陳家倫,黃桂霞,甘聃
(仙樂健康科技股份有限公司,廣東汕頭 515041)
隨著生活水平的提高,人們的飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生很大變化,便秘的發(fā)病率也因此呈現(xiàn)逐年上升趨勢,引起越來越多的關(guān)注[1]。慢傳輸型便秘(Slow transit constipation,STC)作為一種多因素特發(fā)疾病,發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,嚴(yán)重便秘癥狀會引發(fā)皮膚痤瘡、內(nèi)分泌失調(diào)、腹脹甚至導(dǎo)致心肌梗塞和猝死。長時間服用溶劑性、刺激性瀉藥會帶來嚴(yán)重副作用,導(dǎo)致腸道粘膜、腸神經(jīng)和腸道菌群平衡遭受損害[2],引發(fā)后續(xù)性便秘。通過使用微生物制劑來改善腸道微生態(tài),提升胃腸道功能,來達(dá)到緩解便秘的方法逐漸開始流行。在針對慢傳輸型便秘腸道轉(zhuǎn)運時間緩慢的研究中,發(fā)現(xiàn)動物雙歧桿菌DN173010(每天攝入3.7×1010CFU)[3]和干酪乳桿菌shirota(每天攝入6.5×109CFU)[4]均能夠縮短腸轉(zhuǎn)運時間。多菌株制劑在市場應(yīng)用更多,人群適用性更廣,常見多菌制劑的研究如二聯(lián)菌(動物雙歧桿菌BB-12+嗜酸乳桿菌La-5)[5]、三聯(lián)菌(短雙歧桿菌+嗜酸乳桿菌+兩歧雙歧桿菌)[6]均能改善便秘癥狀,而益生菌的功效與菌株特異性關(guān)聯(lián)緊密,復(fù)合乳桿菌(鼠李糖乳桿菌LrGG-100+長雙岐桿菌BL-11+嗜酸乳桿菌LA-99+干酪乳桿菌LC-88)中所有菌株均未曾報道過與緩解便秘功效相關(guān)的研究,因此本文中選用該復(fù)合菌研究緩解便秘方向功能具有一定創(chuàng)新性。
在研究中發(fā)現(xiàn),STC 的發(fā)病機(jī)制與腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric Nervous System,ENS)的改變密切相關(guān),位于腸道內(nèi)壁的神經(jīng)系統(tǒng),獨立于中樞神經(jīng)系統(tǒng),調(diào)節(jié)胃腸道的運動、分泌、新陳代謝等功能[7]。Cajal 間質(zhì)細(xì)胞(Interstitial Cells of Cajal,ICC)作為胃腸道的起搏細(xì)胞,參與胃腸道的動力學(xué)變化[8,9],在STC 患者結(jié)腸發(fā)現(xiàn)ICC特異性酪氨酸蛋白激酶受體c-kit的顯著降低[10],表明其在STC 發(fā)病機(jī)制中的重要性。水通道蛋白(Aquaporins,AQP)在人體水運輸中發(fā)揮重要作用,AQP3 在結(jié)腸粘膜上皮表達(dá),已經(jīng)成為便秘治療的一個新靶點[11]。越來越多研究表明益生菌定植于腸道,通過調(diào)節(jié)腸道免疫來穩(wěn)定腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[12-14]。
本研究通過使用鹽酸洛哌丁胺造模便秘小鼠模型,探索復(fù)合乳桿菌對胃腸道功能的作用,同時通過檢測胃腸調(diào)節(jié)肽、AQP3、c-kit、細(xì)胞因子等指標(biāo)對復(fù)合乳桿菌的作用機(jī)制進(jìn)行探索,為治療STC 的產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供支持。
