馬小平，蔡 爽，賈浴偵，鄧朝偉，趙凌宇

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，西安 710061；*通訊作者,E-mail:zhaolingyu@xjtu.edu.cn)

胃癌(gastric cancer，GC)是全球常見的惡性腫瘤之一，其總體癌癥發(fā)生率和癌癥相關(guān)死亡率分別為第5位和第4位[1,2]。晚期胃癌根治性切除術(shù)后的復(fù)發(fā)率高達(dá)39%～60.8%[3,4]，輔助化療可作為晚期胃癌的可選手段，使5年生存率從35%提高到40%[5]。盡管一系列靶向藥物已用于GC的治療，但單靶向藥物的治療效果非常有限而且很容易產(chǎn)生耐藥性[6-8]。胃癌發(fā)生是一個(gè)多步驟的過程，涉及眾多的遺傳和環(huán)境因素[9,10]。因此，進(jìn)一步闡明胃癌發(fā)生的分子機(jī)制，已成為胃癌研究的關(guān)鍵。Rab蛋白(Rabs)屬于小G蛋白的“Ras超家族”，它們在囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控中發(fā)揮著不可或缺的作用，包括囊泡形成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的對接和融合[11-13]。Rab蛋白已被證實(shí)在各種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并與發(fā)病機(jī)制相關(guān)[14-18]。Rab6A是Rab6的4種亞型之一，Rab6A′和Rab6A的差異僅為3個(gè)氨基酸，Rab6B氨基酸序列與Rab6A′和Rab6A有91%的相似，只在C端存在差異；Rab6C由RAB6A′ mRNA反轉(zhuǎn)錄而來[19]。目前還沒有Rab6A在胃癌的功能的研究報(bào)道，因此非常有必要探究Rab6A在胃癌中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。本研究通過檢測53例胃癌患者的胃癌組織和癌旁組織樣本中Rab6A的表達(dá)水平和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探究Rab6A對胃癌的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡以及AKT/p38信號通路相關(guān)分子的影響，為闡明Rab6A影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源

本研究自2014年5月至2015年6月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科收集胃癌患者的術(shù)后胃癌組織和癌旁正常胃組織樣本各53例，提取所有組織樣本總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測Rab6A在胃癌和癌旁組織中的mRNA表達(dá)變化，提取12對胃癌組織及癌旁組織蛋白，采用Western blot分析Rab6A在這兩種不同組織中的蛋白表達(dá)變化。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、ECL化學(xué)增光劑、血清購于美國Thermo fisher公司；MTT、RnaseA、RIPA裂解緩沖液、碘化丙啶(PI)、青鏈霉素購于美國Sigma公司；Annexin Ⅴ-FITC凋亡試劑盒購于美國BD Bioscience公司；所有一抗和二抗均購于中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000和TRIzol Reagent購自于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa Ex Taq HS和SYBRR Premix Ex TaqTM kit購于中國TaKaRa公司。iQ5 Multicolor Real-Time PCR儀、垂直電泳儀、濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)、二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國Bio-Rad公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購于美國Bio-Tek公司；FASCalibar流式細(xì)胞儀購于美國FALS CALIBAR BD公司；GBOX-HR全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購于英國Syngene公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

胃癌細(xì)胞BGC-823和SGC-7901由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部教育部環(huán)境與基因相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BGC-823細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞分別分為3組：陰性對照組、siRNA-1組和siRNA-2組，分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA(60 nmol/L)、Rab6A siRNA-1(60 nmol/L)和Rab6A siRNA-2(60 nmol/L)，用于后續(xù)的細(xì)胞行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)分析Rab6A在胃癌中表達(dá)

通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome altas, TCGA)與基因型-組織表達(dá)工程(the genotype-tissue expression project，GTEX)數(shù)據(jù)(https://xena.ucsc.edu)分析Rab6A在胃癌組織中的表達(dá)，R software(4.1.1)用于數(shù)據(jù)的可視化。

