李雨霖，倪婕，薛璐瑜，楊冬梅，余煉*，劉小玲

（1.廣西大學輕工與食品學院，廣西南寧 530004）（2.桂林師范高等?？茖W校，廣西桂林 541199）

對蝦養(yǎng)殖業(yè)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的代表性產(chǎn)業(yè)之一，2019 年產(chǎn)量為487.141 t[1]，養(yǎng)殖總產(chǎn)量可占全球?qū)ξr養(yǎng)殖總產(chǎn)量的26%[2]。目前以無外骨骼冷凍形式生產(chǎn)的產(chǎn)品需求量逐漸增加，而在該加工過程中大約會有40%～50%的蝦頭、蝦尾、蝦殼等產(chǎn)生[3]，其中蝦頭含有較為豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、甲殼素等多種營養(yǎng)成分。這些副產(chǎn)物通常被丟棄導致資源浪費，少部分進行了工業(yè)處理，如從副產(chǎn)物中提取甲殼素，但所使用的化學試劑易造成環(huán)境污染且生產(chǎn)過程流失了大量蛋白質(zhì)資源。綜上，有必要對蝦頭中蛋白質(zhì)的提取降解技術(shù)進行研究。

現(xiàn)有研究表明可以通過發(fā)酵、酶解、超臨界二氧化碳萃取[4]等方式對蝦頭中的蛋白質(zhì)進行回收利用[5]。微生物可以在生長繁殖過程中分泌大量的蛋白酶及各種內(nèi)肽酶從而降解蛋白質(zhì)，生成易被動植物消化吸收的多肽和游離氨基酸，且微生物發(fā)酵后多肽和游離氨基酸的產(chǎn)量可能高于酶水解[6]。用其制作氨基酸液體肥料，可提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。梁田[7]、王爽[8]的研究表明蛋白在降解中伴隨脫氨基的過程，部分轉(zhuǎn)化為氨氣從發(fā)酵培養(yǎng)基中釋放出來，產(chǎn)生大量不愉快氣體，既造成了原料中氮元素的浪費[8]，也是發(fā)酵過程中惡臭形成的原因之一。這一問題在一定程度上限制了微生物發(fā)酵方式的進一步應用，而目前對于該問題解決的相關(guān)報道較少。

目前，芽孢桿菌[9]、酵母菌[10]等微生物被證實具有一定降解氨態(tài)氮的能力，在降低水體氨態(tài)氮含量方面有良好的前景[11]。解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens是芽孢桿菌屬，其可從土壤、植物、畜禽和水生動物的腸道中被分離培養(yǎng)，營養(yǎng)來源廣泛、環(huán)境適應能力強、非致病性，常用于谷物和豆類、酒的發(fā)酵劑、加工或農(nóng)業(yè)方面的抗菌劑等[12]，在益生菌添加劑等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。本團隊從北海紅樹林中分離了一株B.amyloliquefaciensYA289，前期實驗表明其蛋白酶活性較強，具有良好降解蝦頭蛋白質(zhì)的能力，且發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨態(tài)氮含量較低，氨臭味不明顯。因此本文以氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮含量為指標，采用B.amyloliquefaciensYA289 對蝦頭蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，為促進蝦頭副產(chǎn)物資源的再利用提供一定理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蝦頭：南美白對蝦蝦頭由廣西北海正午有限公司提供。

菌株：本研究所使用菌株YA289 由本團隊分離自廣西北海紅樹林生長區(qū)，經(jīng)16S rRNA測序鑒定YA289與Bacillus amyloliquefaciensDSM 7 具有99.86%的同源性，初步鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

ISP2固體培養(yǎng)基（g/L）：麥芽粉2，酵母粉2，葡萄糖2，瓊脂15。

LB 液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取清洗并瀝干水的蝦頭與水1:8（m/V）勻漿，在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.1.3 試劑

氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、硫酸銅、苯酚，成都金山化學試劑有限公司；尿素、乳糖、果糖、牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；蔗糖、葡萄糖、淀粉、酒石酸鉀鈉、硫酸銨、乙酰丙酮、亞硝基鐵氰化鈉、結(jié)晶乙酸鈉，天津市大茂化學試劑廠；檸檬酸三鈉、次氯酸鈉、冰乙酸、甲醛，成都市科隆化學品有限公司；瓊脂、麥芽粉、酵母粉，德國BioFrox 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS-600L 電子天平，北京賽多科利斯天平有限公司；SUNRISE 酶標儀，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；DGH-9140A 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺，蘇州蘇凈安泰公司；GI80TW 高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；LRH-70 生化培養(yǎng)箱，上海一恒儀器有限公司；ZWY-2102C 振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；CR21N 高速冷凍離心機，日立公司；PHS-3BW pH 計，上海般特儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化與菌懸液的制備

將B.amyloliquefaciensYA289 接種于ISP2培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。挑取1環(huán)活化好的菌體接種于裝有100 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在200 r/min、37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h，取菌液離心（4 000 r/min，10 min）收集沉淀，并于0.9wt%的無菌生理鹽水中重懸，并調(diào)整其OD600nm在0.7 左右。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

1.3.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

以接種量5wt%、初始pH 值8、發(fā)酵溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時間48 h 為基礎(chǔ)發(fā)酵條件，對基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中幾種重要成分及其濃度進行篩選優(yōu)化。設(shè)置不同碳源成分（淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖，添加質(zhì)量濃度均為5 g/L）、不同葡萄糖質(zhì)量濃度（0、5、10、15、20 g/L）、不同氮源成分（硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、尿素，添加質(zhì)量濃度均為5 g/L）、不同氯化鈉質(zhì)量濃度（0、5、10、15、20 g/L），每組設(shè)3 個平行，待發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液離心（10 000 r/min，5 min），測定發(fā)酵上清液中氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度，結(jié)果取平均值（下同）。

1.3.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

以發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗結(jié)果（即在基礎(chǔ)蝦頭發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5 g/L 葡萄糖及5 g/L NaCl）作為發(fā)酵條件優(yōu)化的培養(yǎng)基。設(shè)置不同接種量（1wt%、3wt%、5wt%、7wt%、9wt%），不同發(fā)酵初始pH 值（2、4、6、8、10），不同料液比[1:2、1:4、1:6、1:8、1:10（g/100 mL）]，不同發(fā)酵時間（24、48、72、96、120 h），不同發(fā)酵溫度（28、31、34、37、40 ℃），不同發(fā)酵轉(zhuǎn)速（140、160、180、200、220 r/min），根據(jù)發(fā)酵上清液中氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度確定最佳發(fā)酵條件。

1.3.3 Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計

在發(fā)酵條件單因素實驗的基礎(chǔ)上，分別選取接種量、pH 值、料液比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵轉(zhuǎn)速這6 個因素的高（1）和低（-1）兩個水平進行試驗設(shè)計，篩選出對發(fā)酵上清液中多肽質(zhì)量濃度顯著影響的因素。試驗因素及水平編碼如表1 所示。

1.3.4 最陡爬坡試驗設(shè)計

選擇PB 試驗篩選得到的4 個顯著因子，以多肽質(zhì)量濃度為響應值進行最陡爬坡試驗，參考各顯著因子的正負效應值確定試驗的方向和步長。以最大響應值對應的工藝參數(shù)為Box-Behnken 試驗設(shè)計的中心點，試驗設(shè)計如表3 所示。

1.3.5 Box-Behnken 試驗設(shè)計

在PB 試驗和最陡爬坡試驗確定的4 因素3 水平的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 12 軟件進行Box-Behnken試驗的設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，試驗因素與水平見表4。其他影響因素的條件為接種量5%，轉(zhuǎn)速180 r/min。

1.3.6 氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的測定

參照GB 5009.235-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》，采用比色法測定發(fā)酵上清液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度。