SPF 級BALB/c 雄性小鼠,6 周齡,購自北京維通利華公司,在江南大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng),許可證號:SYXK(蘇)2021-0056,實驗方案通過江南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(JN.No20190930b0501220);復(fù)合乳桿菌(鼠李糖乳桿菌LrGG-100:長雙岐桿菌BL-11:嗜酸乳桿菌LA-99:干酪乳桿菌LC-88=4:2:1:1),仙樂健康科技股份有限公司;易蒙停鹽酸洛哌丁胺(每粒2 mg),西安楊森制藥;活性炭及引物合成,生工生物;小鼠P 物質(zhì)(Substance P,SP)、胃動素(Motilin,MTL)、胃泌素(Gastrin,Gas)、血管活性腸肽(Vasoactive Intestinal Peptide,VIP)、生長抑素(Somatostatin,SS)、內(nèi)皮素(Endothelin 1,ET-1)、D-乳酸、緊密連接蛋白(Occludin)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、干 擾 素-γ(Interferonγ,IFN-γ)、白介素2(Interleukin 2,IL-2)、白介素4(Interleukin 4,IL-4)、白介素6(Interleukin 6,IL-6)、白介素10(interleukin 10,IL-10)、白介素12(Interluekin 12,IL-12)、白介素17(Interleukin,IL-17)和抗體(sIgA)酶聯(lián)免疫試劑盒,南京森貝伽生物;阿拉伯樹膠粉,國藥試劑。
PB300-N 電子天平,梅特勒-托利多;Multiscan Go多功能酶標(biāo)儀,賽默飛公司;CFX384 Real Time PCR System,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司。
1.2.1 樣品配制
使用生理鹽水稀釋動物歧岐桿菌BB-12成菌懸液2.5×109CFU/mL(陽性對照),稀釋成復(fù)合乳桿菌重懸液2.5×109CFU/mL(低劑量)和2.5×1010CFU/mL(高劑量)。
墨汁配制:阿拉伯膠、水和活性炭按比例2:2:1混合煮沸,冷藏保存。
鹽酸洛哌丁胺懸液:使用生理鹽水重懸鹽酸洛哌丁胺。
1.2.2 動物模型建立與分組
小鼠飼養(yǎng)在(23±2)℃,相對濕度50%±10%環(huán)境中,12 h 明暗交替節(jié)律,實驗期間,飲水進(jìn)食自由。
適應(yīng)培養(yǎng)一周后,將小鼠隨機(jī)分成5 組,每組10只:健康組、便秘組、陽性組、復(fù)合乳桿菌低劑量組、復(fù)合乳桿菌高劑量組。便秘組灌胃生理鹽水,陽性、低、高劑量組灌胃菌懸液,持續(xù)7 d,第8 天開始根據(jù)小鼠體重按量灌胃鹽酸洛哌丁胺懸液,灌胃劑量10 mg/kg 造模,以顯著延長的首粒黑便排除時間為造模成功依據(jù),造模后,陽性、低、高劑量組按0.2 mL BB-12、復(fù)合乳桿菌低、高劑量懸液進(jìn)行灌胃,每天1次,持續(xù)7 d,健康組全程灌胃生理鹽水。
1.2.3 小鼠首粒黑便時間、黑便粒數(shù)、黑便質(zhì)量及小腸推進(jìn)率的測定
灌胃至第21 天,健康組灌胃生理鹽水0.2 mL、其余組均根據(jù)小鼠體重按量給予0.2 mL 生理鹽水重懸的鹽酸洛哌丁胺懸液(劑量10 mg/kg),1 h 后,開始灌胃墨汁,記錄小鼠首粒黑便排出時間、6 h 內(nèi)黑便排出粒數(shù)和黑便總質(zhì)量。
禁食24 h,第22 天,給予健康組生理鹽水0.2 mL灌胃,同時其余組根據(jù)小鼠體重按量給予0.2 mL 生理鹽水重懸鹽酸洛哌丁胺懸液(劑量10 mg/kg)灌胃,30 min 后,健康組和便秘組灌胃墨汁,其余組給與含對應(yīng)內(nèi)容物的等量墨汁。30 min 后,脫頸小鼠,取整個腸管,測小腸和墨汁推進(jìn)長度,計算小腸推進(jìn)率:
式中:
I——小腸推進(jìn)率,%;
A——墨汁推進(jìn)長度,cm;
A0——小腸總長度,cm。
1.2.4 細(xì)胞因子及胃腸調(diào)節(jié)肽檢測
采血前禁食不禁水12 h,采用異氟烷對小鼠進(jìn)行麻醉,眼眶取血,收集小鼠血液,3 000g離心15 min后收集上清,使用對應(yīng)ELISA 試劑盒小鼠血清中細(xì)胞因子及胃腸調(diào)節(jié)肽(SP、MTL、Gas、VIP、SS、ET-1)含量,具體步驟參考試劑盒說明書。
