石曾卉，劉麗陽(yáng)，洪慧麗，勾東霞，劉多,2*

（1.長(zhǎng)春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000）（2.長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000）

山芹菜[Ostericum sieboldii（Miq.）Nakai]是傘形科、山芹屬的多年生草本植物，也稱短果茴芹、大葉芹、山芹等，有兩種變種，分別為狹葉山芹和毛山芹。山芹菜在我國(guó)主要分布于吉林、遼寧、黑龍江等海拔150～1 400 m 的針闊葉混交林地區(qū)[1]，其幼苗在春季常被采摘食用，有良好的風(fēng)味，是長(zhǎng)白山地區(qū)代表性的山野菜之一。從外觀來(lái)看，山芹菜主根短、分枝較多，整體顏色呈黃褐色至棕褐色；莖相較家芹而言細(xì)、且溝紋深，多為二年生或多年生草本植物[2]。花期為八月到九月，果期為九月到十月。古代中藥書(shū)中記載，山芹菜可以清熱解毒、滋陰養(yǎng)顏、治療風(fēng)濕痹痛、腰膝酸痛和感冒頭痛等[3]，具有一定的保健功能。此外有研究表明，山芹菜含有許多的生物活性化合物，具有高于普通蔬菜水果的生物活性[4]。

植物多糖是植物體內(nèi)很重要的一類(lèi)生物大分子，為醛糖或酮糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，與機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸和癌癥的診斷與治療等密切相關(guān)，也是有效維持和保證生物體生命活動(dòng)能夠正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)，目前已被廣泛應(yīng)用于食品和藥品等多種領(lǐng)域[5,6]，近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。目前對(duì)植物多糖提取方法的研究已較為成熟，但是由于多糖分子量大，結(jié)構(gòu)解析復(fù)雜，因此對(duì)其精細(xì)結(jié)構(gòu)分析研究較少[7-10]。目前研究表明，針對(duì)山芹菜的研究主要包括山芹菜多糖的提取和含量測(cè)定，以及山芹菜揮發(fā)性成分的生物活性[11,12]。而對(duì)山芹菜多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)解析未見(jiàn)報(bào)道。本文在對(duì)山芹菜中的多糖進(jìn)行提取的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其組分進(jìn)行分離純化，并測(cè)定了各個(gè)多糖組分的主要化學(xué)成分、基本結(jié)構(gòu)和體外抗氧化活性，旨在為山芹菜在醫(yī)藥和食品等方面的應(yīng)用提供參考，為東北地區(qū)山野菜的深度開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

山芹菜，購(gòu)于吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)；苯酚、硫酸，分析純，北京化工廠有限責(zé)任公司；DEAE 纖維素，上海源葉生物科技有限公司；乙腈，色譜純，北京化工廠有限責(zé)任公司；甲醇，色譜純，北京化工廠有限責(zé)任公司；氯化鈉，色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

BM312-B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、3K15 臺(tái)式高速離心機(jī)，上海亞榮生化儀器廠；LC-10AT 高效液相色譜儀，日本島津公司；Nicolet is 5 傅里葉紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山芹菜多糖的提取及分離純化

1.3.1.1 多糖提取

通過(guò)水提醇沉法提取山芹菜中的植物多糖。稱取一定量的新鮮山芹菜，在料液比1:20（g/mL）、提取時(shí)間4 h、提取溫度100 ℃的條件下進(jìn)行提取，過(guò)濾濾渣得到山芹菜粗多糖提取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將粗多糖液濃縮后，在4 ℃下用φ=70%乙醇醇沉24 h，4 000 r/min 離心20 min 收集沉淀，在60 ℃水浴下不停地?cái)嚢韬娓沙ヒ掖?，加dH2O 溶解冷凍干燥，得到山芹菜多糖（WOSP）。

1.3.1.2 多糖分離純化

離子交換層析法分離純化WOSP。將2 g WOSP用100 mLdH2O充分溶解后緩慢加入DEAE離子交換層析柱中，待其完全進(jìn)入后用dH2O 為流動(dòng)相洗脫山芹菜中性多糖（WOSP-N），洗脫完全后將流動(dòng)相替換為0～0.5 mol/L NaCl 洗脫山芹菜酸性多糖（WOSP-A）。將洗脫完全后的WOSP-N、WOSP-A 溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮體積，透析后冷凍干燥得到固體。