1.3.7 多肽質(zhì)量濃度的測定

參考李偉民[13]的方法，取1 mL發(fā)酵上清液以1:1（V/V）的比例與10%三氯乙酸混勻，靜置10 min，5 000 r/min 離心15 min，取1 mL 上清液和4 mL 雙縮脲試劑，混勻，室溫下靜置30 min，在540 nm 測定吸光值，以蒸餾水作空白。

1.3.8 氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的測定

參考梁劍光[14]的方法，取發(fā)酵上清液稀釋適當倍數(shù)后加顯色劑混勻，置于37 ℃孵育20 min 顯色，待反應結(jié)束后冷卻至室溫，在637 nm 測定其吸光值，以蒸餾水作空白。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)分析采用 Minitab 17、IBM SPSS Statistics 26 和Origin 2021，結(jié)果均以平均值±標準差的形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1.1 碳源的優(yōu)化

碳源不僅能提供微生物生長所需的能量，還可以提供菌體合成目的產(chǎn)物所需的原料，減少對氨基酸的消耗[15]。由圖1 可知，以無外加碳源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組，分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖后，發(fā)酵上清液的氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度都有不同程度的增加，其中以添加葡萄糖或果糖后增幅較明顯，說明對于B.amyloliquefaciensYA289 而言，葡萄糖或果糖優(yōu)先于氨基酸被作為碳源利用，這可能是由于葡萄糖或果糖較有利于促進B.amyloliquefaciensYA289 分泌蛋白酶，并進而分解蝦頭中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生更多的多肽與氨基酸。孫力軍等[16]和Chen 等[17]的研究也表明葡萄糖對解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽的合成有明顯的促進作用。另外，圖1 顯示添加蔗糖和乳糖后與對照組之間無顯著性差異（p＞0.05），而添加淀粉后氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度都相較對照組有所下降；添加果糖、葡萄糖及乳糖時氨態(tài)氮產(chǎn)量較高，而添加蔗糖和淀粉時氨態(tài)氮產(chǎn)量則較低。宋君等[18]的研究也表明在外加蔗糖時Bacillus pumilusBP-171有較好的降解無機氮的效果，與本研究結(jié)果符合。這可能是由于不同碳源的空間結(jié)構(gòu)和分子量不同，使其被利用的難易程度有差異，所以不同碳源下菌株的生長狀況和脫氮能力也不同。因此在培養(yǎng)基中添加葡萄糖以獲得更高的氨基酸和多肽產(chǎn)量，同時相對果糖有更低的氨態(tài)氮損失。

圖1 碳源對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of carbon source on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.1.2 葡萄糖添加量

由圖2 可知，隨著葡萄糖添加量的增加，氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在5 g/L 和10 g/L 時，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度都達到最高且氨態(tài)氮質(zhì)量濃度較低，其中多肽質(zhì)量濃度在5 g/L 時有最大值，這與LEI 等[19]用Bacillus licheniformisSWJS33 發(fā)酵豆粕的研究結(jié)果一致，可能的原因是適當?shù)钠咸烟翘砑恿坑欣谖⑸锷L和產(chǎn)酶，添加過多會加速菌體的呼吸作用，過度消耗培養(yǎng)基中的溶氧，導致其自身生長和產(chǎn)酶受到抑制。因此，選擇5 g/L 的葡萄糖添加量進行后續(xù)試驗。

圖2 葡萄糖添加量對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effects of glucose addition amount on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.1.3 氮源的優(yōu)化

由圖3 可知，以不外加氮源的基礎(chǔ)蝦頭發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組，當外加不同氮源后氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度都有不同程度的增加，這可能是由于碳氮比變化造成的影響[20]。添加尿素和酵母粉后氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度升高，但與對照組無顯著性差異（p＞0.05），而添加其他氮源后氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度均低于對照組。外加硫酸銨發(fā)酵后多肽質(zhì)量濃度最高，其次為尿素，其他外加氮源多肽質(zhì)量濃度反而出現(xiàn)下降。MAO 等[21]以蝦頭作為Bacillus licheniformisOPL-007發(fā)酵唯一氮源的試驗結(jié)果表明該菌株可以直接從蝦頭中獲得氮，滿足自身生長需求和脫蛋白作用。綜上，推測以蝦頭作為氮源已滿足B.amyloliquefaciensYA289 基本的生長和產(chǎn)酶需要，再添加其他氮源還會導致資源浪費，因此培養(yǎng)基中以不外加氮源為適宜。

