楊若璇，唐凱偉，朱成林，陳娟，刀筱芳，唐俊妮

（西南民族大學食品科學與技術學院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川成都 610041）

沙門氏菌（Salmonella）是世界范圍內引起食品公共安全問題的主要食源性致病菌之一，被列為牛乳及其制品中微生物檢測的主要對象之一[1]。牛乳品質的好壞與否取決于奶牛養(yǎng)殖場的環(huán)境以及牛乳生產(chǎn)加工各環(huán)節(jié)的衛(wèi)生狀況[2]。沙門氏菌會引起奶牛腹瀉[3]，減低奶牛產(chǎn)奶量，導致牛乳品質降低，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失[4]。為了防止奶牛感染致病菌，在養(yǎng)殖期間使用抗生素、消毒劑，甚至濫用抗生素成了主要的防控手段[5,6]。每年我國在養(yǎng)殖場中都會過量使用抗生素，導致我國抗生素的使用量在全球的占比很高[7]。這也導致養(yǎng)殖場中耐藥細菌的廣泛存在[8]。奶牛養(yǎng)殖業(yè)目前呈現(xiàn)出規(guī)?；陌l(fā)展，導致奶牛養(yǎng)殖密度變大，病原微生物傳播途徑縮短，有效的消毒殺菌是奶牛養(yǎng)殖場防控致病性微生物的重要保障[9]。Shaibu 等[10]通過對屠宰場被屠宰的牛以及加工環(huán)境標本中的沙門氏菌進行抗菌譜測定，發(fā)現(xiàn)分離菌株對3～5 種抗生素產(chǎn)生抗性，表現(xiàn)為多重耐藥。趙俊利等[11]針對內蒙古地區(qū)奶牛源致病性沙門氏菌的耐藥特性及基因分析，發(fā)現(xiàn)內蒙古地區(qū)奶牛源致病性沙門氏菌對甲氧芐啶及磺胺甲基異唑的耐藥率最高（97.4%），對多數(shù)β-內酰胺類、氨基糖甙類、氯霉素類及四環(huán)素類藥物的耐藥性也較為嚴重（耐藥率為40%～80%），菌株的多重耐藥率為94.7%，提示臨床抗菌藥物不合理使用可能是該地區(qū)奶牛源沙門氏菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因。消毒劑是目前食源性致病菌防控的有效手段[12]，廣泛用于控制食品生產(chǎn)設施和環(huán)境中的微生物污染[13]。但是，消毒劑的廣泛使用同樣引起人們對其可能參與抗生素耐藥性發(fā)展的擔憂，特別是對抗生素共同耐藥的關注[14]。李幗寧等[15]揭示了社區(qū)環(huán)境中分離鑒定的沙門氏菌以B 群鼠傷寒沙門菌為主要菌型，其耐消毒劑基因攜帶率較高，并且以qacEΔ1基因為主要攜帶類型，菌株對消毒劑和抗生素抗性具有協(xié)同效應。沙門氏菌可從畜禽動物宿主中獲得耐藥性，通過食物鏈引起人類感染[16]。只有科學管理和合理使用抗生素，才能有效控制人畜共患沙門氏菌病，保障食品安全和人類健康[17]。因此，調查奶牛場沙門氏菌分離株的流行特征和抗性分析，可為奶牛場沙門氏菌的防控以及抗生素、消毒劑的合理使用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標準菌株和實驗材料

本試驗所需主要培養(yǎng)基及試劑見表1。陽性對照菌株為沙門氏菌H9812（SalmonellaH9812），由本實驗室保存。

表1 主要培養(yǎng)基及試劑Table 1 Main media and reagents

1.2 主要儀器

本試驗所需主要儀器見表2。

表2 主要儀器Table 2 Main instruments

1.3 樣品采集

2020 年7 月至11 月，分五個批次從成都市某規(guī)?；膛龅沫h(huán)境、產(chǎn)奶過程各環(huán)節(jié)、以及奶牛糞樣中共采集700 份樣品。其中，奶牛場環(huán)境樣品78 份，健康奶牛糞樣88 份，健康奶牛乳頭89 份，健康奶牛奶樣48 份，擠奶器89 份，腹瀉奶牛糞樣118 份，腹瀉奶牛環(huán)境97 份，腹瀉奶牛乳頭49 份，乳房炎奶牛糞樣44 份。

