婁雨豪，曹冬梅,3,4*，劉金明，張東杰，崔航，王冀菲，楊建

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）（2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室,黑龍江大慶 163319）（3.國家雜糧工程技術研究中心,黑龍江大慶 163319）（4.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術研究中心,黑龍江大慶 163319）（5.北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術省級培育協(xié)同創(chuàng)新中心,黑龍江大慶 163319）（6.黑龍江八一農(nóng)墾大學信息與電氣工程學院，黑龍江大慶 163319）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）是真菌在適宜條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等代謝產(chǎn)生[1]，谷物在田間受到真菌的侵染，在適宜的氣溫和濕度等條件下真菌繁殖并產(chǎn)生DON，其在小麥、大麥、燕麥、玉米等谷物中含量較高。DON進入人體會與蛋白質(zhì)的氨基、烴基及羧基發(fā)生作用，并與核糖體進行結(jié)合出現(xiàn)應激反應，從而抑制蛋白質(zhì)的合成[2]。當人體內(nèi)蓄積大量DON 時會造成厭食、嘔吐、消化系統(tǒng)紊亂甚至會引起出血等癥狀[3]。而DON在水和極性溶劑中溶解度良好，理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，即使在170 ℃下加熱30 min 仍然不會降解[4]，因此原料經(jīng)過加工后無法保證其絕對的安全性[5]。但其在堿性條件下不穩(wěn)定，且降解后的產(chǎn)物毒性低于DON 的毒性[6]，所以加工脫毒常用此作為一種去除方法。

被DON 污染的原糧經(jīng)過加工流入市場被消費者食用后，則會對健康產(chǎn)生嚴重威脅，甚至會引起中毒。近年來，國內(nèi)已有大量關于DON 污染糧食方面的檢測報道[7-11]，因此如何減少DON 含量就尤為重要，趙佳[12]以不同加工方式對小麥制品中DON 含量變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)能夠有效去除部分毒素。而大麥具有較高的營養(yǎng)價值[13]，因其不利于面團的成型及口感與色澤的欠缺，導致在我國多用作飼料飼草[14]。已有學者表明以一定比例替代小麥粉，能夠有效提升營養(yǎng)與物性指標[15]，現(xiàn)如今以大麥為原料的一些制品已逐漸被人們所接受，如八寶粥[16]、面條[17]、飲料[18]、餅干[19]、陳醋[20]等食品，但此類雜糧食品的制作工藝中對DON 的去除效果還未見報道。

本文將主要研究大麥在不同溫度（5、15、25、35 ℃）和相對環(huán)境濕度（55%、65%、75%、85% RH）條件下貯藏180、270 與360 d 中DON 含量變化趨勢，以及三種加工工藝（蒸制、煮制、發(fā)酵）對食品中DON的模擬脫毒效果，運用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測各樣本中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量，為獲取最佳貯藏條件、膳食攝入風險評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大麥，CK15，佳木斯農(nóng)科院；小麥粉、谷阮粉，超市購買；TL-48R 型粉碎研磨儀，上海萬柏生物科技有限公司；QL-901 型旋渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；H1850 型離心機，湖南湘儀儀器有限公司；Infinite F50 型酶標儀，山東博科再生醫(yī)學有限公司；HWS-150 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大麥貯藏

通過人工模擬貯藏環(huán)境濕度[21]，依次配制飽和硝酸鎂溶液、飽和亞硝酸鈉溶液、飽和氯化鈉溶液、飽和氯化鉀溶液，分別模擬55%、65%、75%、85% RH相對環(huán)境濕度。將300 g 大麥樣品分裝在不同濕度的燒杯中，共16 份（每個濕度4 份），再將盛有大麥樣品的燒杯裝入飽和溶液的大燒杯中，而后將其放入不同溫度（5、15、25、35 ℃）的恒溫培養(yǎng)箱中，分別模擬冷庫貯藏、低溫糧庫貯藏、常溫糧庫貯藏、南方高溫糧庫貯藏。在180、270、360 d 時進行統(tǒng)一取樣用于后續(xù)分析，取樣完成后立即放入培養(yǎng)箱中，以免外界環(huán)境對樣品進行干擾。

