李詠富，羅其琪，田竹希，何揚(yáng)波，石彬，龍明秀

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州貴陽 550006）（2.貴州省特色農(nóng)產(chǎn)品輻照保鮮與加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽 550006）

噻菌靈（2-(4-thiazolyl)-1H-benzimidazole）是一種苯并咪唑類殺菌劑，屬于內(nèi)吸性廣譜殺菌劑，作用機(jī)制為抑制真菌有絲分裂過程中的微管蛋白的形成，可防治多種真菌引起的真菌病害[1]。此外，在水果保鮮領(lǐng)域中，噻菌靈也可用于柑橘、荔枝和梨等水果貯藏期的真菌病害[2,3]。噻菌靈雖然具有較好的抑菌活性，但其水溶性差，其溶解度隨溶液的pH 值變化而變化，25 ℃條件下，當(dāng)水溶液的pH 值2 時(shí)，水中溶解度約為10 g/L，當(dāng)pH值5～12時(shí)，水中溶解度低于50 mg/L[4]。雖然在低pH 值條件下，噻菌靈在水溶的溶解性較高，但在果蔬保鮮過程中，較低的pH 值處理果蔬表皮會(huì)對(duì)其表皮組織產(chǎn)生不可逆的損傷。處理后，噻菌靈經(jīng)果皮逐漸向果肉滲透，增加了人體攝入的風(fēng)險(xiǎn)。因此，增加噻菌靈在水溶液中的溶解度且降低其向果蔬組織內(nèi)部遷移是提高噻菌靈在果蔬保鮮領(lǐng)域中應(yīng)用安全性的有效途徑。

β-環(huán)糊精是一種常用的疏水性藥物的包埋載體，但在室溫下其溶解度較低，僅為18.5 g/L（16.3 mmol/L），在水中的溶解度隨著溫度的升高而升高，室溫下對(duì)疏水性藥物的增溶效果有限。因此，需要對(duì)β-環(huán)糊精進(jìn)行化學(xué)改性，增加其溶解性，并提高其對(duì)疏水性藥物的包埋能力。張志飛[5]和馮鳴等[6]分別制備了2-羥丙基-β環(huán)糊精和6-羥丙基-β環(huán)糊精，其在水中的溶解度分別為700 g/L 和500 g/L。

本研究通過將β-環(huán)糊精的羥基酯化制備丁烯酸β-環(huán)糊精酯，以期增加其在水中的溶解度，同時(shí)在β-環(huán)糊精中引入乙烯基基團(tuán)，可作為制備β-環(huán)糊精的高分子聚合物的結(jié)構(gòu)單體；同時(shí)，將丁烯酸β-環(huán)糊精酯作為藥物載體，增加疏水性抑菌劑噻菌靈在水中的溶解度。同時(shí)，本研究通過相溶解度實(shí)驗(yàn)[7,8]，考察丁烯酸β-環(huán)糊精酯對(duì)噻菌靈的增溶效果，并確定噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成的藥物復(fù)合物的穩(wěn)定常數(shù)（Kc）。通過抑菌實(shí)驗(yàn)，考察藥物包結(jié)復(fù)合物的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

β-環(huán)糊精、丁烯酸、N,N-羰基二咪唑、二甲氨基吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、氫化鈣、三乙胺、磷酸、癸烷磺酸鈉和無水乙醇均為分析純?cè)噭?，采購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。?shí)驗(yàn)用水為超純水。噻菌靈標(biāo)準(zhǔn)試劑采購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。黑曲霉（CMCCF98003）采購于南京樂診生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent-1260 型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Spectrum 400 ART-紅外光譜儀，珀金埃爾默科技有限公司；IKA-10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國艾卡科技有限公司。

1.3 噻菌靈的液相檢測(cè)

1.3.1 離子對(duì)試劑

取7.0 mL 磷酸加入盛有200 mL 水的燒杯中，攪拌稀釋，然后加入1.0 g 癸烷磺酸鈉，溶解，再加入10.0 mL 三乙胺，加水稀釋至1 000 mL。使用三乙胺調(diào)節(jié)pH 值至2.4。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18 柱，100A（250 mm×4.60 mm），Kromasil，德國Eka Chemicails 公司；流動(dòng)相：甲醇/離子對(duì)試劑（50/50），流量0.8 mL/min；檢測(cè)條件：檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；色譜柱溫度30 ℃；進(jìn)樣量10.00 μL[9]。