1.4 細菌分離、鑒定與血清型鑒別

參照國標GB 4789.4-2016《食品安全國家標準 食品微生物學 沙門氏菌檢驗》方法進行樣品分離鑒定。使用水浴法提取沙門氏菌的DNA 模板[18]，以沙門氏菌的特異性invA基因引物進行PCR 擴增，具體引物序列為：上游引物：CCCTTTGCGAATAACATCC；下游引物：ATTACTTGTGCCGAAGAGCC[18]。PCR 反應體系20 μL：包含Taq 1.1×T3 Super PCR Mix 17 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反應條件：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性20 s；56 ℃退火10 s；72 ℃延伸30 s；共35 個循環(huán)，72 延伸2 min。沙門氏菌的血清型參照沙門氏菌屬診斷血清說明書進行操作，鑒定結果參考國家標準GB/T 4789.4-2010《沙門氏菌檢驗標準》進行判斷。

1.5 藥敏試驗

藥敏試驗參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards in Stitute，CLSI）推薦的Kirby-Bauer 紙片擴散法，結果按照CLSI 的標準進行判定[19]。藥敏紙片購置于賽默飛公司，抗生素類型與使用劑量見表3。

表3 抗生素藥物及其使用劑量Table 3 The antibiotic drugs and their dosages

1.6 耐藥基因、毒力基因、抗消毒劑基因檢測

DNA 模板制備同1.4，采用PCR 擴增27 種耐藥基因，13 種毒力基因，5 種抗消毒劑基因，其引物序列、擴增片段長度及退火溫度見表4，PCR 反應體系同1.4。

表4 耐藥基因、毒力基因、抗消毒劑基因引物序列信息Table 4 Primer sequence information of drug resistance genes,virulence genes and antidisinfectant gene

續(xù)表4

1.7 對不同消毒劑MIC 值的測定

根據(jù)消毒劑化學結構以及作用機理特征，參考CLSI 推薦方法及判斷標準法測定不同消毒劑對沙門氏菌MIC 值[19]，采用二倍稀釋法，將9 種消毒劑（表5），以消毒劑廠家推薦噴霧使用濃度為中間值，分別向上、向下稀釋梯度濃度，將其混合溶解于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種100 μL 制備好的菌懸液，每株菌做3 個重復，根據(jù)沙門氏菌的生長情況，確定不同種類消毒劑抑制受試沙門氏菌生長的最低濃度，即為MIC 值。

表5 9 種消毒劑成分以及使用濃度Table 5 The ingredients of 9 disinfectants and concentration

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 軟件初步進行整理分析，統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 軟件，作圖采用GraphPad Prism 8（v8.0.2.263）軟件。

