胡靜，黃愛蘭，黃順，徐映紅，陳曉嫚，曹鳳紅，楊俊松，鄭志

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院公共基礎(chǔ)學(xué)院，安徽蚌埠 233030）（2.蚌埠市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽蚌埠233099）（3.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230601）

泡菜具有3 000 多年的悠久歷史，享有“川菜之骨”的美稱[1]。四川泡菜作為我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的代表，備受廣大民眾的喜愛。四川泡菜的原料新鮮，是由乳酸菌發(fā)酵制成的鹽漬菜，這種“冷加工”的生產(chǎn)方式能夠保留蔬菜的營(yíng)養(yǎng)，維持膳食營(yíng)養(yǎng)均衡，是一種低熱量的食品。傳統(tǒng)泡菜屬于自然發(fā)酵，乳酸菌主要來自原料本身，一般是大白菜、蘿卜、豇豆和辣椒等。不同原料攜帶的乳酸菌種類不同，因此影響泡菜中微生物的構(gòu)成。乳酸菌不僅賦予食品酸味和香氣，改善食品的口味及品質(zhì)，還具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、改善腸道功能、降低膽固醇、抗高血壓、調(diào)節(jié)免疫功能及抗腫瘤等生物學(xué)作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和干酪乳桿菌在泡菜的成熟過程中起到?jīng)Q定性的作用[3-5]。植物乳桿菌作為乳酸菌中的一員，在自然界中分布廣泛，存在于人類和昆蟲的腸道，乳制品，水果和蔬菜[6,7]，具有較強(qiáng)的糖代謝能力，在泡菜發(fā)酵中后期，隨著氧氣的消耗殆盡，植物乳桿菌開始在發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用，利用反應(yīng)體系中的糖類代謝產(chǎn)生大量的酸，從而加速泡菜的成熟過程[8]。此外，植物乳桿菌降膽固醇的效果顯著，如Lactobacillus plantarumNCU116 可將高脂喂養(yǎng)小鼠的膽固醇水平明顯降低[9,10]。植物乳桿菌可以調(diào)節(jié)腸道疾病，因其能夠分泌抑制病原菌生長(zhǎng)的抗菌肽、有機(jī)酸和細(xì)菌素等物質(zhì)；也能夠分泌胞外多糖起到抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[11-13]。植物乳桿菌，作為一種益生菌，被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中，如酸奶、豆乳、干酪及飲料等。植物乳桿菌可以賦予產(chǎn)品良好的風(fēng)味、質(zhì)地，及保健功能。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人民生活質(zhì)量的提高，人們更青睞于健康養(yǎng)生的生活理念。由于益生菌有益健康，近年來我國(guó)對(duì)益生菌產(chǎn)品的需求猛增，益生菌產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)井噴式發(fā)展，益生菌市場(chǎng)發(fā)展前景巨大。植物乳桿菌在發(fā)酵乳中，最成功的應(yīng)用當(dāng)屬光明專利菌株-“植物乳桿菌ST-III”，光明“暢優(yōu)”和“植物活力”乳酸菌飲料中都添加了該菌株，成為“通暢型酸奶的第一品牌”。此外，“植益”采用植物乳桿菌LP28 發(fā)酵，2015年在乳酸菌企業(yè)中脫穎而出。因此，篩選具有良好益生功能的乳酸菌具有很重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡菜來自四川的成都、達(dá)州、眉州，傳統(tǒng)自然發(fā)酵制作；MRS 瓊脂和MRS 肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、Taq PCR Mix、溶菌酶溶液、GeneGreen 核酸染料，北京天根生化科技（北京）有限公司；DL10000 DNA Marker，Takara；VITRK 2棒狀桿菌鑒定卡（CBC），上海嘉合生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

振蕩培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱，江蘇科析；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊；PCR 儀，德國(guó)Eppendorf；DNA 電泳槽，北京六一儀器；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化；VITEK 2 Compact 儀器，法國(guó)梅里埃；凝膠成像系統(tǒng)，伯樂公司（Bio-Rad）；生物顯微鏡，日本奧林巴斯。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳桿菌的分離純化

分離純化流程見下：

泡菜汁液1 mL+19 mL 的無菌生理鹽水→置于振蕩培養(yǎng)箱中，室溫下200 r/min 培養(yǎng)過夜→取樣液1 mL，用無菌的生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋→取稀釋了102、103、104的樣液100 μL 涂布平板→37 ℃倒置培養(yǎng)48 h

