婁雨豪，曹冬梅,3,4*，劉金明，張東杰，崔航，王冀菲，楊建

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）（2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江大慶 163319）（3.國家雜糧工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319）（4.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319）（5.北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)省級(jí)培育協(xié)同創(chuàng)新中心,黑龍江大慶 163319）（6.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）是真菌在適宜條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等代謝產(chǎn)生[1]，谷物在田間受到真菌的侵染，在適宜的氣溫和濕度等條件下真菌繁殖并產(chǎn)生DON，其在小麥、大麥、燕麥、玉米等谷物中含量較高。DON進(jìn)入人體會(huì)與蛋白質(zhì)的氨基、烴基及羧基發(fā)生作用，并與核糖體進(jìn)行結(jié)合出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制蛋白質(zhì)的合成[2]。當(dāng)人體內(nèi)蓄積大量DON 時(shí)會(huì)造成厭食、嘔吐、消化系統(tǒng)紊亂甚至?xí)鸪鲅劝Y狀[3]。而DON在水和極性溶劑中溶解度良好，理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，即使在170 ℃下加熱30 min 仍然不會(huì)降解[4]，因此原料經(jīng)過加工后無法保證其絕對(duì)的安全性[5]。但其在堿性條件下不穩(wěn)定，且降解后的產(chǎn)物毒性低于DON 的毒性[6]，所以加工脫毒常用此作為一種去除方法。

被DON 污染的原糧經(jīng)過加工流入市場(chǎng)被消費(fèi)者食用后，則會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，甚至?xí)鹬卸?。近年來，國?nèi)已有大量關(guān)于DON 污染糧食方面的檢測(cè)報(bào)道[7-11]，因此如何減少DON 含量就尤為重要，趙佳[12]以不同加工方式對(duì)小麥制品中DON 含量變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)能夠有效去除部分毒素。而大麥具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[13]，因其不利于面團(tuán)的成型及口感與色澤的欠缺，導(dǎo)致在我國多用作飼料飼草[14]。已有學(xué)者表明以一定比例替代小麥粉，能夠有效提升營養(yǎng)與物性指標(biāo)[15]，現(xiàn)如今以大麥為原料的一些制品已逐漸被人們所接受，如八寶粥[16]、面條[17]、飲料[18]、餅干[19]、陳醋[20]等食品，但此類雜糧食品的制作工藝中對(duì)DON 的去除效果還未見報(bào)道。

本文將主要研究大麥在不同溫度（5、15、25、35 ℃）和相對(duì)環(huán)境濕度（55%、65%、75%、85% RH）條件下貯藏180、270 與360 d 中DON 含量變化趨勢(shì)，以及三種加工工藝（蒸制、煮制、發(fā)酵）對(duì)食品中DON的模擬脫毒效果，運(yùn)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)各樣本中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量，為獲取最佳貯藏條件、膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大麥，CK15，佳木斯農(nóng)科院；小麥粉、谷阮粉，超市購買；TL-48R 型粉碎研磨儀，上海萬柏生物科技有限公司；QL-901 型旋渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；H1850 型離心機(jī)，湖南湘儀儀器有限公司；Infinite F50 型酶標(biāo)儀，山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司；HWS-150 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大麥貯藏

通過人工模擬貯藏環(huán)境濕度[21]，依次配制飽和硝酸鎂溶液、飽和亞硝酸鈉溶液、飽和氯化鈉溶液、飽和氯化鉀溶液，分別模擬55%、65%、75%、85% RH相對(duì)環(huán)境濕度。將300 g 大麥樣品分裝在不同濕度的燒杯中，共16 份（每個(gè)濕度4 份），再將盛有大麥樣品的燒杯裝入飽和溶液的大燒杯中，而后將其放入不同溫度（5、15、25、35 ℃）的恒溫培養(yǎng)箱中，分別模擬冷庫貯藏、低溫糧庫貯藏、常溫糧庫貯藏、南方高溫糧庫貯藏。在180、270、360 d 時(shí)進(jìn)行統(tǒng)一取樣用于后續(xù)分析，取樣完成后立即放入培養(yǎng)箱中，以免外界環(huán)境對(duì)樣品進(jìn)行干擾。