2 結果與分析

2.1 細菌分離鑒定及血清型分布

通過選擇性培養(yǎng)基以及沙門氏菌特異基因invA檢測，從成都地區(qū)規(guī)模化奶牛場環(huán)境中各環(huán)節(jié)及牛乳在生產(chǎn)過程中采集700 份樣品，共分離鑒定出16 株沙門氏菌（2.29%，16/700）。從奶牛場環(huán)境1 株（1.28%，1/78）；健康奶牛糞樣1 株（1.14%，1/88）；腹瀉奶牛糞樣6 株（5.08%，6/118）；腹瀉奶牛環(huán)境5 株（5.15%，5/97）；腹瀉奶牛乳頭2 株（4.08%，2/49）；乳房炎奶牛糞樣1 株（2.27%，1/44），結果顯示該奶牛場采奶環(huán)節(jié)中沙門氏菌的污染范圍較為廣泛。馮蘭等[23]對四川省阿壩州紅原縣采集腹瀉牦牛樣品，16 份樣品共計分離出16 株沙門氏菌，沙門氏菌檢出率達到100%。說明密集的養(yǎng)殖場環(huán)境可致使病原菌在奶牛場之間的傳播風險更高，感染率高且造成的影響和危害更為嚴重[24]。奶牛養(yǎng)殖業(yè)是我國畜牧養(yǎng)殖重要的產(chǎn)業(yè)之一，其中，細菌性腹瀉中的沙門氏菌是嚴重危害養(yǎng)殖場中畜禽健康的一類致病菌，且在奶牛養(yǎng)殖環(huán)節(jié)以及牛乳生產(chǎn)過程中也經(jīng)常會發(fā)生食源性微生物的污染進而引起人的傳染。

進一步，采用沙門氏菌屬診斷血清試劑盒從分離菌株中鑒定出4 種血清型，包括腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，詳見表6。其中甲型副傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢血清（n=6，37.50%）、腸炎沙門氏菌（n=6，37.50%），其次，鼠傷寒沙門氏菌（n=3，18.75%）、嬰兒沙門氏菌（n=1，6.25%）。在中國，沙門氏菌流行的血清型眾多[25]。張樹棟等[26]發(fā)現(xiàn)牛源沙門氏菌的血清型多為鼠傷寒沙門氏菌或者都柏林沙門氏菌，這與本試驗研究結果大致相似，血清型的差異可能是由于地理區(qū)域、季節(jié)和采樣方法的不同導致，也表明奶牛場中沙門氏菌容易在各種環(huán)境中交叉污染。

表6 沙門氏菌血清型分布情況Table 6 Distribution of Salmonella serotypes

2.2 藥敏試驗

16 株沙門氏菌對20 種常見抗生素的耐藥表型如表7所示，分離菌株對桿菌肽和利福平的耐藥性最高，為100.00%（16/16），其次是氨芐西林，檢出率為93.75%（15/16），對亞胺培南、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星和頭孢他啶這6 種藥物的耐藥率均為0。此外，分離菌株還對多種抗生素表現(xiàn)為中介，如對鏈霉素（75.00%）、慶大霉素（62.50%）、阿米卡星（62.50%）等。本研究結果與何名揚等[27]及加春生等[28]的研究結果相似，包東武等[29]研究指出在對沙門氏菌及各類細菌傳染性疾病進行治療過程中，需要謹慎性用藥。因為按規(guī)定使用抗生素能夠有效降低沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生[30]。該奶牛場在針對治療沙門氏菌引起的患病奶牛時，建議使用氟喹諾酮類抗生素藥物。

表7 沙門氏菌分離株對20 種抗生素的藥敏結果Table 7 The results of susceptibility of Salmonella isolates to 20 antibiotics

從表8 可以看出16 株沙門氏菌分離菌株的耐藥表型均為多重耐藥性，分離菌株對3 種以上抗生素表現(xiàn)為耐藥。優(yōu)勢多重耐藥譜為：桿菌肽（B）、氨芐西林（AMP）、利福平（RFP），說明該奶牛場沙門氏菌分離菌株存在多重耐藥現(xiàn)象。

表8 分離菌株多重耐藥譜Table 8 Multidrug resistance profiles of Salmonella isolates

2.3 抗生素耐藥基因檢測結果

27 種耐藥基因檢測到24 種，檢出率最高的是tetB（93.75%），其次是aaC4（75.00%），未檢測到qnrC、aaC3和tetG耐藥基因。檢測結果如圖1。四環(huán)素類耐藥基因中，tetB基因的攜帶率高達93.75%，分析原因可能跟早期使用四環(huán)素類抗生素有關。16 株沙門氏菌分離菌株中有一半以上的分離菌株攜帶磺胺類耐藥基因，經(jīng)詢問磺胺類藥物也是該奶牛場主要的治療用藥。氯霉素類耐藥基因中stcM攜帶率為50.00%，cmlA攜帶率為12.50%。分離菌株中攜帶率較低的是鏈霉素類strB基因，僅1 株分離菌株攜帶。通過分析耐藥基因檢測結果發(fā)現(xiàn)與張文宇[30]、馮蘭[31]等研究結果存在一定差異，表明不同地區(qū)、不同時間采樣的沙門氏菌耐藥性存在不同。