1.2.5 小鼠結(jié)腸組織AQP3 和c-kit 基因表達(dá)水平檢測
取結(jié)腸組織,Trizol 法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative real-time polymerase china extraction,qRT-PCR)來測定相關(guān)蛋白的表達(dá)量。由生工生物工程有限公司合成AQP3(AF104417)、c-kit(NM_021099)、actin(AY618199)引物序列,如表1 所示。以cDNA 為模板,反應(yīng)體系10 μL,反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共38 個循環(huán),以actin基因為內(nèi)參,采用2-△△Ct 法分析數(shù)據(jù),健康組的數(shù)值為1,結(jié)果由CFX96 Manager軟件分析。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 進(jìn)行顯著性分析,GraphPad prism 8 作圖,采用one-way ANOVA 多重比較組間差異,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。
小腸運動形式主要有三種,緊張性收縮、分節(jié)運動和蠕動[15],蠕動的作用是推進(jìn)腸內(nèi)容物,通過洛哌丁胺抑制小腸蠕動,造模便秘小鼠。通過測定小腸推進(jìn)率、首粒黑便時間、6 h 排便粒數(shù)和糞便質(zhì)量,對小鼠胃腸道功能進(jìn)行評價。
如圖1 所示,便秘組在小腸推進(jìn)率(圖1a)、首粒黑便時間(圖1b)、黑便粒數(shù)(圖1c)和黑便質(zhì)量(圖1d)與健康組差異顯著(p<0.05),表明洛哌丁胺造模便秘小鼠模型成功。與便秘組相比,復(fù)合乳桿菌能夠顯著改善便秘小鼠胃腸道功能(p<0.05),表現(xiàn)為復(fù)合乳桿菌低、高劑量組的小腸推進(jìn)率顯著提高61.45%(p<0.05)、1.22 倍(p<0.05),排便時間縮短21.42%(p<0.05)、29.14%(p<0.05),排便數(shù)量增加1.50 倍(p<0.05)、1.52 倍(p<0.05),排便質(zhì)量增加1.13 倍(p<0.05)、1.25 倍(p<0.05),同時復(fù)合乳桿菌與陽性組效果無顯著差異(p>0.05)。這表明復(fù)合乳桿菌具有促進(jìn)小鼠胃腸道功能,緩解便秘的功效。王琳琳[16]研究了雙歧桿菌對便秘小鼠的改善作用,結(jié)果和本研究一致。
圖1 復(fù)合乳桿菌對洛哌丁胺引起的便秘小鼠腸道排泄影響Fig.1 Effects of compound lactobacillus on excretion in loperamide induced constipation mouse model
腸道疾病通常會引起腸道免疫應(yīng)答,研究中發(fā)現(xiàn),益生菌有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能,CD4+輔助T 細(xì)胞(Thelpercells,Th)可分為Th1、Th2、Th17 和Treg 細(xì)胞[17],Th1 分泌細(xì)胞因子IL-2(圖2a)、TNF-α(圖2g)和IFN-γ(圖2h)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化,參與細(xì)胞免疫功能;Th2 分泌IL-4(圖2b)、IL-6(圖2c)和IL-10(圖2d)介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞活化,調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答,IL-12 和IL-4 分別參與誘導(dǎo)Th1 和Th2 的極化,Th1/Th2 的平衡對于維護(hù)機(jī)體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Th17 分泌IL-17(圖2f),Treg 分泌IL-10(圖2d),炎癥發(fā)生過程中,導(dǎo)致大量Treg 轉(zhuǎn)化成Th17[18],而胃腸道是Th17 主要的控制部位[19],Th17/Treg 的平衡對于腸道穩(wěn)態(tài)的維持很重要。