1.5 siRNA合成與轉(zhuǎn)染

采用小干擾RNA(siRNAs)沉默人Rab6A基因用以探究其細(xì)胞學(xué)功能及可能的分子機(jī)制。具體序列如下：Rab6A siRNA-1 sense：5′-GAGCGGUUCAGGAGCUUGATT-3′，antisense：5′-UCAAGCUCCUGAACCGCUCTT-3′；Rab6A siRNA-2 sense：5′-CAGCUGUAGUAGUUUACGATT-3′，antisense：5′-UCGUAAACUACUACAGCUGTT-3′；NC-siRNA sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，antisense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；均由中國上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。依照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整適宜細(xì)胞濃度接種于96或6孔板中，置37 ℃孵箱中培養(yǎng)過夜，siRNA稀釋到60 nmol/L進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且該濃度用于后續(xù)探究Rab6A的細(xì)胞功能和分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)中。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測胃癌組織和細(xì)胞中Rab6A的表達(dá)變化

采用實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測53對胃癌組織和癌旁正常組織和轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs的胃癌細(xì)胞BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中Rab6A mRNA水平表達(dá)變化。胃癌組織取樣于2 ml EP管中，加入TRIzol試劑1 ml，用勻漿機(jī)震蕩破碎。接著根據(jù)生產(chǎn)制造商說明，提取已破碎的人胃癌組織和癌旁正常組織和轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs的胃癌細(xì)胞BGC-823和SGC-7901的總RNA。使用SYBR Green PCR Master Mix和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑檢測Rab6A mRNA的表達(dá)水平。采用iCycler iQ多色qRT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參對照，采用2-ΔΔCt方法來分析Rab6A mRNA的相對表達(dá)量。引物序列包括Rab6A上游引物：5′-CTTGGAGGATCGAACAGTAC-3′，下游引物：5′-GATATCATAAACAACAACTGCCA-3′；GAPDH上游引物：5′-GCCACATTACTCAGACAC-3′，下游引物：5′-GCCCA ATACGGTCAAATCC-3′。

1.7 MTT法檢測胃癌細(xì)胞增殖

以1.3實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，BGC-823細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞以3 000個(gè)細(xì)胞/孔分別接種于96孔板，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl培養(yǎng)基，孵育24 h。轉(zhuǎn)染后再分別培養(yǎng)24，48，72 h，每孔加10 μl 5 mg/ml MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清并加入150 μl DMSO，利用酶標(biāo)儀在492 nm波長下檢測吸光度。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測胃癌細(xì)胞周期

為了闡明Rab6A siRNAs抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞增殖是否是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)阻滯所致，進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。以1.3分組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，BGC-823和SGC-7901細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔分別接種于6孔板，每孔2 ml培養(yǎng)基。過夜后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染。再培養(yǎng)24 h，然后收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次。然后用1 ml 70.0%冰冷乙醇4 ℃過夜固定。PBS洗滌2次，加入50 μl濃度為100 μg/ml的無DNase的RNaseA，重懸細(xì)胞；再加入50 μl濃度為100 μg/ml PI染液，混合均勻，室溫下避光孵育15 min。最后，通過流式細(xì)胞儀(FACS)檢測細(xì)胞內(nèi)PI含量，并用ModFit軟件(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)分析細(xì)胞周期不同時(shí)相細(xì)胞比例。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測胃癌細(xì)胞凋亡

以1.3分組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，再培養(yǎng)48 h，然后收集包括上清在內(nèi)的各組細(xì)胞，然后用PBS清洗2次。用300 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使其濃度為1×105/ml。取100 μl細(xì)胞懸液加入到5 ml流式管中，再加入5 μl 10 μg/ml Annexin Ⅴ/FITC和5 μl 20 μg/ml碘化丙啶，避光混勻，孵育15 min。在流式管中加入400 μl PBS。用流式細(xì)胞儀檢測染色細(xì)胞，采用ModFit軟件分析細(xì)胞凋亡。