1.3.1.3 多糖分子量測(cè)定

高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測(cè)定WOSP-A和WOSP-N 的分子量。使用分子量為5 000、12 000、25 000 和50 000 u 的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)x（tR）和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)y（lgM）作圖，得到回歸曲線方程：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖的分子量。

HPGPC 分析方法：采用高效液相系統(tǒng)（CTO-20 A泵和RID-10 A 檢測(cè)器），TSK-gel G-3000 PWXL 色譜柱（4.6×150 mm），流動(dòng)相為0.2 mol/L NaCl 水溶液，體積流量為1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積20 μL，采用示差檢測(cè)器檢測(cè)。

1.3.2 山芹菜多糖基本化學(xué)組成測(cè)定

1.3.2.1 總糖含量測(cè)定

依據(jù)苯酚-硫酸法[13]并進(jìn)行適當(dāng)改良，分別測(cè)定WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 中總糖含量。配制濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液，吸取10 μL糖溶液于2.5 mL EP 管中，加dH2O 至1 mL，然后加入50 μLw=6%的苯酚和250 μL 濃硫酸，立刻震蕩搖勻，置于沸水浴中反應(yīng)15 min。反應(yīng)完畢后迅速冷卻，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)液在490 nm 的OD 值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的總糖含量為橫坐標(biāo)x（mg）和不同濃度下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品吸光度為縱坐標(biāo)y（OD 值）作圖，得到多糖的回歸曲線方程：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的總糖含量。

1.3.2.2 糖醛酸含量測(cè)定

依據(jù)間羥基聯(lián)苯法[14]并進(jìn)行適當(dāng)改良，分別測(cè)定WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 中糖醛酸含量。配制濃度為0.1 mg/mL 的山芹菜多糖溶液，吸取60 μL 糖溶液于2.5 mL EP 管中，加蒸餾水至1 mL 后加入250 μL濃硫酸和4 μL 間羥基聯(lián)苯，100 ℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻后加入4 μL 氨基磺酸反應(yīng)15 min。反應(yīng)完畢后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)液在525 nm 的OD 值。以半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品的糖醛酸含量為橫坐標(biāo)x（mg）和不同濃度下糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品吸光度為縱坐標(biāo)y（OD 值）作圖，得到多糖的回歸曲線方程：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的糖醛酸含量。

1.3.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

依據(jù)考馬斯亮藍(lán)法[15]并進(jìn)行適當(dāng)改良，分別測(cè)定WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 中蛋白質(zhì)含量。配制濃度為0.05 mg/mL 的山芹菜多糖溶液，吸取100 μL 糖溶液于5 mL EP 管中，加蒸餾水至1 mL，然后加入2.5 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液，立刻震蕩搖勻，反應(yīng)5 min。反應(yīng)完畢后用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)液在590 nm 的OD 值。以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)x（mg）和不同濃度下牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品吸光度為縱坐標(biāo)y（OD 值）作圖，得到多糖的回歸曲線方程：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 山芹菜多糖單糖組成測(cè)定

首先對(duì)WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 進(jìn)行衍生化反應(yīng)：稱取1 mg 多糖樣品置于酸水解小瓶中，加入1 mL 的2 mol/L 鹽酸甲醇溶液，充N(xiāo)2密封后，置于80 ℃金屬浴中水解10 h 后用空氣泵吹干，再加入1 mL 的2 mol/L 三氟乙酸溶液，于120 ℃金屬浴中水解1 h 后用空氣泵吹干除去三氟乙酸?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品由甘露糖（Man）、葡萄糖醛酸（GlcA）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc）各0.1 mg組成，得到標(biāo)準(zhǔn)品混合液，置于酸水解小瓶中備用。