菌株經(jīng)過多次劃線，以獲得純菌株。選取白色、圓形、表面光滑凸起的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色。

1.3.2 生理生化反應(yīng)鑒定

使用VITEK 2 棒狀桿菌鑒定卡（CBC）進(jìn)行測(cè)定。CBC 卡是基于已經(jīng)確定的生化方法和新開發(fā)的底物，用來檢測(cè)碳源利用和酶類活性。共有41 種生化反應(yīng)，具體內(nèi)容見表1，獲得最終鑒定結(jié)果大約需要8 h。具體操作方法為：向透明的塑料試管（聚苯乙烯材質(zhì)，12 mm×75 mm）加入3.0 mL 無菌鹽水（w=0.45%～0.5%的NaCl 溶液，pH 值為4.5～7.0）。用無菌接種環(huán)刮取適量的菌落加到試管中，為了菌體更好的分散于鹽水中，可將菌體在管壁上充分研磨制備菌懸液。VITEK 2 DensiCHEK 儀器先經(jīng)過校準(zhǔn)，然后檢測(cè)菌液濃度，檢測(cè)濃度為McFarland No.2.7～3.30。然后將CBC 卡放入試管中，置于卡架中以備檢測(cè)。注意，CBC 卡片放入前，菌懸液配制時(shí)間不能超過30 min。

表1 CBC 反應(yīng)孔內(nèi)容物Table 1 The contents of CBC reaction pore

1.3.3 16S rRNA 序列擴(kuò)增、鑒定

挑一單菌落至MRS 肉湯過夜培養(yǎng)（37 ℃，14～16 h）。取2 mL 菌液離心，去上清，用菌體提取基因組。擴(kuò)增保守基因16S rRNA。使用引物序列為27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’ ）和 1495R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’），目的片段長(zhǎng)度約1 500 bp。PCR 反應(yīng)體系為見表2。

表2 PCR 反應(yīng)體系Table 2 Amplification system of PCR

PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后，送華大基因測(cè)序。

1.3.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

測(cè)得的序列先在 NCBI 上進(jìn)行 Nucleotide BLAST，以＞99%為界線，判斷是否是植物乳桿菌。從NCBI 網(wǎng)站上下載已有的植物乳桿菌序列及其他乳酸菌模式菌株序列，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

從5份泡菜樣本中分離獲得40個(gè)菌株，選取圓形、乳白色、表面光滑凸起、邊緣整齊、不透明的菌落。多次劃線獲得純菌株。經(jīng)革蘭氏染色后均為紫色，呈桿狀或棒狀。（見圖1）。

圖1 14 號(hào)菌株菌落形態(tài)及其菌體鏡檢結(jié)果（1000×）Fig.1 The colony morphology of No.14 strain and its micrograph after Gram staining (1000×)

2.2 生理生化反應(yīng)結(jié)果

使用CBC 鑒定卡鑒定了20 個(gè)菌株，其中可能性概率在96%～99%的，置信水平為“極好”，總共有7個(gè)株菌，其中6 個(gè)菌株（1 號(hào)、2 號(hào)、5 號(hào)、15 號(hào)、17 號(hào)、20 號(hào)）鑒定為植物乳桿菌（29 號(hào)為杰氏棒桿菌）；可能性概率在93%～95%的，置信水平為“非常好”，有2 個(gè)菌株，即6 號(hào)和14 號(hào)菌株；可能性概率在89%～92%的，置信水平為“好”，有2 個(gè)菌株，即4 號(hào)和38 號(hào)菌株；可能性概率在85%～88%的，置信水平為“可接受”，有2 個(gè)菌株，即7 號(hào)和23 號(hào)菌株?？傮w來說，20 個(gè)CBC 反應(yīng)卡的結(jié)果中有12 個(gè)菌株的反應(yīng)結(jié)果可以鑒定為植物乳桿菌（見表3）。CBC 鑒定卡在鑒定植物乳桿菌方面的研究較少，傳統(tǒng)的乳酸菌的生化鑒定方法多是鑒定一些糖及醇的反應(yīng)，另外還需做明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)等多個(gè)試驗(yàn)，但是只能鑒定到“屬”，很難確定到“種”[14,15]。而CBC 鑒定卡可以直接鑒定到“種”，缺點(diǎn)是價(jià)格貴，必須依賴于VITEK 2 Compact 儀器操作，但是操作方法簡(jiǎn)單。另外API 50 CHL 主要用于鑒定乳桿菌，而且不需要依賴于儀器，可以手工操作，涉及50 個(gè)生化反應(yīng)，記錄反應(yīng)結(jié)果即可查詢被鑒定細(xì)菌的種名，但是價(jià)格更昂貴，而且貨期很長(zhǎng)，不易購(gòu)買。雖然CBC卡主要是鑒定棒狀桿菌，但是也可以鑒定植物乳桿菌，因此，綜合考慮選用CBC 鑒定卡篩選植物乳桿菌。