1.2.2 污染預測模型

SVM（支持向量機）模型是通過所選用的核函數(shù)將非線性數(shù)據(jù)映射到高維度的線性數(shù)據(jù)上，并對此進行線性回歸分析[22]，具有良好的泛化能力彌補了神經(jīng)網(wǎng)絡的缺陷。常見的核函數(shù)類型主要包括線性內(nèi)核、多項式內(nèi)核、徑向基內(nèi)核（RBF）及Sigmoid 核等[23]。其中RBF 核函數(shù)效率高、速度快，多用于解決非線性多變量回歸問題[24]。為優(yōu)化SVM 學習能力，現(xiàn)擁有網(wǎng)格搜索方法、粒子群算法（PSO）、遺傳算法（GA）等一些智能算法，本研究將對回歸模型的參數(shù)C、γ和ε進行優(yōu)化[25]，以獲得最佳污染預測模型。

1.2.3 不同工藝對DON 去除效果影響

1.2.3.1 原料制備

因大麥中谷蛋白分子量較小且醇溶蛋白含量較低，在和面時無法形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導致面團松散，單獨以其進行面制品加工時難以成型[26]，故而需要與小麥粉配比使用且添加適量的品質(zhì)改良劑。將大麥研磨成粉，過100 目篩，以1:3 的比例加入小麥粉，再加入面粉總質(zhì)量10%的谷阮粉得到復配后的雜糧面粉，用于后續(xù)實驗。

1.2.3.2 蒸制加工方法

按照2:1 的比例加入雜糧粉與40 ℃的溫水，酵母添加量為1%進行和面。揉面5 min 直至面團光滑、不粘手，而后將面團放入36 ℃的培養(yǎng)箱中醒發(fā)2.5 h，拿出分塊，每個50 g 揉成圓型后在室溫下進行2 次醒發(fā)（20 min）。將水加熱至沸騰，放入蒸屜中蒸制20 min[27]。加堿面團中碳酸鈉添加量與面粉比例分別為1:100 及1:200。

1.2.3.3 煮制加工方法

按照2:1 的比例加入雜糧粉與40 ℃的溫水，和面5 min 直至面團光滑、不粘手，靜置熟化30 min 后，用面條機將其逐步壓延成厚1 mm 寬3 mm 的面條[28]。稱取500 mL 純水煮沸，分別加入1、1.25、1.5、1.75 g碳酸鈉，待溶解后放入做好的雜糧面條50 g，煮制8 min。

1.2.3.4 啤酒釀造方法

啤酒釀造工藝為：

大麥→浸麥→發(fā)芽→除根→粉碎→糊化→糖化→過濾→煮浮→添加酒花→旋沉冷卻→發(fā)酵→過濾

選取適量優(yōu)質(zhì)大麥進行浸麥，使其含水量達到45%～50%左右進行發(fā)芽，除根后放入培養(yǎng)箱中干燥。取出粉碎進行糊化，在糊化鍋中加入適量的水加熱至40 ℃，進行攪拌投入麥芽，升溫至50 ℃保持20 min后升高至63 ℃繼續(xù)糊化30 min 后在75 ℃下過濾，煮沸得到麥汁，酒花分三次添加依次在10、50、80 min時加入10%、60%、30%，然后經(jīng)過旋沉、冷卻至15 ℃，接種酵母后分別在14 ℃發(fā)酵4 d、8 ℃發(fā)酵4 d、4 ℃發(fā)酵7 d。最終經(jīng)過過濾得到啤酒。