向完全酸水解后得到的干燥樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)品中加入500 μL 的0.3 mol/L NaOH 溶液，使樣品充分溶解，再加入500 μL 的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）-甲醇溶液進(jìn)行混合，取200 μL混合液于1.5 mL EP管中。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在70 ℃條件下水浴反應(yīng)0.5 h，分別加入100 μL 的0.3 mol/L HCl 溶液，充分混勻后加入700 μL CH3Cl，充分振蕩后，萃取得到剩余的PMP-甲醇試劑，棄去CH3Cl 層，保留水層，重復(fù)操作萃取三次。0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行檢測(cè)。

高效液相色譜法（HPLC）分析方法：采用Shimadzu HPLC 系統(tǒng)（CTO-20A 泵和SPD-20AVD 紫外光檢測(cè)器），DIKMA Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6×150 mm），流動(dòng)相為PBS（0.2 mol/L，pH 值7.0）-乙腈19.2:80.8（V/V），體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm。

1.3.4 山芹菜多糖紅外光譜測(cè)定

在干燥條件下將1 mg 樣品與180 mg 無(wú)水溴化鉀混合壓制成片，使用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定在4 000～500 cm-1的波長(zhǎng)范圍內(nèi)多糖的FT-IR 光譜。

1.3.5 WOSP-A 和WOSP-N 酶解實(shí)驗(yàn)

選擇阿拉伯聚糖酶（α-1,5-Arabinanase）、半乳聚糖酶（β-1,4-Galactanase ）和半乳糖醛酸酶（Endo-polygalacturonanase）對(duì)WOSP-A 和WOSP-N進(jìn)行酶解。配制0.2 mol/L 的醋酸-醋酸鈉緩沖液并調(diào)節(jié)pH 值（半乳糖醛酸酶pH 值為5.0，阿拉伯聚糖酶和半乳聚糖酶pH 值為4.0，混合添加時(shí)pH 值為4.5），取400 μL 緩沖液溶解1 mg 樣品后加入1 μL 酶溶液，40 ℃反應(yīng)12～24 h 后，98 ℃反應(yīng)5 min 將酶滅活，再用0.22 μm 水系濾膜過(guò)濾。

HPGPC 法測(cè)定酶解后多糖的分子量，測(cè)定方法同1.3.1.3。通過(guò)酶解前后分子量對(duì)比，進(jìn)一步明確WOSP-A 和WOSP-N 中糖苷鍵組成。

1.3.6 山芹菜多糖體外抗氧化性質(zhì)測(cè)定

通過(guò)對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、超氧陰離子自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）清除能力和對(duì)鐵離子（Fe3+）還原能力[16,17]測(cè)定WOSP、WOSP-A和WOSP-N 三種多糖的體外抗氧化能力。

配制0.5、1、2、5 和10 mg/mL 5 個(gè)梯度的三種多糖樣品溶液，dH2O 為空白對(duì)照，Vc 為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品測(cè)定3 次取其平均值。

1.3.6.1 清除DPPH·能力測(cè)定

取0.6 mL 不同濃度的三種多糖樣品溶液，分別加入2.4 mL 的0.1 mmol/L DPPH，充分混勻后避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測(cè)定混合溶液OD 值A(chǔ)1，同時(shí)測(cè)定dH2O 的OD 值A(chǔ)0，將無(wú)水乙醇代替DPPH 測(cè)得OD值為A2。DPPH·清除率（記為F1，%）計(jì)算公式如下：

1.3.6.2 清除O2-·能力測(cè)定

取50 μL 不同濃度的三種多糖樣品溶液，加入50 μL 的300 μmol/L NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）、50 μL的936 μmol/L NADH（還原型輔酶Ⅰ）、50 μL 的120 μmol/L PMS（吩嗪硫酸甲脂），充分混勻后避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測(cè)定混合溶液OD 值B1，同時(shí)測(cè)定dH2O 的OD 值B0作為空白對(duì)照，將dH2O 代替PMS 測(cè)得OD 值B2。O2-·清除率（記為F2，%）計(jì)算公式如下：

