宋萌萌，劉媛*，王健*，宋鵬飛，李云龍

（1.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點實驗室，河北張家口 075000）（2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西太原 030031）

蕎麥，蓼科（Polygonaceae）為蓼科蕎麥屬的雙子葉植物[1]，常見的栽培品種有甜蕎（Fagopyrum esculentumMounch）和苦蕎（Fagopyrum tataricum(L.)Gaench），即普通蕎麥和韃靼蕎麥。蕎麥富含蛋白質(zhì)、維生素、必需氨基酸及黃酮類化合物，是一種具有較高營養(yǎng)價值的作物[2,3]。我國蕎麥種質(zhì)資源豐富，年產(chǎn)量世界排名第二[4]。從營養(yǎng)學(xué)的角度上說，任何谷物能否作為人類食物主要取決于其蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量[5]。蕎麥蛋白是一種天然活性成分，其賴氨酸含量較高，在降血糖、降血脂、提高人體免疫力方面發(fā)揮著重要作用[6-8]。蛋白質(zhì)是甜蕎的重要營養(yǎng)組分，約占甜蕎籽粒含量的15%，高于普通禾谷類作物，且具有良好的氨基酸平衡模式和很高的生物學(xué)價值[9]。Han 等[10]對蕎麥、小麥等9 種谷物的蛋白質(zhì)及必需氨基酸進行了評分，發(fā)現(xiàn)蕎麥評分最高，因此認(rèn)為它是谷物中最好的蛋白質(zhì)來源。蕎麥因其無麩質(zhì)、具有多種生物活性以及預(yù)防各種慢性疾病的健康益處，成為一種受歡迎的功能性食品[11]。

近些年來，我國對蕎麥的研究集中在蕎麥營養(yǎng)物質(zhì)及蕎麥新產(chǎn)品的開發(fā)，例如蕎麥饅頭[12]、蕎麥發(fā)酵酒[13]、蕎麥蜜[14]、蕎麥小吃[15]等。研究表明，加工方式對谷物蛋白結(jié)構(gòu)和功能有顯著影響，蛋白的特性很大程度影響食品的工藝、營養(yǎng)與感官[16-18]。米宏偉等[19]研究不同加工工藝對蕎麥蛋白熱性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)溫度的高低會對蕎麥蛋白產(chǎn)生影響；隋秀芳等[20]研究炒、蒸煮與重組造粒加工工藝對苦蕎茶香氣和營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果表明，蒸煮工藝中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6.49%增加至27.51%，炒制工藝中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由26.80%降低至21.94%；馬藝超等[21]以苦蕎全粉、苦蕎芯粉、苦蕎麩皮粉為原料蒸制饅頭，結(jié)果表明，苦蕎饅頭（全、芯、皮）中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降了3.51%、2.94%、6.22%。

目前，蕎麥加工基礎(chǔ)理論相對薄弱，蕎麥蛋白的營養(yǎng)與氨基酸沒有得到充分的開發(fā)與利用，且關(guān)于不同熟化方式處理蕎麥中蛋白質(zhì)及氨基酸的變化缺乏系統(tǒng)性探討。因此本研究以冀西北主產(chǎn)甜蕎為原料，分別采用蒸制、煮制、炒制三種形式對甜蕎進行加工，分析不同熟化方式對蕎麥蛋白質(zhì)及氨基酸的影響，對熟化前后蕎麥蛋白質(zhì)及氨基酸組成進行對比分析，選擇最好的熟化方式，從而最大限度的保留蕎麥蛋白，進一步提高甜蕎的經(jīng)濟價值，為蕎麥制品開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料

甜蕎麥籽粒，張家口弘基農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司；鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、氯化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、磷酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙醇、石油醚均為分析純，鼎瑞化工有限公司；考馬斯亮藍R-250、丙烯酰胺、過硫酸銨均為電泳純，鼎瑞化工有限公司；透析袋MD44-7，北京微克航科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

DL-5M 冷凍離心機，長沙湘銳離心機有限公司；PHSJ-3F pH 計北京瑞利分析儀器廠；UV-1800B 紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器廠；LGJ-10C 真空冷凍干燥儀，上海第三分析儀器廠；JJG1064-2011 氨基酸分析儀，北京瑞利分析儀器廠；ESB-500X 均質(zhì)乳化機，上海第三分析儀器廠；K1100-全自動凱氏定氮儀，上海第三分析儀器廠；85-2 型磁力攪拌器，北京瑞利分析儀器廠；SF 高速粉碎機，北京瑞利分析儀器廠；60 目標(biāo)準(zhǔn)篩，北京瑞利分析儀器廠；DYCZ-24D垂直電泳槽，北京六一儀器廠；DYY-12C 穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 蕎麥的熟化及蕎麥粉的制備