1.2.2 污染預(yù)測(cè)模型

SVM（支持向量機(jī)）模型是通過所選用的核函數(shù)將非線性數(shù)據(jù)映射到高維度的線性數(shù)據(jù)上，并對(duì)此進(jìn)行線性回歸分析[22]，具有良好的泛化能力彌補(bǔ)了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的缺陷。常見的核函數(shù)類型主要包括線性內(nèi)核、多項(xiàng)式內(nèi)核、徑向基內(nèi)核（RBF）及Sigmoid 核等[23]。其中RBF 核函數(shù)效率高、速度快，多用于解決非線性多變量回歸問題[24]。為優(yōu)化SVM 學(xué)習(xí)能力，現(xiàn)擁有網(wǎng)格搜索方法、粒子群算法（PSO）、遺傳算法（GA）等一些智能算法，本研究將對(duì)回歸模型的參數(shù)C、γ和ε進(jìn)行優(yōu)化[25]，以獲得最佳污染預(yù)測(cè)模型。

1.2.3 不同工藝對(duì)DON 去除效果影響

1.2.3.1 原料制備

因大麥中谷蛋白分子量較小且醇溶蛋白含量較低，在和面時(shí)無法形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致面團(tuán)松散，單獨(dú)以其進(jìn)行面制品加工時(shí)難以成型[26]，故而需要與小麥粉配比使用且添加適量的品質(zhì)改良劑。將大麥研磨成粉，過100 目篩，以1:3 的比例加入小麥粉，再加入面粉總質(zhì)量10%的谷阮粉得到復(fù)配后的雜糧面粉，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 蒸制加工方法

按照2:1 的比例加入雜糧粉與40 ℃的溫水，酵母添加量為1%進(jìn)行和面。揉面5 min 直至面團(tuán)光滑、不粘手，而后將面團(tuán)放入36 ℃的培養(yǎng)箱中醒發(fā)2.5 h，拿出分塊，每個(gè)50 g 揉成圓型后在室溫下進(jìn)行2 次醒發(fā)（20 min）。將水加熱至沸騰，放入蒸屜中蒸制20 min[27]。加堿面團(tuán)中碳酸鈉添加量與面粉比例分別為1:100 及1:200。

1.2.3.3 煮制加工方法

按照2:1 的比例加入雜糧粉與40 ℃的溫水，和面5 min 直至面團(tuán)光滑、不粘手，靜置熟化30 min 后，用面條機(jī)將其逐步壓延成厚1 mm 寬3 mm 的面條[28]。稱取500 mL 純水煮沸，分別加入1、1.25、1.5、1.75 g碳酸鈉，待溶解后放入做好的雜糧面條50 g，煮制8 min。

1.2.3.4 啤酒釀造方法

啤酒釀造工藝為：

大麥→浸麥→發(fā)芽→除根→粉碎→糊化→糖化→過濾→煮浮→添加酒花→旋沉冷卻→發(fā)酵→過濾

選取適量優(yōu)質(zhì)大麥進(jìn)行浸麥，使其含水量達(dá)到45%～50%左右進(jìn)行發(fā)芽，除根后放入培養(yǎng)箱中干燥。取出粉碎進(jìn)行糊化，在糊化鍋中加入適量的水加熱至40 ℃，進(jìn)行攪拌投入麥芽，升溫至50 ℃保持20 min后升高至63 ℃繼續(xù)糊化30 min 后在75 ℃下過濾，煮沸得到麥汁，酒花分三次添加依次在10、50、80 min時(shí)加入10%、60%、30%，然后經(jīng)過旋沉、冷卻至15 ℃，接種酵母后分別在14 ℃發(fā)酵4 d、8 ℃發(fā)酵4 d、4 ℃發(fā)酵7 d。最終經(jīng)過過濾得到啤酒。