1.2.4 毒素含量測定

酶聯(lián)免疫檢測試劑盒存放在低溫冰箱中，檢測時將其移入室溫環(huán)境（20～25 ℃），平衡1 h 以上。準確稱取2 g 樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 去離子水震蕩5 min，室溫下4 000 r/min 離心10 min，取上清液0.5 mL 并加入0.5 mL 復溶液混勻后進行分析。取上述溶液50 μL 于試劑盒各微孔中，每個樣本做兩孔平行，加入酶標記物、抗體工作液各50 μL 在25 ℃下反應30 min。洗滌后加入50 μL 底物液A、B，25 ℃避光反應15 min。最后加入50 μL 中止液，使用酶標儀于450 nm 測定其吸光度值并計算相應毒素大小，且毒素檢測時試驗條件應保持一致。

1.2.4.1 標準曲線繪制

分別吸取0、10、30、90、270、810 ng/mL 濃度的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品50 μL 進行測定。以標準溶液濃度的對數(shù)為橫坐標（X，ng/mL），相應百分吸光率值為縱坐標（Y）繪制標準曲線，線性方程為：

線性擬合程度良好，能夠滿足當前檢測需求。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Matlab、Origin 與SPSS 軟件進行處理及計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏條件下DON 含量變化趨勢

大麥在貯藏期間若儲藏不當會導致發(fā)霉、陳化等一系列問題，使其食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值降低。因此，隨著時間推移在不同溫濕度環(huán)境下，研究大麥中DON含量變化趨勢可以有針對性的控制貯藏環(huán)境，同時確保了儲糧的安全性，為實現(xiàn)大麥的安全貯藏、減少儲糧損失及提高儲糧質(zhì)量提供了有力依據(jù)。但因毒素具有非均勻性分布的特點，導致檢測無法十分準確的代表當前環(huán)境的全部情況，所以取樣時需多點、大量取樣充分混勻后進行試驗。

由圖1 可知，不同貯藏條件下隨環(huán)境溫濕度的增加，大麥中DON 含量均呈現(xiàn)不同的上升趨勢，其中5 ℃環(huán)境下DON 波動幅度較小，而隨溫度的不斷上升DON含量也隨之增加，可以發(fā)現(xiàn)25 ℃與35 ℃時DON含量大幅度增加，且各組間差異高于5 ℃與15 ℃環(huán)境，相對環(huán)境濕度對其的影響逐漸加大。而從相對環(huán)境濕度角度分析，可以發(fā)現(xiàn)隨濕度的增加各組間DON含量具有較大的差異，在75% RH 條件下DON 含量較高，其次為85% RH、65% RH，55% RH 時DON含量較低。在5 ℃與15 ℃條件下，85% RH 與65% RH環(huán)境DON 無較大差異，而在25 ℃環(huán)境中，85% RH的DON 含量高于其他溫度，整個貯藏過程中DON 含量達到最高的環(huán)境為35 ℃ 75% RH，其值為0.65 mg/kg 比貯藏前的大麥中DON 含量高了0.21 mg/kg。從整體角度來看，75% RH 環(huán)境是DON生長的最適條件，且相對濕度環(huán)境是影響DON 含量的重要因素。

圖1 不同貯藏條件下DON 含量變化趨勢Fig.1 Change trend of DON content under different storage conditions