甜蕎麥經(jīng)除雜、清洗后用于不同處理。

蒸制：準(zhǔn)確稱量50 g 甜蕎麥，將蕎麥放置壓熱溫度為121 ℃，壓熱壓力為0.4 MPa 下60 min。結(jié)束后放置45 ℃烘24 h 后密封備用。

煮制：準(zhǔn)確稱量50 g 甜蕎麥，將甜蕎放置沸水中煮制50 min，料液比為1:10。結(jié)束后濾干多余水分，45 ℃烘48 h 后密封備用。

炒制：準(zhǔn)確稱量50 g 甜蕎麥，將蕎麥放置鍋中來回翻炒，直至蕎麥表皮出現(xiàn)焦黃色，產(chǎn)生蕎麥特殊香氣后炒至結(jié)束。

蕎麥粉的制備：將同等重量的未熟化蕎麥和熟化（蒸制、炒制、煮制）后的蕎麥分別放入高速粉碎機內(nèi)粉碎過60 目篩，密封保存。

1.3.2 堿溶酸沉法提取蕎麥蛋白工藝流程

甜蕎麥籽?！シ邸撝尤胝麴s水使料液比=1:15→調(diào)節(jié)pH 值為10→50 ℃恒溫浸提120 min→離心→取上清液→酸沉→沉淀水洗→冷凍干燥→蕎麥蛋白提取物

1.3.3 熟化前后蕎麥蛋白含量變化的測定

可溶性蛋白含量測定：考馬斯亮藍法[22]。以相應(yīng)試劑為空白，于波長595 nm 處比色，記錄吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：

將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算可溶性蛋白含量。

雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量：

式中：

P——蛋白質(zhì)含量，%；

m0——原料質(zhì)量，g；

m1——原料中蛋白質(zhì)的含量，%；

V——提取液體積，L；

c——提取液中蛋白質(zhì)的濃度，g/L。

1.3.4 熟化前后蕎麥蛋白等電點的測定

準(zhǔn)確稱取熟化前后蕎麥蛋白樣品各1 g，按料液比1:15（m:V）加入蒸餾水，調(diào)pH 值至10.0 左右，55 ℃恒溫水浴加熱140 min，加熱完成后離心，取上清液。取6 等份上清液，每份10 mL，加鹽酸分別調(diào)pH 值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，靜置30 min 后，6 000 r/min離心15 min，取1 mL 稀釋后的上清液測定吸光度。吸光度值最低處即為蛋白質(zhì)沉淀量最大處，此處pH值即為蛋白質(zhì)等電點。

1.3.5 熟化前后蕎蛋白質(zhì)SDS-PAGE 電泳分析

為研究熟化前后蕎麥蛋白分子量的變化，采用蛋白質(zhì)凝膠電泳（SDS-PAGE）分析蕎麥蛋白分子量分布。取2 mL 待測組分蛋白樣品液，然后加入與樣液等體積的蛋白處理液，充分混勻后放置于沸水中加熱2 min，冷卻后備用。將各組分蛋白用微量進樣器進樣20 μL，電泳過程中保持100 V 恒定電壓。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍R-250 染色2 h，脫色2 h 后，拍照記錄分析。

1.3.6 熟化前后蕎麥蛋白氨基酸組成分析及營養(yǎng)評價

1.3.6.1 熟化前后蕎麥蛋白氨基酸組成分析

GB 5009.124-2016 茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀法。

儀器條件：柱2.6 mm×150 cm；樹脂：2169#；柱溫：53 ℃；泵流速：0.226 mL/min；泵壓力：8.8 MPa；汞2 茚三酮流量：0.3 mL/min。

樣品的處理：樣品經(jīng)粉粹后過60 目篩，準(zhǔn)確稱取40～60 mg，放入試管中，加6 mol/L 的HCl 溶液10 mL，抽真空至無汽泡后立即封管。105 ℃水解22 h，冷卻后過濾定容至50 mL 容量瓶中，搖勻后取出1 mL 減壓濃縮直至干燥，用0.02 mol/L 的HCl 溶液稀釋定容到10 mL，上機分析。

1.3.6.2 熟化前后蕎麥中氨基酸營養(yǎng)價值評價

根據(jù)FAO/WHO 推薦的全雞蛋氨基酸模式和必需氨基酸模式（1973），計算蕎麥蛋白氨基酸評分（AAS）和化學(xué)評分（CS）[23]。該方法包括氨基酸比值（Ratio of Amino Acid，RAA），氨基酸比值系數(shù)（Ratio Coeffieient of Amino Acid，RCAA），以此表示食物蛋白質(zhì)的氨基酸組成與模式蛋白氨基酸的接近程度，計算公式如下：

