10 μmol/L。分別孵育24 h和48 h，PBS緩沖液(2×150 μl)洗滌細(xì)胞，用MTT法測(cè)定各藥物組與對(duì)照組的細(xì)胞存活率。采用不同批次細(xì)胞重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以3次測(cè)量的平均值作為報(bào)告數(shù)據(jù)。在明確MNPs穩(wěn)定性和內(nèi)化能力基礎(chǔ)上，采用MTT比色法，通過(guò)檢測(cè)570 nm處的吸光度評(píng)價(jià)MNPs對(duì)A549細(xì)胞的抗腫瘤活性。

1.8 GET+HCPT MNPs的普適性研究

將該模板法制備策略用于可控制備其他多種抗癌藥物納米結(jié)構(gòu)。通過(guò)SEM觀察該模板法制備出的紫杉醇NPs、他莫西芬NPs、替尼泊苷NPs、甲氨蝶呤NPs及GET NPs、GET納米棒(NRs)、GET NPs+NRs(NP占主導(dǎo))、GET NPs+NRs(NR占主導(dǎo))，明確其普適性。

2 結(jié)果

2.1 GET+HCPT MNPs的制備和表面功能化

采用模板輔助法制備GET+HCPT MNPs，設(shè)計(jì)合成一種兩親性功能試劑PMHC18-PEG，并用質(zhì)子核磁共振(1H NMR)對(duì)其進(jìn)行表征。用SEM和TEM觀察NPs形貌和結(jié)構(gòu)。采用該方法可大量制備尺寸均勻的NPs(50 nm)，有利于其穿過(guò)核孔復(fù)合體且具有較長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間(見(jiàn)圖1A，1B)。由于顆粒表面存在水合層，DLS直徑稍大于SEM和TEM結(jié)果(見(jiàn)圖1C)。由于電子穿透性不同，功能化NPs的核-殼結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，顆粒表面均勻附著10 nm的PEG保護(hù)層(見(jiàn)圖1D)。

圖1 SEM和TEM表征MNPs的形貌和結(jié)構(gòu)Figure 1 The morphology and structure of MNPs characterized by SEM and TEM

2.2 GET+HCPT MNPs的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

TEM和DLS結(jié)果顯示，功能化NPs粒徑大小在孵育期間甚至儲(chǔ)存6個(gè)月時(shí)均無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖2)。

A.新制備MNPs的TEM結(jié)果B.新制備和儲(chǔ)存6個(gè)月時(shí)MNPs的DLS結(jié)果圖2 MNPs的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Figure 2 Storage stability of MNPs

2.3 GET+HCPT MNPs的細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程

結(jié)果表明，MNPs可迅速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞(見(jiàn)圖3)。培養(yǎng)初期，細(xì)胞內(nèi)幾乎無(wú)紅色熒光，隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，熒光逐漸出現(xiàn)，3 h達(dá)到峰值且保持高信噪比(見(jiàn)圖3)。在37 ℃孵育的細(xì)胞中檢測(cè)到強(qiáng)紅色熒光信號(hào)，而4 ℃孵育的細(xì)胞中熒光信號(hào)較弱(見(jiàn)圖4)。

圖3 DCJTB摻雜MNPs在37 ℃下孵育A549細(xì)胞不同時(shí)間的CLSM結(jié)果Figure 3 CLSM of A549 cells after incubation with DCJTB-doped MNPs for different time

2.4 GET+HCPT MNPs的抗腫瘤活性

所有給藥形式的細(xì)胞存活率在48 h內(nèi)逐漸增強(qiáng)。與游離分子相比，納米藥物表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性(見(jiàn)圖5和圖6)。與單藥和簡(jiǎn)單混合體系相比，雙藥NPs可同時(shí)且成比例地遞送組合藥物，使其聯(lián)合效果最大化。不同劑量(0～200 μg/ml)PMHC18-PEG作用于A549細(xì)胞結(jié)果顯示，在所有濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率都在95%以上(見(jiàn)圖7)。

2.5 普適性研究

本研究所使用的納米藥物制備和應(yīng)用策略可以直接擴(kuò)展到其他疏水藥物，如制備紫杉醇NPs、他莫西芬NPs、替尼泊苷NPs和甲氨蝶呤NPs(見(jiàn)圖8)。分別重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟“配置藥物、滴加藥物、真空處理”1，2，5，10次，易獲得不同配比的GET NP、NR以及NP+NR混合物(見(jiàn)圖9)。

A.37 ℃下孵育30 min的CLSM結(jié)果;B.37 ℃下孵育1 h的CLSM結(jié)果;C.37 ℃下孵育2 h的CLSM結(jié)果;D.37 ℃下孵育3 h的CLSM結(jié)果;E.37 ℃下孵育30 min的CLSM結(jié)果;F.37 ℃下孵育2 h的CLSM結(jié)果;G.4 ℃下孵育30 min的CLSM結(jié)果;H.4 ℃下孵育2 h的CLSM結(jié)果圖4 不同溫度下DCJTB摻雜MNPs孵育A549細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程Figure 4 Endocytosis of DCJTB-doped MNPs at different temperature at different time

圖6 游離GET+HCPT和GET+HCPT MNPs的體外細(xì)胞毒性Figure 6 In vitro cytotoxicity of free GET+HCPT and GET+HCPT MNPs