1.3.6.3 清除·OH 能力測(cè)定

取500 μL 不同濃度的三種多糖樣品溶液，加入1 mL FeSO4、1 mL 水楊酸、1 mL H2O2（過(guò)氧化氫），充分混勻后避光反應(yīng)30 min，在510 nm 處測(cè)定混合溶液的OD 值C1，同時(shí)測(cè)定dH2O 的OD 值C0作為空白對(duì)照，將dH2O 代替H2O2測(cè)得OD 值C2。·OH 清除率（記為F3，%）計(jì)算公式如下：

1.3.6.4 Fe3+還原能力測(cè)定

取1 mL 不同濃度的三種多糖樣品溶液，加入2.5 mL 的0.2 mol/L PBS（pH 值6.6）、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混勻后于50 ℃下恒溫水浴20 min，迅速冰浴冷卻，加入1 mL 的10wt% TCA（三氯乙酸）溶液混合均勻后，離心取1.5 mL 上清液加入1.5 mLdH2O、1.5 mL 0.1wt%的FeCl3溶液，振蕩后靜置10 min，在700 nm 處測(cè)定吸光度值D1，空白對(duì)照測(cè)得吸光度值D0。Fe3+還原能力（記為H，%）計(jì)算公式如下：

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 24 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 2018 64Bit 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 山芹菜多糖的提取及分離純化

采用水提醇沉法獲得WOSP 得率為6.78%，經(jīng)DEAE 纖維素離子柱層析分離后的WOSP-A 和WOSP-N 得率分別為51.34%和2.55%。WOSP 線性梯度洗脫結(jié)果如圖1a 所示：WOSP-N 被dH2O 洗脫下來(lái)，WOSP-A 隨著NaCl 濃度的增加而逐漸被洗脫下來(lái)，并在0.24 mol/L 的NaCl 溶液處有較為明顯的洗脫峰。進(jìn)一步分析其分子量分布，WOSP-A 分子量主要分布在14.21 ku 左右（圖1b），WOSP-N 分子量主要分布在169.36 ku 左右（圖1c）。

圖1 山芹菜多糖的梯度洗脫圖和分子量分布圖Fig.1 Gradient elution and molecular weight distribution of polysaccharides from WOSP

2.2 山芹菜多糖基本化學(xué)組成分析

三種多糖的總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量測(cè)定結(jié)果如表1 所示。它們的總糖及蛋白質(zhì)含量幾乎無(wú)差異。WOSP-A 糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35.38%，明顯高于WOSP和WOSP-N?？赡苁怯捎谒嵝远嗵侵泻邪肴樘侨┧岷推咸烟侨┧岬人嵝詥翁牵虼薟OSP-A 中糖醛酸含量明顯高于WOSP 和WOSP-N。

表1 WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 的總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量Table 1 The total sugar,protein and uronic acid content of polysaccharides from WOSP,WOSP-A and WOSP-N

2.3 山芹菜多糖單糖組成分析

三種多糖與九種標(biāo)準(zhǔn)混合樣品比對(duì)分析結(jié)果如表2 所示。在WOSP 中，主要單糖組分及物質(zhì)的摩爾比為GalA:Gal:Ara=11.36:41.50:38.08。進(jìn)一步純化后的兩個(gè)多糖組分的單糖組成存在一定差異，WOSP-A中主要單糖組分及物質(zhì)的摩爾比為GalA:Gal:Ara=46.99:26.56:19.94，其中糖醛酸所占比例較高，與苯酚-硫酸法所檢測(cè)的糖醛酸含量檢測(cè)結(jié)果相符合，推測(cè)WOSP-A 是主要含有 GalA 的聚半乳糖醛酸（Homogalacturonan，HG）果膠和以Gal 和Ara 為主的阿拉伯半乳聚糖（Type I Arabic Galactans，AG）果膠[18-20]；WOSP-N 中主要單糖組分及物質(zhì)的摩爾比為Gal:Ara=55.32:30.69，GalA 含量較低，推測(cè)WOSP-N是主要含有Gal 和Ara 的AG 型果膠。

表2 WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 單糖組成表Table 2 Monosaccharide composition of WOSP,WOSP-A and WOSP-N