式中：

m2——每克樣品蛋白中某種必需氨基酸的含量，mg；

m3——每克FAO/WHO 評分模式中相應(yīng)必需氨基酸的含量，mg；

m4——每克雞蛋評分模式中對應(yīng)必需氨基酸的含量，mg；

Ai——測定樣品中某必需氨基酸的含量，mg/g；

Aa——Ai與模式蛋白質(zhì)中對應(yīng)必需氨基酸的含量，mg/g；

RAAi——測定樣品的氨基酸比值；

RCAAi——測定樣品的氨基酸比值系數(shù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析及處理

試驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用SPSS 22.0 軟件進行處理，每組數(shù)據(jù)均重復(fù)處理3 次。采用Excel 2010 軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 熟化前后蕎麥蛋白含量的變化

熟化前后蕎麥蛋白含量的變化如圖1 所示，通過考馬斯亮藍法測得未熟化的蕎麥蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.30%，蒸制后蕎麥蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.50%，炒制后蕎麥蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.70%，煮制后蕎麥蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為14.80%。蒸制與炒制后，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，煮制后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升。

圖1 熟化前后蕎麥蛋白的含量Fig.1 Protein content of buckwheat before and after maturation

2.2 熟化前后蕎麥蛋白等電點的研究

蛋白質(zhì)分子帶有不同離解常數(shù)、不同pH 值和不同總電荷數(shù)的帶電基團，當(dāng)pH 值為某一特定值，即蛋白質(zhì)所帶電荷的總和為零，此時蛋白在電場中不再移動，該pH 值即為該蛋白質(zhì)等電點[24]。熟化前后蕎麥蛋白的等電點測定結(jié)果如圖2 所示，pH 值4 時未熟化蕎麥蛋白吸光度值最小，這時蕎麥蛋白質(zhì)分子顆粒之間凈電荷數(shù)為零，溶液中的相同的電荷不會被蛋白質(zhì)分子所排斥，分子之間極易發(fā)生碰撞、產(chǎn)生沉淀。因此pH 值4 是未熟化蕎麥蛋白的等電點，煮制后的蕎麥蛋白等電點在pH 值3.5 左右、蒸制后在pH 值4左右、炒制后pH 值4.5 在左右。

圖2 熟化前后蕎麥蛋白等電點Fig.2 Isoelectric point of buckwheat protein before and after processing

2.3 熟化前后蕎蛋麥蛋白的電泳分析

SDS-PAGE 常用于反映蛋白質(zhì)的分子量（Mw）和組成。蕎麥?zhǔn)旎昂褪旎螅ㄕ簟⒊?、煮）粗蛋白的SDS-PAGE 分析結(jié)果見圖3。熟化后的蕎麥蛋白大都缺乏高分子量蛋白質(zhì)組分，蛋白質(zhì)電泳條帶主要集中在低分子量和中分子量區(qū)域[25]，這與李志西等[26]的研究結(jié)果相一致。未熟化蕎麥蛋白條帶主要分布于15～25 ku，有清晰條帶，少量條帶分布于50 ku 附近，蒸制與煮制后蕎麥蛋白在15～25 ku 之間的大部分條帶消失，炒制后蕎麥蛋白在15～25 ku 之間的條帶消失的較少，50 ku 附近蛋白條帶消失。

圖3 熟化前后甜蕎粗蛋白的 SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE map of common buckwheat component protein

2.4 熟化前后蕎麥中氨基酸含量變化分析

本研究測定了熟化前后蕎麥蛋白中16 種氨基酸，其中有7 種必需氨基酸，9 種非必需氨基酸，其組成及含量見表1，不同熟化方式的氨基酸總量差異不大，炒制與蒸制后氨基酸總量最高，分別達到10.30 和10.00 g/100 g，煮制后最低，達到9.43 g/100 g。從平均數(shù)可以得出，蕎麥蛋白的16 種氨基酸中，Glu 和Asp 含量最高，分別為1.80 和1.05 g/100 g，Met 和Tyr 含量最低，分別為0.09 和0.19 g/100 g。

表1 熟化前后蕎麥中氨基酸含量(g/100 g)Table 1 Amino acid content in buckwheat before and after maturation (g/100 g)

本研究中，3 種熟化方式中均含有Thr、Val、Met、Lle、Leu、Phe 與Lys 等7 種必需氨基酸，蒸制、炒制后除Tyr 外，剩余氨基酸含量均升高；煮制后，Thr、Ser、Gly、Ala 及Lle 含量均沒有發(fā)生變化，Val、Met、Tyr、Lys、His、及Arg 含量均降低，可能是由于煮制過程中對這些氨基酸均存在不同程度的破壞。