如圖2 中各細(xì)胞因子的分泌所示,便秘組相比健康組的各細(xì)胞因子出現(xiàn)下降,其中IL-6和IL-10 質(zhì)量濃度顯著下降(p<0.05),其余細(xì)胞因子分析無顯著性(p>0.05),給予便秘小鼠復(fù)合乳桿菌后,會提高細(xì)胞因子分泌水平,各組間分析無差異(p>0.05)。這表明復(fù)合乳桿菌可能有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子趨于穩(wěn)定水平,維持Th1/Th2、Th17/Treg 平衡的能力。
緊密連接蛋白和D-乳酸在腸道屏障中起重要作用[20],sIgA 是腸道粘膜免疫的關(guān)鍵性指標(biāo)[21]。便秘組相比健康組在緊密連接蛋白(圖2j)和D-乳酸(圖2k)質(zhì)量濃度有所下降,差異不顯著(p>0.05);sIgA 的含量(圖2i)在各組中未發(fā)現(xiàn)明顯改變(p>0.05),表明腸屏障未受到明顯損傷。
圖2 復(fù)合乳桿菌對洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of compound lactobacillus on serum indicators in a loperamide induced constipation mouse model
腸道微生物群和免疫穩(wěn)態(tài)之間關(guān)聯(lián)密切,這是因為腸道微生物對免疫系統(tǒng)的發(fā)育、細(xì)胞因子和趨化因子的分泌至關(guān)重要,腸道微生物能夠激活腸道粘膜免疫系統(tǒng),促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖分化,激活巨噬細(xì)胞和陷光細(xì)胞因子分泌,然而關(guān)于炎癥調(diào)節(jié)細(xì)胞因子對于便秘的影響始終存在爭論。Marjan 等[22]發(fā)現(xiàn)血清細(xì)胞因子水平與年齡相關(guān)性便秘之間存在顯著關(guān)聯(lián),降低Th1/Th2 比率,提高促炎性細(xì)胞因子IL-6 和TNF-α質(zhì)量濃度,而在Jin 等[23]的研究中發(fā)現(xiàn),血清細(xì)胞因子IL-10/IL-12 和TNF-α并未發(fā)生顯著變化。腸道穩(wěn)態(tài)離不開腸道上皮、細(xì)胞因子和微生物菌群之間復(fù)雜的相互作用,從總體變化水平可以看出復(fù)合乳桿菌具有平衡細(xì)胞因子趨于健康組的作用。
水通道蛋白AQP3 在水代謝和腸道通透性中起重要作用[24],ICC 能夠促進(jìn)腸道蠕動[25],c-kit 在ICC 發(fā)育過程中具有重要作用,研究中常用c-kit 表達(dá)水平反映ICC 細(xì)胞數(shù)量。如圖3 所示,復(fù)合乳桿菌灌胃便秘小鼠后,能夠顯著促進(jìn)AQP3 和c-kit 的轉(zhuǎn)錄(p<0.05),表現(xiàn)為高劑量組的AQP3 和c-kit 基因轉(zhuǎn)錄水平分別是便秘組的1.82 倍(p<0.05)和2.00 倍(p<0.05),且低、高劑量組、陽性組與健康組之間均無差異(p>0.05)。
圖3 復(fù)合乳桿菌對AQP3 和c-kit 基因表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of compound lactobacillus on expression of AQP3 and c-kit in mice colon