1.3.3 噻菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取10.00 mg 噻菌靈于燒杯中，加入少量甲醇溶解，并定容至10 mL。將上述溶液梯度稀釋至1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 和500.0 μg/mL，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。每個(gè)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液相色譜測(cè)量，每個(gè)樣品進(jìn)樣3 次。根據(jù)峰面積同濃度建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：

1.4 β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的合成

1.4.1 催化劑溶液配制

稱取0.61 g 4-二甲基吡啶加入少量N,N-二甲基甲酰胺溶解，之后再100 mL 容量瓶中定容備用。

1.4.2β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的合成

準(zhǔn)備潔凈的250 mL 三角瓶將其置于120 ℃烘箱中，加熱30 min 烘干備用。分別稱取11.35 gβ環(huán)糊精和7.74 g 丁烯酸置于250 mL 三角瓶，加入100 mL N,N-二甲基甲酰胺磁力攪拌溶解，之后再加入7.0 mL催化劑。稱取14.59 g N,N-羰基二咪唑置于250 mL 三角瓶中并加入100 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解。待三角瓶中無固體顆粒存在時(shí)，將羰基二咪唑溶液加入溶有環(huán)糊精的三角瓶中，25 ℃水浴磁力攪拌下反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后加入20 mL 水終止反應(yīng)[10]。

1.4.3 產(chǎn)物純化

上述反應(yīng)后的混合溶液于60 ℃，減壓（5 mbar）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶液粘稠，向旋蒸瓶加入100 mL 無水乙醇沉淀出粗產(chǎn)物；將沉淀物加入到料理杯中充分?jǐn)嚢瑁看渭尤?0 mL 無水乙醇，攪拌過后倒出靜止一段時(shí)間去除上清液，重復(fù)該操作5 次。將上述洗滌后的沉淀轉(zhuǎn)移至空的SPE 小柱，真空抽濾，在SPE 小柱中分3 次加入100 mL 無水乙醇沖洗上述沉淀物，得到純化后的產(chǎn)物。產(chǎn)物在55 ℃下烘干備用。

1.5 β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的結(jié)構(gòu)表征

ATR-FTIR 譜圖采用紅外光譜儀Spectrum 400（Perkin Elmer Co.美國）進(jìn)行檢測(cè)。ATR 附件包含金剛石晶體內(nèi)反射部件，紅外光束的入射角45 °。光譜分辨率為4 cm-1，光譜在該分辨率上執(zhí)行總共16 次掃描背景和樣本[11,12]。每個(gè)樣品大約10 mg，加樣后立即進(jìn)行掃描。確保樣品表面無空氣氣泡，在樣品上方放置一小塊鋁箔。采樣結(jié)束后，ATR 附件晶體用75%（V/V）的酒精清洗，在收集下一個(gè)樣品圖譜前，重新進(jìn)行背景掃描。每個(gè)樣品重復(fù)三次，取其均值使用Origin 2018 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行作圖。

1.6 β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的溶解度測(cè)定

稱取1.00 gβ-環(huán)糊精-丁烯酸酯到15 mL 離心管內(nèi)，加入10 mL 超純水，于25 ℃水域中磁力攪拌24 h，在6 000 r/min 的速度下離心，除去上清液，沉淀物于100 ℃烘箱內(nèi)至恒重，稱量質(zhì)量。溶解實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 相溶解度實(shí)驗(yàn)

相溶性研究是一種評(píng)價(jià)環(huán)糊精對(duì)疏水藥物溶解度的影響傳統(tǒng)的方法，該方法由Higuchi 和Connors 在1965 年提出[13]。表觀穩(wěn)定系數(shù)的計(jì)算如式（1）所示：