2.4 山芹菜多糖紅外光譜分析

三種多糖的紅外光譜測(cè)定結(jié)果如圖2 所示。參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析[21-23]。它們的光譜圖含有的特征吸收峰大致相同。在3 374.72 cm-1、1 261.38 cm-1附近的吸收峰為多糖O-H 伸縮振動(dòng)特征峰；2 953.93 cm-1附近的吸收峰為多糖類(lèi)物質(zhì)C-H 伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生的，說(shuō)明可能存在飽和碳?xì)滏I的伸縮振動(dòng)，這是糖類(lèi)物質(zhì)的特征吸收峰；1 738.98 cm-1附近的特征吸收峰為酯基C=O 的伸縮振動(dòng)峰，表明在WOSP-A 中含有糖醛酸；1 424.16 cm-1處的吸收峰可能為C-H 鍵的變角振動(dòng)和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生的；1 074.42 cm-1附近的特征吸收峰為C-O-C碳水化合物骨架的伸縮振動(dòng)峰，表明在WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 組分中均存在有吡喃糖環(huán)；在802.24 cm-1附近顯示為α-糖苷鍵，在WOSP和WOSP-N組分中單糖之間可能存在α-糖苷鍵的連接方式。

圖2 WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of polysaccharide fractions from WOSP,WOSP-A and WOSP-N

2.5 WOSP-A 和WOSP-N 酶解結(jié)果分析

為了進(jìn)一步明確兩種多糖的糖苷鍵連接方式[24]，根據(jù)它們的單糖組成結(jié)果，分別向兩種多糖加入不同的酶進(jìn)行分析。由單糖結(jié)果可知，WOSP-A 中主要含有GalA、Gal 和Ara，因此向WOSP-A 中以不同組合添加能夠水解α-1,4-半乳糖醛酸糖苷鍵的內(nèi)切-半乳糖醛酸酶（Endo-polygalacturonanase）、水解β-1,4-半乳糖糖苷鍵的β-1,4-半乳聚糖酶（β-1,4-Galactanase）和水解α-1,5-阿拉伯糖糖苷鍵的內(nèi)切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶（α-1,5-Arabinanase），結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)添加單一酶（圖3a、b、c）后，WOSP-A 的分子量發(fā)生變化，將三種酶同時(shí)作用于WOSP-A（圖3d），其分子量明顯降低。說(shuō)明三種酶將WOSP-A 中的α-1,4-半乳糖醛酸糖苷鍵、β-1,4 半乳糖糖苷鍵和α-1,5 阿拉伯糖糖苷鍵破壞，使其分子量變小，當(dāng)組合三種酶水解WOSP-A時(shí)，糖苷鍵破壞更為徹底，基本將其降解成分子量較低的寡糖片段。因此，WOSP-A 含有α-1,4-半乳糖醛酸、β-1,4-半乳糖和α-1,5-阿拉伯糖。結(jié)合單糖及紅外分析結(jié)果，推測(cè)WOSP-A 主要由HG 型果膠（以α-1，4-GalA 為主）和AG-I 型果膠（以β-1,4-Galp和α-1,5-Araf為主）結(jié)構(gòu)域組成。

圖3 WOSP-A 酶解后分子量分布圖Fig.3 Molecular weight distribution of WOSP-A after enzymatic hydrolysis

由單糖結(jié)果可知，WOSP-N 中GalA 的含量較低，因此不再添加內(nèi)切-半乳糖醛酸酶。僅向WOSP-N 中以單獨(dú)或組合方式添加β-1,4-Galactanase 和α-1,5-Arabinanase，結(jié)果如圖4 所示。對(duì)于WOSP-N而言，添加能夠降解AG-I 型果膠的β-1,4-Galactanase和α-1,5-Arabinanase 后，WOSP-N 的分子量均未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明WOSP-N 不含有AG-I 型果膠。由于以Ara 和Gal 為主的AG 型果膠主要包括AG-I 型和AG-II 型，結(jié)合單糖及紅外分析結(jié)果，推測(cè)WOSP-N主要是由AG-II 型果膠（β-1,3/6-Galp和α-1,3-Araf）結(jié)構(gòu)域組成。