圖3 氮源對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of Nitrogen source on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.1.4 NaCl 添加量

無機鹽可以調(diào)節(jié)滲透壓，提供微生物生長必須的離子，還可調(diào)節(jié)生理活性作用或作為生理活性物質(zhì)的組成部分[22]，同時無機鹽濃度對產(chǎn)酶的影響也十分關(guān)鍵。由圖4 可知，發(fā)酵上清液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度隨NaCl 濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在NaCl 質(zhì)量濃度為5 g/L 時氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度最高，這說明該B.amyloliquefaciensYA289 具有一定的耐鹽性。而NaCl 添加量對多肽和氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度沒有顯著影響（p＞0.05）。袁艷超[23]的實驗結(jié)果表明B.amyloliquefaciensY1 在添加0.3%的NaCl 時蛋白酶活力最高，且酶活力也呈先上升后下降的趨勢，因此，選擇5 g/L 的NaCl 添加量進行后續(xù)試驗，該濃度下氨基酸態(tài)氮產(chǎn)量較高且氨態(tài)氮質(zhì)量濃度較低。

圖4 NaCl 添加量對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of NaCl addition amount on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.2.1 接種量

接種量的大小影響菌體生理狀態(tài)及發(fā)酵的周期和產(chǎn)物的合成[24]。由圖5 可知，隨著接種量增加，氨態(tài)氮質(zhì)量濃度和多肽質(zhì)量濃度均有增加，但沒有顯著性差異（p＞0.05）；氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度逐漸增加，當接種量上升到5%時氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度最高，接種量繼續(xù)增加后氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度下降，這與宋敏[25]的研究結(jié)果一致，其原因可能是接種量的增加縮短了微生物的延滯期，菌體增多，促使了蛋白酶分泌增加，多肽質(zhì)量濃度和氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度都逐漸升高；而接種量過大菌體大量生長繁殖，可能導致發(fā)酵后期營養(yǎng)不足、某些初級或次級代謝產(chǎn)物累積增多，從而抑制產(chǎn)酶[26,27]，導致氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度下降。因此，選擇5%的接種量進行后續(xù)試驗。

圖5 接種量對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of inoculum on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.2 pH 值

微生物在生長代謝過程中會引起培養(yǎng)環(huán)境pH 值的變化，pH 值過高或過低都會影響其進一步的生長和產(chǎn)物的合成，同時也是影響NH3揮發(fā)的關(guān)鍵因素之一。由圖6 可知，隨著pH 值升高氨基酸態(tài)氮和多肽的質(zhì)量濃度都逐漸增加，在pH 值為6 時有最大值，隨著pH 值繼續(xù)升高，氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度反而下降，與Wang 等[15]有關(guān)枯草芽孢桿菌的水解度趨勢一致。氨態(tài)氮質(zhì)量濃度在中性和堿性環(huán)境下較低，這與王濤[11]和宋君[18]的研究結(jié)果一致，可能是因為細菌在中性和偏堿性環(huán)境下反硝化酶的活性較強[28]，對氨態(tài)氮的降解率更高。雖然pH 值為6 時氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度與pH 值為8 時有顯著差異，但無令人不愉快的氣味，綜合氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度選擇pH 值為6進行下一步試驗。

圖6 pH 對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of pH on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.3 料液比