圖1 沙門氏菌不同耐藥基因檢測結果Fig.1 Results of different drug resistance genes in Salmonella

2.4 毒力基因檢測結果

針對13 對毒力基因，檢測結果顯示，詳見圖2，分離菌株攜帶12 種不同的毒力基因，未檢測到ssaR毒力基因。Dlamini 等[32]從牛糞便和生牛肉樣本中分離出300 株沙門氏菌，27.10%的分離株具有spvC基因，來源不一樣的沙門氏菌攜帶相同的毒力基因時，所表現(xiàn)出的致病性不同[33]。研究發(fā)現(xiàn)質粒上攜帶的毒力基因更加具有致病性[34]，如spvC基因在質粒上，可發(fā)生轉移。此外spvC基因的產(chǎn)物與毒力表型具有一定的相關性，有利于沙門氏菌在腸外組織細胞內生長[21]。宋雪等[35]研究發(fā)現(xiàn)，毒力基因的攜帶情況與宿主的健康程度相關，進一步證實了毒力基因的攜帶率與致病性呈正相關[36]，毒力基因檢出率越高，沙門氏菌潛在致病性就越強?？梢源_定該奶牛場奶牛腹瀉的原因與攜帶多種毒力基因的沙門氏菌有關，這些毒力基因的存在可能會促進沙門氏菌向宿主的入侵，并且奶牛的發(fā)病率相關。

圖2 沙門氏菌不同毒力基因檢測結果Fig.2 The results of different virulence genes in Salmonella

2.5 抗消毒劑基因檢測結果

抗消毒劑基因的檢測結果如圖3，除qacG未被檢出外，16 株沙門氏菌分離菌中4 種基因均有檢出，其中qacEΔ1基因檢出率最高為56.25%。楊盛智等[37]在研究雞蛋生產(chǎn)鏈中沙門氏菌對抗生素及消毒劑的耐藥性中也僅檢測出qacEΔ1消毒劑耐藥基因，且發(fā)現(xiàn)所有檢測出qacEΔ1基因的菌株均對抗生素產(chǎn)生抗性。本研究結果與之相似，說明qacEΔ1基因在不同來源、不同環(huán)境中的沙門氏菌分離菌株中的檢出率均較高。

圖3 沙門氏菌抗消毒劑基因檢測結果Fig.3 The results of different anti-disinfectant genes in Salmonella

2.6 不同消毒劑對分離出的16 株沙門氏菌MIC 值分析

9種消毒劑對16株沙門氏菌分離菌株消毒效果MIC值的比較，結果如表9 所示，除了G 消毒劑，其它8 種消毒劑的最小抑菌濃度均高于廠家推薦使用濃度。

表9 消毒劑廠家推薦使用濃度與試驗使用濃度Table 9 Recommended concentration and test concentration of disinfectant manufacturer

分離菌株對9 種消毒劑敏感程度都較為廣泛，稀釋的濃度梯度跨度也較大。研究發(fā)現(xiàn)，消毒劑成分相同但品牌不同的消毒劑MIC 值也存在差異，分析可能與消毒劑原始濃度有關，從消毒劑對受試菌株的抑菌效果可以看出，消毒劑A、C、D、H 在30 min 內可以就能夠達到殺菌率100%；消毒劑B、E、F、G、I 均在60 min 內可以達到100%的殺菌率，詳見圖4。