2.5 熟化前后蕎麥中氨基酸營養(yǎng)價值評價

RAA 表示食品中某必需氨基酸含量與標(biāo)準(zhǔn)模式蛋白的比值。RCAA 表示樣品中必需氨基酸組成含量比例與標(biāo)準(zhǔn)模式蛋白的一致程度，RCAA＞1 則表示該必需氨基酸含量相對過剩，RCAA＜1 則表示該必需氨基酸含量相對不足，RCAA 最小的必需氨基酸為該食品的第一限制性氨基酸[27]。由表2～5 可知，熟化前后蕎麥中第一限制性氨基酸是Met，且除Met 外，其余蕎麥蛋白氨基酸含量均高于雞蛋蛋白；未熟化、蒸制及炒制后蕎麥蛋白中 Lys 的含量均超過WHO/FAO 模式，炒制后Lle、Leu、Phe+Tyr、Val、Thr 含量也均超過WHO/FAO 模式；蒸制后Val 含量接近WHO/FAO 模式。

表2 未熟化蕎麥蛋白的氨基酸評分(g/100 g)Table 2 Amino acid score of unprocessed buckwheat protein (g/100 g)

表3 煮制蕎麥蛋白的氨基酸評分(g/100 g)Table 3 Amino acid score of buckwheat protein after boiling (g/100 g)

表4 蒸制蕎麥蛋白的氨基酸評分(g/100 g)Table 4 Amino acid score of steaming buckwheat protein (g/100 g)

表5 炒制蕎麥蛋白的氨基酸評分(g/100 g)Table 5 Amino acid score of fried buckwheat protein (g/100 g)

3 討論

與未熟化蕎麥蛋白相比，煮制后蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加2.50%，可能是由于煮制過程中蕎麥蛋白在溫?zé)峄蛎傅淖饔孟陆到獬啥嚯摹⒐央幕虬被岬瓤扇苄猿煞?，?dǎo)致水溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加[28]。蒸制與炒制后蕎麥蛋白的含量減少，炒制后蕎麥蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少2.6%，可能是由于炒制過程中溫度較高，破壞蕎麥蛋白的結(jié)構(gòu)，蛋白發(fā)生變性，含量降低；也可能是由于高溫導(dǎo)致氨基酸與還原糖發(fā)生反應(yīng)，生成揮發(fā)性物質(zhì)[29]。王麗娟[30]測定了9 個蕎麥品種的氨基酸含量，結(jié)果表明谷氨酸含量最高，這與本研究的結(jié)果一致。從電泳圖譜上可以看出炒制后的蕎麥蛋白在50 ku 附近蛋白條帶消失，這可能與蕎麥蛋白擁有兩個變性溫度有關(guān)，分別在80 ℃和105 ℃附近，對應(yīng)著8S 和13S球蛋白的變性，蛋白質(zhì)破壞、分解產(chǎn)生的其它亞結(jié)構(gòu)；蒸制和煮制時存在水分，導(dǎo)致蛋白的流失而炒制時溫度較高，遠高于105 ℃，蕎麥蛋白變性程度較高，熱處理可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集或裂解，由于受熱，長鏈蛋白斷裂成短鏈和小肽，電泳過程中小肽長度超出了凝膠的檢測范圍，因而圖中蛋白質(zhì)條帶減少[31]；也可能是因為蕎麥蛋白中的部分亞基含有二硫鍵，炒制條件下，溫度較高導(dǎo)致二硫鍵斷裂[32]。

4 結(jié)論

不同熟化方式下蕎麥中蛋白質(zhì)含量均發(fā)生了變化，煮制條件下，蛋白質(zhì)得以很好的保留。根據(jù)蛋白質(zhì)的需求情況可以選擇最適的熟化方式。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明熟化后蕎麥中小分子蛋白亞基條帶顏色均隨熱處理時間的增加而逐漸變深，即小分子蛋白含量均增加，且與蒸制、煮制不同，炒制后蕎麥蛋白在15～25 ku 之間的條帶消失的較少，50 ku 附近蛋白條帶消失。不同熟化方式后氨基酸總量差異不大，3種熟化方式中均含有人體必需7 種氨基酸，炒制氨基酸總量最高，煮制后最低；除Met 外，其余蕎麥蛋白氨基酸含量均高于雞蛋蛋白；炒制后，7 種必需氨基酸含量相對不足，Met 為蕎麥的第一限制性氨基酸。這一結(jié)果為探究不同熟化過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化與消化性之間的關(guān)系提供一定的理論依據(jù)，蕎麥?zhǔn)且环N極其重要的營養(yǎng)保健食品具有十分廣泛的開發(fā)利用前景。