圖7 PMHC18-PEG的體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)Figure 7 In vitro cytotoxicity experiment on PMHC18-PEG

圖8 模板輔助法制備不同藥物NPs的SEM結(jié)果Figure 8 SEM of different drug NPs prepared by template-assisted method

圖9 模板輔助法制備不同形貌GET的SEM結(jié)果Figure 9 SEM of GET with different morphology prepared by template-assisted method

3 討論

基于NPs的DDS為腫瘤協(xié)同診療提供了新思路，盡管基于各種載體材料的多功能納米結(jié)構(gòu)在過(guò)去幾年中已經(jīng)引起研究者的極大關(guān)注[15-17]，但如何有效地將多個(gè)組分成比例地裝載到單個(gè)NP中仍然面臨巨大挑戰(zhàn)[18]。此外，惰性載體的存在引起一系列問(wèn)題，如載藥量低[19-21]，潛在毒性[22]，合成成本高且耗時(shí)長(zhǎng)[23]，藥物-載體匹配模式及其在體液中的分散特性尚不明確[24]。近年來(lái)，多種無(wú)載體納米構(gòu)筑策略已被廣泛應(yīng)用于癌癥管理[25]。然而，目前廣泛使用的液相無(wú)載體制備策略缺乏對(duì)NPs形貌、組分比例、尺寸及分布的精確控制。與之相比，AAO模板輔助法具有獨(dú)特性能，如模板孔徑可達(dá)200 nm且均勻可調(diào)，高比表面積(高達(dá)250 m2/g)，高孔隙率(1010孔/cm2)，高度有序、單分散，良好的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、機(jī)械穩(wěn)定性及生物相容性，低成本[26,27]等，因而在制備納米材料和陣列方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。盡管已在納米材料、光學(xué)器件、磁性材料、生物傳感等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，但以AAO為模板，大量制備形貌尺寸精確可控的多功能納米DDS較少報(bào)道[28]。

本研究在AAO模板輔助下，將GET和HCPT制備成復(fù)合NPs，用兩親性表面活性劑對(duì)其功能化，所得DDS載藥量增加，載體毒性和代謝負(fù)擔(dān)降低，治療效率有所提高。TEM、DLS與SEM結(jié)果表明，引入PMHC18-PEG使NPs具有均勻尺寸、延長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、可穿過(guò)核孔復(fù)合體并抵抗網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除能力、良好的水分散性和生理環(huán)境穩(wěn)定性，提高載藥量，進(jìn)而提高療效并減少副作用，促進(jìn)其體內(nèi)外抗腫瘤治療應(yīng)用。通過(guò)紅色熒光染料標(biāo)記揭示能量依賴(lài)的內(nèi)吞作用是納米藥物進(jìn)入細(xì)胞的主要機(jī)制。在明確MNPs穩(wěn)定性和內(nèi)化能力基礎(chǔ)上，采用MTT比色法，通過(guò)檢測(cè)570 nm處的吸光度評(píng)價(jià)MNPs對(duì)A549細(xì)胞的抗腫瘤活性，結(jié)果表明，給藥組的抗腫瘤活性均歸因于內(nèi)化MNPs釋放的藥物分子，與游離分子相比，納米藥物表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性；與單藥和簡(jiǎn)單混合體系相比，雙藥NPs可同時(shí)且成比例地遞送組合藥物，使其聯(lián)合效果最大化。在簡(jiǎn)單混合系統(tǒng)中，NPs的攝取差異和細(xì)胞內(nèi)藥物的隨機(jī)分布可能會(huì)影響藥物聯(lián)合療效，但雙藥MNPs可同時(shí)且成比例地給藥。因而，將兩種藥物組合成一個(gè)NP可顯著提高單藥及協(xié)同活性。進(jìn)一步研究表明，所用表面功能化分子無(wú)明顯毒副作用，具有良好的生物相容性和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。本研究所使用的納米藥物制備和應(yīng)用策略可以直接擴(kuò)展到其他疏水藥物，以制備更復(fù)雜的單藥、多藥或藥物-顯像劑組合系統(tǒng)。通過(guò)改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)，易獲得不同配比的GET NP、納米棒(NR)以及NP+NR混合物。更復(fù)雜的系統(tǒng)可以進(jìn)行類(lèi)似調(diào)整，以構(gòu)建用途更廣泛的生物相容性多功能納米平臺(tái)。

這種新型的納米藥物構(gòu)筑策略制備簡(jiǎn)單、技術(shù)普適，所得納米藥物尺寸可控、載藥量高、穩(wěn)定性好、可滿足按順序和比例裝載不同組分以制備更智能載藥系統(tǒng)的要求，并優(yōu)化藥物效率和藥代動(dòng)力學(xué)，以高效治療癌癥。更智能的復(fù)合系統(tǒng)可進(jìn)行類(lèi)似調(diào)整，以構(gòu)建用途更廣泛的生物相容性多功能納米平臺(tái)，如可通過(guò)引入成像造影劑，獲得用于診斷的DDS。綜上可知，AAO模板輔助法可作為一種制備MNP平臺(tái)的通用策略來(lái)實(shí)現(xiàn)診療協(xié)同，并降低毒副作用，具有廣泛應(yīng)用前景。偶聯(lián)主動(dòng)靶向配體增強(qiáng)體內(nèi)外抗腫瘤活性的研究正在進(jìn)行中，將在下一步工作中系統(tǒng)報(bào)道。