1.2.4 毒素含量測(cè)定

酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒存放在低溫冰箱中，檢測(cè)時(shí)將其移入室溫環(huán)境（20～25 ℃），平衡1 h 以上。準(zhǔn)確稱取2 g 樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 去離子水震蕩5 min，室溫下4 000 r/min 離心10 min，取上清液0.5 mL 并加入0.5 mL 復(fù)溶液混勻后進(jìn)行分析。取上述溶液50 μL 于試劑盒各微孔中，每個(gè)樣本做兩孔平行，加入酶標(biāo)記物、抗體工作液各50 μL 在25 ℃下反應(yīng)30 min。洗滌后加入50 μL 底物液A、B，25 ℃避光反應(yīng)15 min。最后加入50 μL 中止液，使用酶標(biāo)儀于450 nm 測(cè)定其吸光度值并計(jì)算相應(yīng)毒素大小，且毒素檢測(cè)時(shí)試驗(yàn)條件應(yīng)保持一致。

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別吸取0、10、30、90、270、810 ng/mL 濃度的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 進(jìn)行測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X，ng/mL），相應(yīng)百分吸光率值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：

線性擬合程度良好，能夠滿足當(dāng)前檢測(cè)需求。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Matlab、Origin 與SPSS 軟件進(jìn)行處理及計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏條件下DON 含量變化趨勢(shì)

大麥在貯藏期間若儲(chǔ)藏不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致發(fā)霉、陳化等一系列問題，使其食用品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值降低。因此，隨著時(shí)間推移在不同溫濕度環(huán)境下，研究大麥中DON含量變化趨勢(shì)可以有針對(duì)性的控制貯藏環(huán)境，同時(shí)確保了儲(chǔ)糧的安全性，為實(shí)現(xiàn)大麥的安全貯藏、減少儲(chǔ)糧損失及提高儲(chǔ)糧質(zhì)量提供了有力依據(jù)。但因毒素具有非均勻性分布的特點(diǎn)，導(dǎo)致檢測(cè)無法十分準(zhǔn)確的代表當(dāng)前環(huán)境的全部情況，所以取樣時(shí)需多點(diǎn)、大量取樣充分混勻后進(jìn)行試驗(yàn)。

由圖1 可知，不同貯藏條件下隨環(huán)境溫濕度的增加，大麥中DON 含量均呈現(xiàn)不同的上升趨勢(shì)，其中5 ℃環(huán)境下DON 波動(dòng)幅度較小，而隨溫度的不斷上升DON含量也隨之增加，可以發(fā)現(xiàn)25 ℃與35 ℃時(shí)DON含量大幅度增加，且各組間差異高于5 ℃與15 ℃環(huán)境，相對(duì)環(huán)境濕度對(duì)其的影響逐漸加大。而從相對(duì)環(huán)境濕度角度分析，可以發(fā)現(xiàn)隨濕度的增加各組間DON含量具有較大的差異，在75% RH 條件下DON 含量較高，其次為85% RH、65% RH，55% RH 時(shí)DON含量較低。在5 ℃與15 ℃條件下，85% RH 與65% RH環(huán)境DON 無較大差異，而在25 ℃環(huán)境中，85% RH的DON 含量高于其他溫度，整個(gè)貯藏過程中DON 含量達(dá)到最高的環(huán)境為35 ℃ 75% RH，其值為0.65 mg/kg 比貯藏前的大麥中DON 含量高了0.21 mg/kg。從整體角度來看，75% RH 環(huán)境是DON生長的最適條件，且相對(duì)濕度環(huán)境是影響DON 含量的重要因素。

圖1 不同貯藏條件下DON 含量變化趨勢(shì)Fig.1 Change trend of DON content under different storage conditions

在整個(gè)貯藏階段，DON 含量整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)貯藏180 d 時(shí)DON 含量上升趨勢(shì)較為緩慢，這是由于剛收獲的大麥通常處于休眠狀態(tài)，隨著貯藏時(shí)間的增加，大麥本身會(huì)逐漸脫離休眠狀態(tài)，來抵御真菌毒素的進(jìn)一步污染[29]。在貯藏270 d 時(shí)DON 含量上升趨勢(shì)較大，由于收獲的大麥中附帶了田間生長環(huán)境中的真菌體系，Mannaa[30]發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬與鐮刀菌屬在收獲前會(huì)附著在成熟的谷物上，而DON 正是鐮刀菌屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物，經(jīng)過一段時(shí)間的貯藏后逐漸產(chǎn)生代謝產(chǎn)物導(dǎo)致毒素累積，總體DON 含量上升，并且也有研究表明，毒素在某一階段含量較高時(shí)可能是由于這種毒素的產(chǎn)毒真菌在這一貯藏時(shí)間達(dá)到了優(yōu)良生長期，代謝量增大[31]。而在貯藏360 d 時(shí)DON 含量上升趨勢(shì)較為緩慢，由于貯藏環(huán)境已趨于穩(wěn)定并且田間真菌逐漸過渡為貯藏真菌，優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生了更替，鐮刀菌屬相對(duì)豐度占比下降，已有研究發(fā)現(xiàn)糧食在貯藏過程中不同類型的微生物代謝產(chǎn)物之間會(huì)進(jìn)行相互抑制[32]，因此導(dǎo)致DON 含量上升緩慢。