式中：

S0——噻菌靈在純水中的溶解度；

slope——相溶解度圖中線性方程的斜率；

Kc——表觀穩(wěn)定系數(shù)。

將噻菌靈（100 mg）分別加入含有10 mL 不同濃度β-環(huán)糊精-丁烯酸酯（0、4.15、8.31、12.47 和16.62 mmol/L）和β-環(huán)糊精（0、0.88、2.64 和4.41 mmol/L）的具塞三角瓶?jī)?nèi)。然后用封口膜將具塞三角瓶瓶口密封以防止溶液中水分的蒸發(fā)。將封口的三角瓶置于溫度為30、40 和50 ℃水域搖床中，振蕩3 d。當(dāng)溶液中藥物達(dá)到溶解平衡后，將懸濁液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，除去未溶解的藥物，收集濾液，將濾液稀釋一定濃度后，使用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分析測(cè)試。

1.8 抑菌實(shí)驗(yàn)

噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物和噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物對(duì)黑曲霉的抑制實(shí)驗(yàn)采用察氏瓊脂法[14]。對(duì)照組為30、40 和50 ℃下噻菌靈在純水中的飽和溶液，處理組為上述溫度下噻菌靈在β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯水溶液（β-環(huán)糊精濃度為0.88、2.64 和4.41 mmol/L；β-環(huán)糊精丁烯酸酯的濃度為4.15、8.31、12.47 和16.62 mmol/L）中的飽和溶液。上述溶液經(jīng)0.45 μm 過濾后，分別用移液槍準(zhǔn)確吸取7.5 μL 藥物溶液添加加到直徑為6 mm 的濾紙片上，藥物添加兩次（共計(jì)15 μL）。將含有藥物的濾紙片均勻的分布于瓊脂培養(yǎng)基上。培養(yǎng)皿于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)36 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈的大小，抑菌圈的定義為濾紙片邊緣同抑菌圈邊緣之間的距離（單位：mm）。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Prism 5.0 GraphPad 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。差異的顯著性通過配對(duì)t檢驗(yàn)來計(jì)算。p＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者有顯著差異，p＞0.05認(rèn)為兩者無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的紅外結(jié)構(gòu)解析

β-環(huán)糊精（圖1a）、丁烯酸（圖1b）和β-環(huán)糊精-丁烯酸酯（圖1c）的紅外光譜圖如圖1 所示。

丁烯酸的紅外圖譜（圖1b）中，在1 683 cm-1出現(xiàn)了C=O 的伸縮振動(dòng)，在1 650 cm-1出現(xiàn)了C=C 的伸縮振動(dòng)，在1 421 cm-1出現(xiàn)了C-OH 面內(nèi)彎曲振動(dòng)，在1 314 cm-1和1 223 cm-1出現(xiàn)了羧酸C-OH 伸縮振動(dòng)，在β-環(huán)糊精-丁烯酸酯中沒有出現(xiàn)丁烯酸的特征吸收峰，說明未反應(yīng)的丁烯酸經(jīng)純化過程被除去了。在β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的紅外圖譜中（圖1c）同樣觀察到了β-環(huán)糊精的紅外圖譜（圖1a）中的特征吸收，如說明在形成酯的過程中保留了β-環(huán)糊精完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。β-環(huán)糊精-丁烯酸酯中，在1 738 cm-1出現(xiàn)了不飽和酯羰基C=O 伸縮振動(dòng)[15]，這是由于當(dāng)烯類雙鍵與酯羰基的C 原子相連時(shí)，共軛效應(yīng)使羰基振動(dòng)頻率向低頻移動(dòng)；同時(shí)β-環(huán)糊精-丁烯酸酯保留了不飽和雙鍵C=C 的伸縮振動(dòng)（1 650 cm-1），但該伸縮振動(dòng)的吸收峰強(qiáng)度顯著降低。同時(shí)，在1 253 cm-1觀察到了酯鍵中C-O 的伸縮振動(dòng)頻率（1 240 cm-1～1 150 cm-1）[16]，頻率升高的原因是由于不飽和雙鍵上的π電子與羰基相的C-O 上氧原子的電子形成了大共軛體系，增強(qiáng)了酯鍵中C-O 的鍵級(jí)[17]。通過紅外圖譜對(duì)比分析，可以確定β-環(huán)糊精丁烯酸酯的合成。

圖1 β-環(huán)糊精、丁烯酸和β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of β-cyclodextrin,butenic acid and β-cyclodextrin-butenate