圖4 9 種消毒劑不同時間抑菌效果Fig.4 Antibacterial effect of 9 kinds of disinfectants at different times

針對牛乳加工環(huán)節(jié)和環(huán)境消毒滅菌尤為重要，有效的消毒是奶牛場疫病防控的重要保障。質粒型消毒劑抗性基因家族中qac基因最為常見，其編碼的外排泵蛋白可排出雙胍類消毒劑和季銨鹽類消毒劑。李幗寧等[15]揭示沙門氏菌抗消毒劑基因攜帶率較高與多重耐藥菌株消毒劑抗力較高密切相關。何雪萍等[37]研究認為長期使用消毒劑會導致動物養(yǎng)殖場中沙門氏菌對喹諾酮類藥物的耐藥性增強。針對該奶牛場的日常環(huán)境、器具消毒，建議多種類消毒劑定期交替規(guī)范使用，可減少致病菌耐藥性的產(chǎn)生。

2.7 不同巴氏殺菌溫度對沙門氏菌的殺菌效果

通過查閱相關文獻[38]，在不影響牛乳品質和風味的情況下，選擇低溫保持式殺菌法對全脂乳和脫脂乳中的沙門氏菌進行巴氏殺菌，針對巴氏殺菌中的低溫保持式殺菌法進行了溫度的探究試驗。如圖5 所示，全脂鮮牛乳中沙門氏菌菌落數(shù)隨溫度升高而減少，16株沙門氏菌分離菌株64.0 ℃時可以達到殺菌率100%。在圖6 中可知，在脫脂乳中沙門氏菌菌落數(shù)也隨著溫度的升高而減少，16 株沙門氏菌分離菌株在63.5 ℃殺菌率能夠達到100%，在脫脂乳中巴氏殺菌效果顯著。溫度變化對16 株沙門氏菌分離菌株的影響較大，熱處理強度不同，其殺菌效效果不同。

圖5 全脂乳中不同巴氏殺菌溫度對16 株沙門氏菌抑菌效果Fig.5 The sterilization effect of different pasteurization temperatures in whole milk on 16 strains of Salmonella

圖6 脫脂乳中不同巴氏殺菌溫度對16 株沙門氏菌抑菌效果Fig.6 The sterilization effect of different pasteurization temperatures in skimmed milk on 16 Salmonella strains

3 結論

本研究以奶牛場沙門氏菌分離菌株為研究對象，從牛乳生產(chǎn)鏈中采集700 份樣品，分離鑒定出16 株沙門氏菌，檢出率為2.29%；血清型鑒定結果顯示，分離菌株中有4 種血清型，以甲型副傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌為優(yōu)勢血清型，其次是鼠傷寒沙門氏菌；16 株沙門氏菌分離菌株對桿菌肽和利福平的耐藥性高達100.00%，其次是氨芐西林為93.75%，對頭孢他啶、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星和青霉素這6 種藥物敏感，16 株沙門氏菌分離菌株表現(xiàn)出多重耐藥性；共檢測到24 種抗生素耐藥基因，檢出率最高的是tetB（93.75%），其次是aaC4（75.00%）。分離菌株中共檢測到12 種不同的毒力基因，檢出率最高的是sipA毒力基因，檢出率為62.50%（10/16），未檢測到ssaR毒力基因。抗消毒劑基因中，除qacG未被檢出外，其他4 種基因均有檢出，其中qacEΔ1基因檢出率最高為56.25%。16 株沙門氏菌對9 種不同種類消毒劑的MIC 值基本都高于廠家推薦使用濃度的1～3倍。巴氏殺菌條件，在64.0 ℃、30 min 時，不管是在全脂乳還是脫脂乳中殺菌率都能達到100%，建議加強對奶牛場中沙門氏菌的防控，嚴格規(guī)范使用抗生素和消毒劑以及加強監(jiān)督管理牛乳生產(chǎn)鏈條中衛(wèi)生質量管理。