2.2 污染預(yù)測(cè)模型

模型以貯藏大麥中DON 含量作為因變量，溫度、相對(duì)環(huán)境濕度及時(shí)間作為自變量而建立。數(shù)據(jù)按照DON 含量從小到大依次排序，隨機(jī)抽取75%的數(shù)據(jù)作為校正集，剩余25%數(shù)據(jù)為驗(yàn)證集。通過校正決定系數(shù)R2C、校正均方根誤差RMSEC、驗(yàn)證決定系數(shù)R2P、預(yù)測(cè)均方根誤差RMSEP、平均相對(duì)誤差MPE 評(píng)價(jià)模型的準(zhǔn)確性。其中R2C、R2P代表了自變量對(duì)因變量的解釋程度，越接近于1 時(shí)預(yù)測(cè)性能越好、RMSEC、RMSEP 代表了模型的準(zhǔn)確度與精密度，越接近于0 時(shí)準(zhǔn)確度與精密度越高，而MPE 值越小越好。

由表1 可知，三種SVM 污染預(yù)測(cè)模型的擬合效果良好，其中GA-SVM 模型與其他SVM 模型相比，決定系數(shù)最高、均方根誤差最小，說明其預(yù)測(cè)精度最高。模型如圖2 所示，校正集與驗(yàn)證集的樣本點(diǎn)基本都在對(duì)角線上，說明不同貯藏條件下大麥中DON 含量的回歸預(yù)測(cè)模型建立成功，具有良好的預(yù)測(cè)性能。

表1 不同模型預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比Table 1 Comparison of prediction results of different models

圖2 貯藏大麥中DON 含量的校正集與驗(yàn)證集分布Fig.2 Distribution of calibration set and verification set of DON content in barley during storage

2.3 不同加工工藝對(duì)DON 去除效果

2.3.1 蒸煮工藝對(duì)DON 去除效果

蒸煮是我國居民家庭最主要的加工方式，對(duì)加工過程中DON 含量變化進(jìn)行分析有助于合理加工食物，對(duì)降低膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)具有重要作用。在蒸煮過程中加入適量碳酸鈉（Na2CO3）能夠有效去除面團(tuán)中的酸味、改善食用口感。碳酸鈉是我國食品加工中常用的添加劑，其水溶液呈堿性，因DON 理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，對(duì)高溫具有較強(qiáng)的耐受性導(dǎo)致去除程度有限，而堿能夠有效破壞DON 的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因此將以天然污染的大麥與小麥粉為原料探究各因素對(duì)DON 含量變化的影響。

由表2 可知，經(jīng)過不同加工工藝處理后的雜糧食品其DON 含量都會(huì)存在明顯的降低，且各工藝之間均存在顯著性差異。其中無堿蒸制方法與其他方法相比去除率較低僅為9.99%，其原因可能為蒸制工藝時(shí)所接觸水分較少，沒有達(dá)到破環(huán)DON 結(jié)構(gòu)的溫度，而添加了一定量的碳酸鈉具有一定效果但并不明顯，去除率為19.70%～24.37%；DON 去除效果最好的工藝為煮制，去除率為50.81%～70.99%，且隨添加碳酸鈉含量增加而升高，而添加0.3wt%碳酸鈉和0.35wt%碳酸鈉去除效果并無顯著差異，表明高濃度的堿性溶液對(duì)DON 的去除效果也是有限的，當(dāng)達(dá)到一定限值后，降解效果將會(huì)降低。在煮制過程中，發(fā)現(xiàn)無碳酸鈉添加的去除率也高于蒸制工藝，這充分利用了DON 溶于水、在堿性條件下不穩(wěn)定的特點(diǎn)，隨著長時(shí)間的高溫處理，DON 一部分受熱分解，另一部分溶于水中轉(zhuǎn)移了樣本中的部分毒素以此達(dá)到去除的效果。