表3 CBC 卡生化反應(yīng)鑒定結(jié)果Table 3 The identification results from CBC card biochemical reactions

2.3 16S rRNA 序列擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增出目的片段。將PCR 擴(kuò)增成功的產(chǎn)物送到華大基因測(cè)序，進(jìn)行雙向測(cè)通。拼接后的序列，在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行Nucleotide BLAST 同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所有的菌株都屬于乳桿菌屬，同源性達(dá)到100%。但是不限于植物乳桿菌，有的顯示是戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）或其他乳桿菌（Lactobacillussp）。因此，還需構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步確認(rèn)。

圖2 各菌株16S rRNA 基因瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis pictures of 16S rRNA gene of each strain

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的軟件不斷推陳出新，大體上如下幾種選擇策略，有簡(jiǎn)單的UPGMA 法、鄰接法（Neighbour-joining，NJ）、最大簡(jiǎn)約法、最大似然法以及貝葉斯法，每種方法都有不少可選擇的工具。由于擴(kuò)增的16S rRNA 序列較短，本研究選用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

由圖3 中的NJ 樹可知，所有的序列聚為三簇，經(jīng)CBC 卡初步鑒定為植物乳桿菌的12 個(gè)菌株序列，與已知的植物乳桿菌的序列聚為一簇（Cluster 1）；其中6 號(hào)菌株與L.plantarum3356 聚為一支，親緣關(guān)系更近，其次是20 號(hào)菌株；由于Bootstrap 的值＞70%，構(gòu)建的進(jìn)化樹才可靠，因此17 號(hào)菌株與L.plantarumJCM1149 雖然聚為一支，但結(jié)果不可靠；4、5、14、15、23 和38 號(hào)菌株與L.plantarumNCU116、L.plantarumMBEL2169、L.plantarumAN7 等序列相似性極高，無遺傳距離；Cluster 1 的所有菌株與消化乳桿菌（L.alimentariusDCM20249）親緣關(guān)系近。此進(jìn)化樹以乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）作為異源參照菌株。

圖3 泡菜樣品中分離的代表菌株和模式菌株基于16S rRAN 的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ 法）Fig.3 The phylogenetic tree based on 16S rRAN of representative strains isolated from pickle samples and type strains (NJ method)

鑒于本實(shí)驗(yàn)主要篩選的是植物乳桿菌，因此只選用了MRS 瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，而CBC 卡不能鑒定乳球菌和明串珠菌，所以沒有篩選到泡菜中常有的乳球菌和明串珠菌等菌株。本研究中分離到的乳酸菌中80%是植物乳桿菌，是四川泡菜中的優(yōu)勢(shì)菌種，這與前人的研究結(jié)果一致[16-18]。短乳桿菌（LB.brevis）在泡菜中也常見，由于CBC 鑒定卡不能鑒定LB.brevis，因此在初篩過程中也被淘汰。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)泡菜樣品中乳酸菌種類繁多，本研究從四份泡菜樣本中共挑選40 個(gè)菌株，經(jīng)革蘭氏染色和菌落形態(tài)觀察后，挑選了20 個(gè)菌株，使用VITEK 2 棒狀桿菌鑒定卡（CBC）進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定，其中有12 個(gè)菌株初步鑒定為植物乳桿菌（可能性≥85%）。這些菌株經(jīng)16S rRNA 基因測(cè)序、Nucleotide BLAST 比對(duì)，均為植物乳桿菌。然后，利用已知植物乳桿菌序列和泡菜中檢出的一些模式菌株序列使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，12 個(gè)菌株序列與已知的植物乳桿菌序列聚為一簇，甚至有的序列高度相似，無遺傳距離。綜合所有的鑒定結(jié)果，我們認(rèn)為篩選的12 個(gè)菌株均為植物乳桿菌。CBC 鑒定卡是初篩植物乳桿菌較好的方法。