料液比的大小會影響菌種發(fā)酵蝦頭副產(chǎn)物的效果，如圖7 所示，在一定范圍內(nèi)隨著料液比逐漸增大，即蝦頭濃度逐漸減少，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度沒有顯著性變化（p＞0.05），多肽質(zhì)量濃度先增加后減少，這是因為料液比過大菌種不能完全發(fā)揮作用，可能會進一步分解生成的營養(yǎng)物質(zhì)，導致發(fā)酵效率降低，而料液比過小會導致蝦頭不能被充分分解。在周蓮[29]利用B.amyloliquefaciens3-2 降解羽毛的研究中，一定范圍內(nèi)羽毛含量的增加使羽毛降解率也隨之增加，超過這個范圍后羽毛降解率也逐漸降低。氨態(tài)氮質(zhì)量濃度隨著料液比減小而減少，在1:6、1:8 和1:10（g/100 mL）處均無令人不愉快的氣味，因此綜合氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度選擇料液比1:6（g/100 mL）進行下一步試驗。

圖7 料液比對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.7 Effect of solid-to-liquid ratio on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.4 發(fā)酵時間

發(fā)酵時間影響微生物的生長、蛋白酶的分泌和蛋白質(zhì)的降解及氨基酸的消耗[15]。由圖8 可知，隨著發(fā)酵時間的增加，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度和多肽質(zhì)量濃度都隨之增加，在48 h 時達到最大值，與Moayedi 等[6]和Wang 等[15]的趨勢一致。產(chǎn)物氨基酸的積累是綜合蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的和微生物生長所消耗的動態(tài)變化的結(jié)果。發(fā)酵時間過長使菌體開始衰亡、產(chǎn)酶減少，同時由于后期營養(yǎng)不足，微生物也會利用已生成的多肽等物質(zhì)進行自身的生長繁殖[15]。而發(fā)酵時間對氨態(tài)氮質(zhì)量濃度無顯著影響（p＞0.05），在48 h 處質(zhì)量濃度最低，綜上，選擇48 h 發(fā)酵時間進行下一步試驗。

圖8 發(fā)酵時間對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effect of fermentation time on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.5 發(fā)酵溫度

微生物有自身適宜的生長溫度，因而發(fā)酵溫度能影響其生長和代謝過程。由圖9 可知，當溫度上升時，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度變化無顯著性差異（p＞0.05），多肽質(zhì)量濃度和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度增加。在Wang 等[15]的研究中，枯草芽孢桿菌的水解度也隨著溫度的升高而升高，在35 ℃時達到最大值。綜上，由于34 ℃與37 ℃的氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度沒有顯著差別，但34 ℃時氨態(tài)氮質(zhì)量濃度較低，因此選擇34 ℃的發(fā)酵溫度進行下一步試驗。

圖9 發(fā)酵溫度對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.6 發(fā)酵轉(zhuǎn)速

Lei 等[19]的研究表明，溫度和溶氧可以控制細菌中酶的合成與能量代謝之間的聯(lián)系。由圖10 可知，與Wang 等[30]的研究結(jié)果趨勢保持一致，隨著轉(zhuǎn)速增加氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度先增加后減少，轉(zhuǎn)速為180 r/min時氨基酸態(tài)氮最高。這是由于隨著轉(zhuǎn)速的增大溶氧量增加，利于菌的生長，而轉(zhuǎn)速過高可能會造成菌體機械性損傷而影響生長，甚至改變酶結(jié)構(gòu)[31]。轉(zhuǎn)速的改變對多肽質(zhì)量濃度的影響不顯著，當轉(zhuǎn)速超過180 r/min 后氨態(tài)氮質(zhì)量濃度顯著增加，因此選擇180 r/min 的發(fā)酵轉(zhuǎn)速進行下一步試驗。

圖10 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.10 Effect of fermentation speed on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.2 Plackett-Burman（PB）試驗

對發(fā)酵條件單因素試驗中的6 個因素利用Minitab 軟件進行顯著性分析，試驗結(jié)果如表1 所示。對表1 試驗結(jié)果進行分析可得到回歸模型方程：

表1 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及響應值（n=12）Table 1 Results of Plackett-Burman experimental design

多肽=10.657-3.221A+0.209B+1.197C-0.886D-0.965E-0.953F，R2=95.57%

說明模型擬合良好。由表2 的顯著性分析結(jié)果可知，料液比（A）、pH（C）、溫度（E）、時間（F）對多肽質(zhì)量濃度均有顯著性影響（p＜0.05），其中pH 值具有正效應，料液比、溫度和時間具有負效應，選擇這4 個顯著因子進行下一步最陡爬坡試驗。