1.10 Western blot檢測胃癌組織和胃癌細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

為了研究Rab6A在胃癌組織中的表達(dá)和Rab6A siRNAs對BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中AKT/p38信號通路的影響，采用Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。使用RIPA裂解緩沖液裂解12對胃癌組織及其癌旁組織和以1.3分組培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染的細(xì)胞樣本。用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠分離總蛋白，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。將膜與包括Rab6A兔多克隆抗體(1 ∶1 000)、p-AKT兔單克隆抗體(1 ∶2 000)、AKT鼠單克隆抗體(1 ∶5 000)、p38兔單克隆抗體(1 ∶500)、p-p38兔單克隆抗體(1 ∶1 000)、CDK4兔單克隆抗體(1 ∶2 500)、細(xì)胞周期蛋白D1鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)和GAPDH鼠單克隆抗(1 ∶4 000)孵育。隨后用ECL試劑處理膜進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。通過CCD相機(jī)檢測發(fā)光信號，并用Syngene GBox記錄并定量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件繪圖。以P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1 Rab6A在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)

qRT-PCR結(jié)果顯示：與癌旁組織相比，88.68%(47/53)的胃癌組織樣本中Rab6A mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01，見圖1A)。Western blot分析顯示，與癌旁組織相比，Rab6A在胃癌組織的蛋白水平顯著高表達(dá)(P<0.01，見圖1B)。TCGA聯(lián)合GTEX數(shù)據(jù)庫分析表明，與胃組織相比，Rab6A在胃癌組織高表達(dá)(P<0.01，見圖1C)，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

與癌旁組織比較，**P<0.01圖1 Rab6A在胃癌組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of Rab6A in gastric cancer tissues

2.2 轉(zhuǎn)染siRNAs可以沉默胃癌細(xì)胞中Rab6A的表達(dá)

與陰性對照相比，在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中siRNA-1組和siRNA-2組Rab6A mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01，見圖2)。與陰性對照組相比，BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中siRNAs組Rab6A蛋白表達(dá)也均明顯下調(diào)(P<0.01，見圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs抑制胃癌細(xì)胞增殖

與陰性對照組相比，BGC-823和SGC-7901中沉默Rab6A 24 h時(shí)吸光度無顯著差異；48 h和72 h時(shí)OD492 nm值均顯著降低(P<0.01，見圖3)。表明沉默Rab6A表達(dá)可抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞增殖。

2.4 轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs對胃癌細(xì)胞周期的影響

在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中，與陰性對照組相比，Rab6A siRNA-1組和siRNA-2組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.01，見圖4)。表明沉默Rab6A可抑制BGC-823和SGC-7901細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。

與陰性對照組比較，**P<0.01圖2 在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs后Rab6A表達(dá)變化Figure 2 Changes of Rab6A expression after transfection with Rab6A siRNAs in gastric cancer cells

A.轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs對BGC-823細(xì)胞增殖的影響B(tài).轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響與陰性對照組比較，**P<0.01圖3 Rab6A siRNAs對胃癌細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effects of Rab6A siRNAs on the proliferation of gastric cancer cells

2.5 轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡

在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中，與陰性對照組相比，siRNA-1組和siRNA-2組早期和晚期凋亡細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01，見圖5)。表明沉默Rab6A顯著促進(jìn)BGC-823和SGC-7901細(xì)胞凋亡。

A.轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs對BGC-823細(xì)胞周期影響B(tài).轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs對SGC-7901細(xì)胞周期影響與陰性對照組比較，**P<0.01圖4 Rab6A siRNAs對胃癌細(xì)胞周期的影響Figure 4 Effects of Rab6A siRNAs on cell cycle of gastric cancer cells