在整個貯藏階段，DON 含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)現(xiàn)貯藏180 d 時DON 含量上升趨勢較為緩慢，這是由于剛收獲的大麥通常處于休眠狀態(tài)，隨著貯藏時間的增加，大麥本身會逐漸脫離休眠狀態(tài)，來抵御真菌毒素的進一步污染[29]。在貯藏270 d 時DON 含量上升趨勢較大，由于收獲的大麥中附帶了田間生長環(huán)境中的真菌體系，Mannaa[30]發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬與鐮刀菌屬在收獲前會附著在成熟的谷物上，而DON 正是鐮刀菌屬的次級代謝產(chǎn)物，經(jīng)過一段時間的貯藏后逐漸產(chǎn)生代謝產(chǎn)物導致毒素累積，總體DON 含量上升，并且也有研究表明，毒素在某一階段含量較高時可能是由于這種毒素的產(chǎn)毒真菌在這一貯藏時間達到了優(yōu)良生長期，代謝量增大[31]。而在貯藏360 d 時DON 含量上升趨勢較為緩慢，由于貯藏環(huán)境已趨于穩(wěn)定并且田間真菌逐漸過渡為貯藏真菌，優(yōu)勢菌屬發(fā)生了更替，鐮刀菌屬相對豐度占比下降，已有研究發(fā)現(xiàn)糧食在貯藏過程中不同類型的微生物代謝產(chǎn)物之間會進行相互抑制[32]，因此導致DON 含量上升緩慢。

2.2 污染預測模型

模型以貯藏大麥中DON 含量作為因變量，溫度、相對環(huán)境濕度及時間作為自變量而建立。數(shù)據(jù)按照DON 含量從小到大依次排序，隨機抽取75%的數(shù)據(jù)作為校正集，剩余25%數(shù)據(jù)為驗證集。通過校正決定系數(shù)R2C、校正均方根誤差RMSEC、驗證決定系數(shù)R2P、預測均方根誤差RMSEP、平均相對誤差MPE 評價模型的準確性。其中R2C、R2P代表了自變量對因變量的解釋程度，越接近于1 時預測性能越好、RMSEC、RMSEP 代表了模型的準確度與精密度，越接近于0 時準確度與精密度越高，而MPE 值越小越好。

由表1 可知，三種SVM 污染預測模型的擬合效果良好，其中GA-SVM 模型與其他SVM 模型相比，決定系數(shù)最高、均方根誤差最小，說明其預測精度最高。模型如圖2 所示，校正集與驗證集的樣本點基本都在對角線上，說明不同貯藏條件下大麥中DON 含量的回歸預測模型建立成功，具有良好的預測性能。

表1 不同模型預測結(jié)果對比Table 1 Comparison of prediction results of different models

圖2 貯藏大麥中DON 含量的校正集與驗證集分布Fig.2 Distribution of calibration set and verification set of DON content in barley during storage

2.3 不同加工工藝對DON 去除效果

2.3.1 蒸煮工藝對DON 去除效果

蒸煮是我國居民家庭最主要的加工方式，對加工過程中DON 含量變化進行分析有助于合理加工食物，對降低膳食攝入風險具有重要作用。在蒸煮過程中加入適量碳酸鈉（Na2CO3）能夠有效去除面團中的酸味、改善食用口感。碳酸鈉是我國食品加工中常用的添加劑，其水溶液呈堿性，因DON 理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，對高溫具有較強的耐受性導致去除程度有限，而堿能夠有效破壞DON 的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因此將以天然污染的大麥與小麥粉為原料探究各因素對DON 含量變化的影響。

由表2 可知，經(jīng)過不同加工工藝處理后的雜糧食品其DON 含量都會存在明顯的降低，且各工藝之間均存在顯著性差異。其中無堿蒸制方法與其他方法相比去除率較低僅為9.99%，其原因可能為蒸制工藝時所接觸水分較少，沒有達到破環(huán)DON 結(jié)構(gòu)的溫度，而添加了一定量的碳酸鈉具有一定效果但并不明顯，去除率為19.70%～24.37%；DON 去除效果最好的工藝為煮制，去除率為50.81%～70.99%，且隨添加碳酸鈉含量增加而升高，而添加0.3wt%碳酸鈉和0.35wt%碳酸鈉去除效果并無顯著差異，表明高濃度的堿性溶液對DON 的去除效果也是有限的，當達到一定限值后，降解效果將會降低。在煮制過程中，發(fā)現(xiàn)無碳酸鈉添加的去除率也高于蒸制工藝，這充分利用了DON 溶于水、在堿性條件下不穩(wěn)定的特點，隨著長時間的高溫處理，DON 一部分受熱分解，另一部分溶于水中轉(zhuǎn)移了樣本中的部分毒素以此達到去除的效果。