表2 Plackett-Burman 實驗結(jié)果顯著性分析Table 2 Significance test of factors for Plackett-Burman test

2.3 最陡爬坡試驗

由表3 試驗結(jié)果可知，隨著料液比、pH 值、溫度、時間條件的變化，多肽質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第3 組取得較好結(jié)果，故以其作為中心點進行下一步Box-Behnken 試驗。

表3 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of steepest climbing

2.4 Box-Behnken 試驗

對表4 的試驗結(jié)果進行二次多項式回歸擬合，可得多肽質(zhì)量濃度（Y）的回歸方程：

表4 Box-Behnken 試驗設(shè)計和結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiment

對回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表5 所示，該模型顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著，模型的R2=0.975 7，校正后R2adj=0.951 5，信噪比=20.980 1＞4，以上表明該模型擬合程度較好，誤差較小，可以較準確的預測響應值的變化。根據(jù)方差分析結(jié)果的p值可知各因素對多肽質(zhì)量濃度影響大小的依次順序為：D＞A＞C＞B，即時間＞料液比＞溫度＞pH 值。

表5 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 5 Analysis results of the regression model

通過Design-Expert 12 軟件得到料液比、pH 值、溫度、時間這4個因子之間的響應曲面圖如圖11所示。曲面圖顏色深淺的變化表示多肽質(zhì)量濃度的變化，變化越快則坡度越陡，即試驗因素對響應值影響更顯著，由圖可知，多肽質(zhì)量濃度分別隨pH 值、料液比、溫度和時間的增加都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在各因素的中心水平有較高值，各因素之間存在明顯的交互作用。綜上所述，根據(jù)建立的模型預測，當4 個影響因子分別在A=1:7.6、B=6.10、C=33.55、D=43.76 時，有最佳響應值（16.11 mg/mL）。為了驗證該模型預測結(jié)果的可靠性，在考慮實際操作的條件設(shè)置后，將預測的試驗條件改為料液比1:8 (g/100 mL)、pH 值6、溫度34 ℃、時間44 h 進行了3 次驗證試驗，測得的多肽質(zhì)量濃度為16.35 mg/mL，與預測值接近，說明該模型準確性良好，優(yōu)化所得的工藝條件參數(shù)可靠。

圖11 各因素交互作用響應曲面圖Fig.11 Response surface diagram of interaction of various factors

3 結(jié)論

利用B.amyloliquefaciensYA289 降解廢棄蝦頭中的蛋白質(zhì)相較于成本較高的酶解法，是一種更為環(huán)保、經(jīng)濟的方法，可作為未來實現(xiàn)對蝦副產(chǎn)物資源化利用的方向進一步研究。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合了Plackett-Burman 試驗和Box-Behnken試驗優(yōu)化了B.amyloliquefaciensYA289 發(fā)酵蝦頭的工藝條件，確定了其最佳的發(fā)酵條件，即在葡萄糖添加量5 g/L，NaCl 添加量5 g/L，料液比1:8（g/100 mL），接種量5%，pH 值6，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度34 ℃，時間44 h的條件下，蝦頭發(fā)酵上清液中多肽的質(zhì)量濃度為16.35 mg/mL，比優(yōu)化前提高了2.7 倍，其發(fā)酵效果優(yōu)于Sun 等[32]用Bacillus subtilisOKF04 發(fā)酵南極磷蝦得到的多肽質(zhì)量濃度（9.5 mg/mL）。因此發(fā)酵需要綜合選取合適的菌株、培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，才能更有效提升發(fā)酵效果。但是本研究存在采用的三角瓶搖床發(fā)酵存在容量小等不足，后續(xù)研究仍需進行放大試驗驗證確定符合實際生產(chǎn)的參數(shù)，同時還可以從現(xiàn)代誘變育種技術(shù)和復合菌株的角度出發(fā)，進一步提高發(fā)酵效果。