A.轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs對BGC-823細(xì)胞凋亡影響B(tài).轉(zhuǎn)染Rab6A siRNAs對SGC-7901細(xì)胞凋亡影響與陰性對照組比較，**P<0.01圖5 Rab6A siRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 Effects of Rab6A siRNAs on apoptosis of gastric cancer cells

2.6 在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Rab6AsiRNAs調(diào)控AKT/p38信號通路

為了進(jìn)一步研究Rab6A誘導(dǎo)BGC-823和SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，沉默Rab6A后，采用Western blot檢測AKT/p38信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，與陰性對照相比，Rab6A siRNA-1組和Rab6A siRNA-2組BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中p-AKT、CDK4和Cyclin D1表達(dá)顯著下降，p-p38表達(dá)顯著上升(P<0.01，見圖6)。

3 討論

Rab蛋白是膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中不可缺少的組分，可調(diào)控許多腫瘤相關(guān)蛋白的分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、再循環(huán)和降解，如β-整合素、表皮生長因子受體和基質(zhì)金屬蛋白酶等[20-22]。Rabs在癌癥中作為腫瘤促進(jìn)因子或抑制因子發(fā)揮作用[18,23,24]。Rabs的失調(diào)導(dǎo)致囊泡運(yùn)輸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的破壞，從而影響細(xì)胞生長和行為，促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展[14]。Rab6參與高爾基體和細(xì)胞質(zhì)囊泡的組成，調(diào)節(jié)高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核仁之間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[25,26]。同時(shí)，Rab6介導(dǎo)的蛋白分泌參與細(xì)胞骨架的組織和mRNA[27,28]的轉(zhuǎn)運(yùn)。Rab6蛋白廣泛參與細(xì)胞黏附、遷移等多種生理活動(dòng)[29-32]，其在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，其過表達(dá)可以抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖和克隆形成[33]。而Rab6A作為Rab6家族的主要成員之一，其在胃癌中的功能及作用機(jī)制還尚未見報(bào)道。

本研究中Rab6A在胃癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，提示Rab6A在胃癌中可能作為癌基因而發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)沉默Rab6A的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞增殖活力降低，細(xì)胞主要阻滯到G1期，細(xì)胞凋亡明顯增加。這與RAS癌基因家族的Rab11A在食管癌[34]中的作用、Rab1A在膠質(zhì)瘤[35]和結(jié)腸癌[36]中的作用一致，均發(fā)揮著癌基因的作用。接著探究了沉默Rab6A影響胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。AKT信號通路是癌癥中細(xì)胞增殖信號通路之一，經(jīng)常被激活，從而調(diào)節(jié)許多下游蛋白質(zhì)的功能，這些蛋白質(zhì)參與癌癥細(xì)胞存活、增殖、遷移等[37]。CDK4和細(xì)胞周期蛋白D1就是這些蛋白中的代表，這二者是G0/G1期的關(guān)鍵調(diào)控因子，其形成的復(fù)合物可調(diào)節(jié)G1/G0期至S期的進(jìn)程[38,39]。在本研究中沉默Rab6A后p-AKT、CDK4和Cyclin D1表達(dá)顯著下降。這暗示沉默Rab6A通過影響AKT信號通路進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。p38 MAP激酶是MAPKs家族的重要成員。p38 MAP激酶的磷酸化可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制其磷酸化可減少細(xì)胞死亡[40]。本研究中沉默Rab6A后p-p38表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡增加，這說明沉默Rab6A通過影響MAPK p38信號通路來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。

與陰性對照組比較，**P<0.01圖6 Rab6A siRNAs對AKT/p38信號通路的影響Figure 6 Effects of Rab6A siRNAs on AKT/p38 signaling pathways

總而言之，沉默Rab6A可通過影響AKT/p38信號通路相關(guān)的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本次研究首次證明Rab6A在胃癌的表達(dá)及功能，為進(jìn)一步探究Rab6A在胃癌中的作用網(wǎng)絡(luò)打下了基礎(chǔ)，也為胃癌進(jìn)一步研究和治療提供新思路。