圖4 組合添加半乳聚糖酶和阿拉伯聚糖酶水解WOSP-N 前后分子量變化圖Fig.4 Molecular weight distribution of WOSP-N after enzymatic hydrolysis by β-1,4-Galactanase and α-1,5-Arabinanase

2.6 山芹菜多糖體外抗氧化能力分析

三種多糖的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5、6、7和8所示。WOSP的DPPH·清除力明顯高于WOSP-A和WOSP-N（圖5），當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到50%左右，且隨濃度增加呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL 時(shí)，自由基清除能力與Vc 的清除能力相當(dāng)；WOSP-A 和WOSP-N 質(zhì)量濃度低于5 mg/mL 時(shí)，清除DPPH·能力較低；質(zhì)量濃度高于5 mg/mL 時(shí)，清除DPPH·能力明顯上升。研究表明，多糖中的單糖以糖苷鍵形式連接，其中含有游離醛基或酮基的單糖具有還原性，它們可以提供氫，氫可以與自由基結(jié)合來(lái)終止自由基反應(yīng)，抗氧化活性可能與分子大小和構(gòu)象有關(guān)[25,26]，WOSP-A 對(duì)DPPH·的清除能力高于WOSP-N，說(shuō)明隨著分子量的升高，多糖清除DPPH·的能力逐漸下降。朱曉冉等[27]探究不同分子量黑木耳多糖的抗氧化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，小分子量的黑木耳多糖清除DPPH·的能力更強(qiáng)。WOSP 對(duì)DPPH·的清除能力明顯高于WOSP-A 和WOSP-N，當(dāng)多糖溶解于水后呈現(xiàn)不同鏈構(gòu)象，會(huì)影響其生物活性，具體關(guān)系還有待進(jìn)一步探究。從結(jié)果來(lái)看，推測(cè)山芹菜抗氧化能力是酸性糖和中性糖在協(xié)同發(fā)揮作用。

圖5 WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 的DPPH·的清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of WOSP,WOSP-A and WOSP-N

三種多糖對(duì)O2-·的清除能力呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，隨著濃度的增加，多糖對(duì)O2-·的清除率逐漸增強(qiáng)，其中WOSP 的清除能力比WOSP-A 和WOSP-N 強(qiáng)，當(dāng)溶度達(dá)到10 mg/mL 時(shí)，清除O2-·能力與Vc 相當(dāng)（圖6）。O2-·是基態(tài)氧接受電子后形成的，容易在體內(nèi)產(chǎn)生且發(fā)生轉(zhuǎn)化[28]，因此評(píng)價(jià)O2-·清除能力十分有必要。多糖能夠催化O2-·與氫離子結(jié)合，因此不同分子量可能是影響O2-·清除能力的原因之一，Wu 等[29]研究壇紫菜多糖發(fā)現(xiàn)抗氧化活性大小與分子量呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)比較多糖的分子量大小可知，其中WOSP-N的分子量大于WOSP-A，因此抗氧化活性較低。而WOSP 中包含WOSP-A 和WOSP-N，具有更多的醛酮類(lèi)強(qiáng)電基團(tuán)，因而具有更強(qiáng)的清除O2-·能力。

圖6 WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 的O2-·的清除能力Fig.6 Superoxide anion free radical scavenging ability of WOSP,WOSP-A and WOSP-N

三種多糖對(duì)·OH 清除能力隨著濃度的增加而增加，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，但三者之間對(duì)·OH 的清除能力無(wú)明顯差異，均不如Vc（圖7）。·OH 氧化能力強(qiáng)，會(huì)造成多糖解聚、核酸斷裂等，與衰老作用等有關(guān)。國(guó)內(nèi)外已將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)[30,31]?！H 清除能力與多糖中總糖含量相關(guān)，而三種多糖總糖含量接近，因此其·OH 清除能力接近。研究顯示抗氧化活性也與某些特定的單糖及衍生物相關(guān)，如巖藻糖、鼠李糖和糖醛酸含量高時(shí)多糖清除·OH能力較強(qiáng)[32]，而本研究中三種多糖的單糖組成中巖藻糖和鼠李糖的含量極低，因此整體而言·OH 清除能力較低，其中WOSP-A 糖醛酸含量高，所以在三種多糖中的·OH 清除能力相對(duì)較好。