表2 蒸煮工藝對(duì)DON 的去除效果Table 2 Effect of baking and cooking on DON removal

2.3.2 啤酒釀造過程中對(duì)DON 去除效果

大麥?zhǔn)瞧【漆勗斓闹饕?，其質(zhì)量直接影響到啤酒的質(zhì)量與口感，在田間生長與貯藏階段會(huì)受到不同程度的污染，盡管有一部分在洗麥與浸麥階段中被去除，但在制麥過程中其含量會(huì)成倍增長。麥芽制造的主要目的為了激活大麥中的酶，使胚乳中的物質(zhì)適當(dāng)分解獲得足夠的浸出物與酶，其次為產(chǎn)生啤酒所需獨(dú)特的色、香、味，制麥工藝是決定麥芽品質(zhì)的重要因素之一。因此，將以天然污染的大麥研究啤酒釀造各階段DON 含量的變化趨勢(shì)。

由表3 可知，啤酒釀造整個(gè)過程中DON 含量呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，這與前人得到的結(jié)論略有不同，Lancova 等[33]發(fā)現(xiàn)啤酒經(jīng)過釀造后最終含量可降低30%，這可能與加工工藝不同及原料差異有關(guān)。在大麥發(fā)芽制麥過程中麥芽毒素含量為初始大麥的58.33%，去除率為41.67%，原因可能為在浸麥過程中部分毒素溶于水，且在發(fā)芽時(shí)生成了毒素較低的代謝產(chǎn)物DON-3-葡萄糖苷與乙?；鵇ONs 從而導(dǎo)致整體毒素含量降低；糖化過程中DON 含量升高，與麥芽相比其含量增加了22.11%，但并未超過大麥中的毒素含量，去除率為25.11%；而發(fā)酵制得啤酒階段DON含量顯著升高，與麥芽相比毒素含量增加了48.45%，與大麥相比毒素含量增加了13.15%，原因可能為之前制麥發(fā)芽中生成的DON-3-葡萄糖苷與乙?；鵇ONs通過酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為DON，且發(fā)酵環(huán)境適合毒素生長，導(dǎo)致整體毒素增加。

表3 啤酒釀造各階段對(duì)DON 去除效果Table 3 The removal effect of DON in different stages of beer brewing

3 結(jié)論

本文以多個(gè)貯藏條件進(jìn)行模擬貯存，發(fā)現(xiàn)不同貯藏條件下大麥中DON 含量變化趨勢(shì)均有所不同，運(yùn)用徑向基核函數(shù)構(gòu)建了SVM 模型，并以遺傳算法優(yōu)化了其預(yù)測(cè)能力，成功建立了預(yù)測(cè)模型，且擬合效果良好。在整個(gè)貯藏過程中，不同貯藏條件下大麥中DON 含量均呈現(xiàn)不同的上升趨勢(shì)，其中75% RH 環(huán)境含量較高，是DON 生長的最適條件，且相對(duì)濕度環(huán)境是影響DON 含量的重要因素。在整個(gè)貯藏階段，DON 含量最高增長了0.21 mg/kg，但均未超過國家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

采用三種常見的加工方式（蒸制、煮制、發(fā)酵）對(duì)DON 的去除效果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)煮制去除效果最好，去除率為50.81%～70.99%，其次為蒸制，去除率為9.99%～24.37%，且添加碳酸鈉能夠有效增加去除率；而在啤酒發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，發(fā)芽過程去除率為41.67%，糖化過程去除率為25.11%比麥芽中毒素含量高了22.11%，發(fā)酵過程毒素含量比初始大麥高了13.15%、比麥芽高了48.45%。而多個(gè)加工工藝毒素含量變化的原因主要有兩個(gè)，其一為DON 的結(jié)構(gòu)遭到破環(huán)從而分解，其次是通過一些外部因素導(dǎo)致DON 生成次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如DON-3-葡萄糖苷與乙?；鵇ONs 從而降低整體毒性。