2.2 噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯藥物復(fù)合物的紅外圖譜解析

在噻菌靈的紅外圖譜中（圖2a），在1 456 cm-1、1 404 cm-1和1 393 cm-1處，觀察到了噻菌靈化學(xué)結(jié)構(gòu)中苯環(huán)骨架的振動(dòng)吸收峰，在737 cm-1處觀察到了芳環(huán)中C-H 的面外彎曲振動(dòng)吸收峰[18]，在1 579 cm-1處觀察到了噻菌靈化學(xué)結(jié)構(gòu)中C=N 的伸縮振動(dòng)[19,20]；在噻菌靈-β-環(huán)糊精-丁烯酸酯復(fù)合物的紅外圖譜中同樣觀察到了1 579 cm-1處噻菌靈化學(xué)結(jié)構(gòu)中C=N 的伸縮振動(dòng)吸收峰，說明β-環(huán)糊精-丁烯酸酯可以同噻菌靈形成包結(jié)復(fù)合物；但在藥物復(fù)合物中未觀察到噻菌靈苯環(huán)結(jié)構(gòu)的紅外特征吸收峰，說明噻菌靈同β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的作用位點(diǎn)是其結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)同β-環(huán)糊精-丁烯酸酯中的疏水性內(nèi)腔通過弱的分子間相互作用力結(jié)合。

圖2 噻菌靈和噻菌靈-β-環(huán)糊精-丁烯酸酯復(fù)合物的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of thiabendazole and thiabendazole-β-cyclodextrin-butenate complex

2.3 液相色譜分析

通過觀察液相色譜圖發(fā)現(xiàn)，在相同色譜條件下，噻菌靈的保留時(shí)間為10.54 min，噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物的保留時(shí)間為9.94 min，噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的保留時(shí)間為9.88 min，如圖3 所示。保留時(shí)間的差異說明噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成包結(jié)復(fù)合物后，其親水性有了一定程度的提高。由于噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的保留時(shí)間更靠前，也說明-β-環(huán)糊精丁烯酸酯的親水性優(yōu)于β-環(huán)糊精，也從側(cè)面佐證了β-環(huán)糊精丁烯酸酯的溶解度高于β環(huán)糊精。

圖3 噻菌靈、噻菌靈-β-環(huán)糊精和噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatographic diagram of thiabendazole,and thiabendazole-β-cyclodextrin complex and thiabendazole-β-cyclodextrin butenate complex

2.4 β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物對(duì)噻菌靈的增溶效果

β環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物均可增加噻菌靈在水中的溶解度，如圖4 所示。隨著溫度及β環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物水溶液濃度的升高，噻菌靈在水中的溶解度也隨之升高。

圖4 不同溫度下噻菌靈在β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物水溶液中的濃度Fig.4 Concentration of thiabendazole in β -cyclodextrin and its butenatederivant aqueous solution at different temperatures

Ay?e Nur Oktay 在藥物復(fù)合物的相溶解度研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)客體（藥物）濃度與包埋物溶液濃度成線性關(guān)系時(shí)，兩者的化學(xué)計(jì)量比應(yīng)為1:1[21]。噻菌靈的濃度同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物在水溶液中的濃度成良好的線性關(guān)系，表明噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成的復(fù)合物的化學(xué)計(jì)量比為1:1。通過線性擬合，得到不同溫度下的斜率，結(jié)合噻菌靈在水溶液中的初始濃度S0值，利用式（1）計(jì)算得到藥物復(fù)合物的表觀穩(wěn)定系數(shù)Kc，如表1 所示。

表1 不同溫度下復(fù)合物噻菌靈-β-環(huán)糊精和噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯的表觀穩(wěn)定系數(shù)Kc及S0值Table 1 The Kc and S0 value of thiabendazole-β-cyclodextrin complex and thiabendazole-β-cyclodextrin-butenate complex at different temperature