圖7 WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 的·OH 的清除能力Fig.7 Scavenging ability of hydroxyl radicals of WOSP,WOSP-A and WOSP-N

三種多糖對(duì)Fe3+的還原能力結(jié)果如圖8 所示。WOSP 具有一定的Fe3+還原能力，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性；而WOSP-A、WOSP-N 對(duì)Fe3+的還原能力較弱，且不隨濃度變化呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢(shì)。研究表明，多糖可以與產(chǎn)生活性氧所必須的金屬離子形成絡(luò)合物[33,34]，因此多糖可以抑制活性氧自由基的產(chǎn)生，從而達(dá)到抗氧化目的，其抗氧化能力與單糖中的Ara和Glc 等有關(guān)[35]，而WOSP 中含有較多的Ara，所以表現(xiàn)出較強(qiáng)的Fe3+還原能力，此外也有研究表明，大分子量的多糖不容易結(jié)合活性位點(diǎn)[27]，因此WOSP-N的還原能力較弱。

圖8 WOSP、WOSP-A 和WOSP-N 對(duì)Fe3+的還原能力圖Fig.8 Reduction capacity of polysaccharide from WOSP,WOSP-A and WOSP-N to iron

通過(guò)以上四種抗氧化測(cè)定結(jié)果對(duì)比可知，四種方法下多糖的抗氧化能力均有濃度依賴性。研究結(jié)果與雙參多糖、紫菜多糖、羅漢果多糖、山藥多糖的抗氧化結(jié)果相似[36,37]，均在一定多糖濃度范圍內(nèi)，其抗氧化能力與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。WOSP 的抗氧化活性整體而言要強(qiáng)于WOSP-A、WOSP-N，在這四種方法中，對(duì)DPPH·清除能力和對(duì)O2-·清除能力較好，因?yàn)閃OSP-N 中GalA 含量低，其抗氧化活性不如WOSP，而目前有研究表明其抗氧化能力依賴于氫的供體能力[38]，但具體機(jī)制研究尚未明確。

3 結(jié)論

本文采水提醇沉法從山芹菜中提取WOSP，用DEAE 離子交換柱層析法對(duì)WOSP 分離純化得到WOSP-A 及WOSP-N，得率分別為51.34%和2.55%，通過(guò)HPGPC 法測(cè)定兩個(gè)級(jí)分的分子量主要分布在14.21 ku 左右和169.36 ku 左右。結(jié)合紅外、單糖及酶解分析結(jié)果說(shuō)明，三種多糖均含有多糖的特征吸收峰，WOSP 和WOSP-A 中GalA、Gal 和Ara 的含量較高，WOSP-A 中GalA 所占比例達(dá)到46.99%，WOSP-N 中Gal 和Ara 的含量較高，GalA（4.43%）含量較低，與WOSP-A 結(jié)果存在差異。推測(cè)WOSP-A 是以GalA、Gal 和Ara 為主的HG 型和AG-I 型果膠結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，WOSP-N 是以Gal 和Ara 為主的AG-II 果膠結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。以Vc 為陽(yáng)性對(duì)照，比較三種多糖組分對(duì)DPPH·、、·OH 的清除能力及對(duì)Fe3+的還原能力，WOSP的抗氧化活性強(qiáng)于WOSP-A 和WOSP-N，四種方法中對(duì)DPPH·清除能力和對(duì)O2-·清除能力較好，在WOSP濃度為10 mg/mL 時(shí)，清除率分別達(dá)到96.42%和86.69%，推測(cè)可能是由于WOSP 包含WOSP-A 和WOSP-N，它們之間存在協(xié)同作用，另外產(chǎn)生這種差異也可能與多糖的糖苷鍵類(lèi)型等因素有關(guān)[39]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本文結(jié)果為山芹菜的深度開(kāi)發(fā)利用提供了理論研究基礎(chǔ)，為東北地區(qū)山野菜的精深加工提供新策略。