水通道蛋白的異常會影響結(jié)腸水代謝和腸道通透性,與STC 的發(fā)病緊密相關(guān)[26],本研究發(fā)現(xiàn)便秘組小鼠的AQP3 轉(zhuǎn)錄水平顯著下降,給予復(fù)合乳桿菌后,AQP3 轉(zhuǎn)錄水平顯著提高,小鼠排便質(zhì)量上升(圖1d),這表明服用復(fù)合乳桿菌后,能夠改善水分重吸收,從而提高糞便含水量,改善便秘,結(jié)果和Yu 等[27]的研究一致。STC 患者的結(jié)腸ICC 數(shù)量明顯低于正常[28],c-kit 作為其特異性指標(biāo)能夠一定程度上反應(yīng)ICC 數(shù)量,復(fù)合乳桿菌能夠提高c-kit 的轉(zhuǎn)錄水平,表明灌胃便秘小鼠復(fù)合乳桿菌后,小鼠腸道ICC數(shù)量得到提升,從而促進(jìn)了腸道蠕動。
胃腸調(diào)節(jié)肽分為以SP、MTL 和Gas 為代表的興奮性遞質(zhì),以VIP、SS 和ET-1 為代表的抑制性遞質(zhì)[29],如圖4 所示,洛哌丁胺造模便秘后,促進(jìn)型遞質(zhì)SP(圖4a)、MTL(圖4b)和Gas(圖4c)質(zhì)量濃度顯著下降(p<0.05),而給予復(fù)合乳桿菌高劑量治療后,能夠顯著提高SP 和MTL 質(zhì)量濃度(p<0.05),效果與陽性組一致,Gas 質(zhì)量濃度治療后略有提高,但不顯著(p>0.05)。抑制型遞質(zhì)VIP(圖4d)、SS(圖4e)和ET-1(圖4f)在便秘組中質(zhì)量濃度最高,顯著高于其余組別(p<0.05),在復(fù)合乳桿菌治療后,VIP、SS 和ET-1 顯著下降(p<0.05)。結(jié)果表明復(fù)合乳桿菌對小鼠慢傳輸型便秘可能通過提高SP 和MTL,抑制VIP、SS 和ET-1 來實現(xiàn)的。
圖4 復(fù)合乳桿菌對洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清中胃腸調(diào)節(jié)肽的影響Fig.4 Effects of compound lactobacillus on gastrointestinal hormones in serum samples of loperamide induced constipation mouse model
ENS 中存在復(fù)雜的生化信號通路,胃腸調(diào)節(jié)肽作為生化信號傳導(dǎo)的重要遞質(zhì),參與通路的組成,承擔(dān)著信號傳遞功能。研究表明,便秘患者的興奮性遞質(zhì)表達(dá)減少,抑制性遞質(zhì)表達(dá)增加,導(dǎo)致腸道動態(tài)平衡被打破,腸道運動收到抑制[29-31]。MTL 促進(jìn)胃腸道運動,Gas 與胃酸分泌,加速胃排空有關(guān),SP 促進(jìn)胃腸道平滑肌收縮,刺激結(jié)腸粘膜分泌水和電解質(zhì),促進(jìn)腸道蠕動;而VIP 的功能是放松胃腸道括約肌,從而導(dǎo)致腸道轉(zhuǎn)運速率減緩,ET-1 維持血管張力,調(diào)節(jié)腸道功能,SS 放松平滑肌,減緩胃排空速度。本研究發(fā)現(xiàn)便秘小鼠的興奮性遞質(zhì)SP 和MTL 相比健康組顯著下降,抑制性遞質(zhì)VIP、SS 和ET-1 顯著上升,給予復(fù)合乳桿菌后,能夠恢復(fù)平衡,從而改善便秘癥狀。
本研究通過對小鼠胃腸道功能進(jìn)行評價,發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳桿菌能夠顯著促進(jìn)腸道蠕動,提高推進(jìn)率,改善排泄功能。通過初步探索復(fù)合乳桿菌改善便秘的機(jī)制發(fā)現(xiàn),復(fù)合乳桿菌并未影響腸道免疫,而是可能通過調(diào)控水通道蛋白AQP3 和c-kit 的表達(dá),來控制腸道水轉(zhuǎn)運和腸道蠕動,同時調(diào)節(jié)胃腸調(diào)節(jié)肽來影響腸道神經(jīng)系統(tǒng)。該研究為開發(fā)相關(guān)功能性食品奠定了理論基礎(chǔ)。