隨著溫度的升高噻菌靈-β-環(huán)糊精和噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的表觀穩(wěn)定系數(shù)Kc逐漸升高，升溫有利于藥物復(fù)合物的形成。經(jīng)方差顯著性分析Kc-β-環(huán)糊精和Kc-β-環(huán)糊精丁烯酸酯并無顯著性差異（p＞0.05），說明兩種藥物復(fù)合物在水中的穩(wěn)定性相近。β-環(huán)糊精丁烯酸酯對(duì)噻菌靈的增溶效果是因?yàn)槠渥陨碓谒械娜芙舛雀哂讦?環(huán)糊精。在β-環(huán)糊精丁烯酸酯的溶解實(shí)驗(yàn)中，其水溶液中的溶解度為37.92g/L，β-環(huán)糊精在水溶液中溶解度的2.05 倍。目前，未見關(guān)于噻菌靈同β-環(huán)糊精形成包結(jié)復(fù)合物的相關(guān)報(bào)道，但根據(jù)姜慧明等的研究報(bào)道[22]，多菌靈在羥丙基-β-CD 中的表觀穩(wěn)定系數(shù)為600 M-1，說明多菌靈同羥丙基-β-環(huán)糊精形成的包結(jié)復(fù)合物在水溶液中的穩(wěn)定性更高，這是因?yàn)橄噍^于多菌靈分子，噻菌靈的分子結(jié)構(gòu)更大，其4 位的噻唑基的親水性更強(qiáng)，同疏水性的β-環(huán)糊精內(nèi)腔的親合力更低。

2.5 噻菌靈藥物復(fù)合物的抑菌活性

噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物及噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的抑菌圈直徑如圖5a 和圖5b 所示。隨著β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯水溶液濃度的增加，抑菌圈的直徑也逐漸增大。在制備藥物復(fù)合物時(shí)，水溶液溫度越高，噻菌靈藥物復(fù)合物的抑菌效果越強(qiáng)。在水溫為50 ℃時(shí)，噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物及噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的抑菌圈直徑分別比噻菌靈對(duì)照組增大了1.74 倍和2.09 倍。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，處理組的抑菌圈直徑同對(duì)照組存在顯著差異（p＜0.05）；在50 ℃條件下，β環(huán)糊精水溶液濃度為4.41 mmol/L，β環(huán)糊精丁烯酸酯水溶液濃度為4.15 mmol/L 時(shí)，抑菌圈的直徑分別為6.18 mm 和5.93 mm，兩者間無顯著差異（p＞0.05）。圖5c（1）為不同溫度下，噻菌靈水溶液的抑菌圈（對(duì)照組），圖5c 中（2）和（3）為不同溫度下（β環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物水溶液濃度分別為4.41 mmol/L 和16.62 mmol/L），噻菌靈藥物復(fù)合物的抑菌圈（處理組），由圖5c 可直觀地證明β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物可提高噻菌靈在水中的溶解度，進(jìn)而提升其抑菌效果。這是由于隨著水溶液溫度、β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯濃度的升高，噻菌靈在水溶液中的濃度也越高。

圖5 不同濃度下噻菌靈復(fù)合物的抑菌圈直徑Fig.5 The inhibition zone diameter of thiamethazim complex at different concentrations

3 結(jié)論

β-環(huán)糊精-丁烯酸酯在水中的溶解度要略好于β-環(huán)糊精，溶解度較β-環(huán)糊精提高了2.05 倍。β-環(huán)糊精-丁烯酸酯在水中的溶解度要低于2-羥丙基-β-環(huán)糊精和6-羥丙基環(huán)糊精，這是由于丁烯酸酯基的親水性要低于羥丙基的親水性。噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成包結(jié)復(fù)合物后，噻菌靈在水中的溶解度得到一定程度上的提升，且隨著β-環(huán)糊精及β-環(huán)糊精丁烯酸酯水溶液濃度的升高而升高；噻菌靈復(fù)合物的抑菌效果也強(qiáng)于噻菌靈對(duì)照組，抑菌能力的提升原因在于β-環(huán)糊精及β-環(huán)糊精丁烯酸酯可提高噻菌靈在水溶液中的溶解度。噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物及噻菌靈-β-環(huán)糊精-丁烯酸酯水中的表觀穩(wěn)定系數(shù)無顯著性差異，隨著溫度升高，表觀穩(wěn)定系數(shù)也隨之增高。在近似濃度下（4 mmol/L），噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物和噻菌靈β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的抑菌效果之間無顯著性差異（p＞0.05）。噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成的包結(jié)復(fù)合物在水中的穩(wěn)定性要低于多菌靈-羥丙基β-環(huán)糊精復(fù)合物在水中的穩(wěn)定性。