表2 蒸煮工藝對DON 的去除效果Table 2 Effect of baking and cooking on DON removal

2.3.2 啤酒釀造過程中對DON 去除效果

大麥是啤酒釀造的主要原料，其質(zhì)量直接影響到啤酒的質(zhì)量與口感，在田間生長與貯藏階段會受到不同程度的污染，盡管有一部分在洗麥與浸麥階段中被去除，但在制麥過程中其含量會成倍增長。麥芽制造的主要目的為了激活大麥中的酶，使胚乳中的物質(zhì)適當分解獲得足夠的浸出物與酶，其次為產(chǎn)生啤酒所需獨特的色、香、味，制麥工藝是決定麥芽品質(zhì)的重要因素之一。因此，將以天然污染的大麥研究啤酒釀造各階段DON 含量的變化趨勢。

由表3 可知，啤酒釀造整個過程中DON 含量呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢，這與前人得到的結(jié)論略有不同，Lancova 等[33]發(fā)現(xiàn)啤酒經(jīng)過釀造后最終含量可降低30%，這可能與加工工藝不同及原料差異有關。在大麥發(fā)芽制麥過程中麥芽毒素含量為初始大麥的58.33%，去除率為41.67%，原因可能為在浸麥過程中部分毒素溶于水，且在發(fā)芽時生成了毒素較低的代謝產(chǎn)物DON-3-葡萄糖苷與乙?；鵇ONs 從而導致整體毒素含量降低；糖化過程中DON 含量升高，與麥芽相比其含量增加了22.11%，但并未超過大麥中的毒素含量，去除率為25.11%；而發(fā)酵制得啤酒階段DON含量顯著升高，與麥芽相比毒素含量增加了48.45%，與大麥相比毒素含量增加了13.15%，原因可能為之前制麥發(fā)芽中生成的DON-3-葡萄糖苷與乙酰基DONs通過酶的作用進一步轉(zhuǎn)化為DON，且發(fā)酵環(huán)境適合毒素生長，導致整體毒素增加。

表3 啤酒釀造各階段對DON 去除效果Table 3 The removal effect of DON in different stages of beer brewing

3 結(jié)論

本文以多個貯藏條件進行模擬貯存，發(fā)現(xiàn)不同貯藏條件下大麥中DON 含量變化趨勢均有所不同，運用徑向基核函數(shù)構(gòu)建了SVM 模型，并以遺傳算法優(yōu)化了其預測能力，成功建立了預測模型，且擬合效果良好。在整個貯藏過程中，不同貯藏條件下大麥中DON 含量均呈現(xiàn)不同的上升趨勢，其中75% RH 環(huán)境含量較高，是DON 生長的最適條件，且相對濕度環(huán)境是影響DON 含量的重要因素。在整個貯藏階段，DON 含量最高增長了0.21 mg/kg，但均未超過國家規(guī)定標準。

采用三種常見的加工方式（蒸制、煮制、發(fā)酵）對DON 的去除效果進行研究，發(fā)現(xiàn)煮制去除效果最好，去除率為50.81%～70.99%，其次為蒸制，去除率為9.99%～24.37%，且添加碳酸鈉能夠有效增加去除率；而在啤酒發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，發(fā)芽過程去除率為41.67%，糖化過程去除率為25.11%比麥芽中毒素含量高了22.11%，發(fā)酵過程毒素含量比初始大麥高了13.15%、比麥芽高了48.45%。而多個加工工藝毒素含量變化的原因主要有兩個，其一為DON 的結(jié)構(gòu)遭到破環(huán)從而分解，其次是通過一些外部因素導致DON 生成次級代謝產(chǎn)物，例如DON-3-葡萄糖苷與乙?；鵇ONs 從而降低整體毒性。